一种基于RT-RPA和CRISPR/Cas12a的坦布苏病毒核酸检测组合物、试剂盒及检测方法

ttattatt-bhq1-3’，或者，所述检测探针为把探针3’端bhq1基团替换为biotin基团后获得的探针。
9.进一步的，所述rt-rpa恒温扩增体系还包括rehydration buffer、rnase inhibitor、模板rna、rnase free water和乙酸镁。
10.进一步的，所述crispr/cas12a检测体系还包括rnase inhibitor、rt-rpa扩增产物和rnase free water。
11.(二)本发明还提供以上所述的基于rt-rpa和crispr/cas12a的坦布苏病毒核酸检测组合物用于非疾病诊断的检测坦布苏病毒的方法，包括以下步骤：
12.步骤1)：提取待检样品的rna；
13.步骤2)：利用rt-rpa恒温扩增体系的引物对步骤1)中提取的病毒rna反转录后进行恒温扩增，获得目标片段；
14.步骤3)：将步骤2)获得的rt-rpa扩增产物加入至crispr/cas12a检测体系中，恒温反应，将产物进行荧光检测或者在蓝光或凝胶成像系统下直接观察显色反应。
15.(三)本发明还提供了以上所述的基于rt-rpa和crispr/cas12a的坦布苏病毒核酸检测组合物的坦布苏病毒核酸检测试剂盒。
16.进一步的，所述坦布苏病毒核酸检测试剂盒包括等体积的rt-rpa恒温扩增体系和crispr/cas12a检测体系；每20μl rt-rpa恒温扩增体系包括：10μm引物ns1-f 1μl、10μm引物ns1-r 1μl、rehydration buffer 11.8μl、20u/μlrnase inhibitor 0.2μl、模板rna 1μl、rnase free water 4μl、280mm乙酸镁1μl；每20μlcrispr/cas12a检测体系包括：10
×
buffer 2μl、450nm lbcas12a 2μl、450nm ns1-crrna1 1μl、2μm ssdna荧光探针2μl、20u/μl rnase inhibitor0.25μl、rt-rpa扩增产物1μl、rnase free water 11.75μl。
17.本发明的有益效果是：
18.(1)本发明基于rt-rpa和crispr/cas12a检测体系，实现了对坦布苏病毒核酸的快速检测，构建的方法具有良好的特异性和极高的灵敏度，能够检测到单个核酸分子；
19.(2)本发明的rt-rpa和crispr/cas12a坦布苏病毒核酸检测系统在37℃恒温环境下即可反应，检测结果可通过荧光检测或者在蓝光下观察显色反应进行判读；同时，也可将检测体系中的荧光探针替换，开发成试纸条，肉眼直接判断结果。因此，本发明可不依赖实验室大型的仪器设备，进行现场的快速检测，方便快捷，非常有利于临场和基层的应用和普及；
20.(3)本发明提供的检测体系为坦布苏病毒的快速诊断和实时监测提供了可靠的技术手段，对坦布苏病毒病的防治具有重要意义。
附图说明
21.图1是实施例4基于rt-rpa和crispr/cas12a的坦布苏病毒核酸检测方法特异性结果；
22.图2是实施例5基于rt-rpa和crispr/cas12a的坦布苏病毒核酸检测方法灵敏度结果。
具体实施方式
23.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有说明，实施例中采用的实验方法、试剂和设备均为本技术领域的常规方法、试剂和设备。
24.实施例1
25.靶向坦布苏病毒的特异性crrna和特异性rt-rpa引物对的设计。
26.在坦布苏病毒ns1基因区域寻找casl2a蛋白的pam序列，即5
’‑
tttn-3’序列，选取其后20nt作为crrna向导序列，在向导序列前加上与casl2a蛋白结合的锚定支架序列形成特异性crrna序列。按照该方法设计了若干crrna序列，经过筛选，最终确定的crrna序列如表1所示。根据crrna序列，设计rt-rpa上下游引物，引物序列如表2所示。本实施例设计的crrna序列和rt-rpa引物序列由金斯瑞生物科技股份有限公司合成。
27.表1-靶向坦布苏病毒ns1基因的crrna序列
28.编号序列名称核酸序列(5
’‑3’
)no.3ns1-crrna1uaauuucuacuaaguagauuacaaaaaguggaugcugg
29.表2-坦布苏病毒ns1基因rt-rpa特异性扩增引物
30.编号引物名称核酸序列(5
’‑3’
)no.1ns1-fcgaggacaggatacaaggttcagagttccgno.2ns1-ratttgatcaacatgtcgtctccgtgtgcag
31.实施例2
32.基于rt-rpa和crispr/cas12a的坦布苏病毒核酸检测组合物。
33.本实施例提供一种基于rt-rpa和crispr/cas12a的坦布苏病毒核酸检测组合物，包括rt-rpa恒温扩增体系和crispr/cas12a检测体系，其中，rt-rpa恒温扩增体系(20μl)如表3所示，crispr/cas12a检测体系(20μl)如表4所示。
34.表3-rt-rpa恒温扩增体系
35.组分体积(μl)ns1-f(10μm)1ns1-r(10μm)1rehydration buffer11.8rnase inhibitor(20u/μl)0.2模板rna1rnase free water4乙酸镁(280mm)1
36.其中，rehydration buffer、rnase inhibitor、rnase free water及乙酸镁(mgac)来自basic rt-rpa试剂盒。
37.表4-crispr/cas12a检测体系
38.组分体积(μl)10
×
buffer2lbcas12a(450nm)2ns1-crrna1(450nm)1ssdna荧光探针(2μm)2rnase inhibitor(20u/μl)0.25rt-rpa扩增产物1rnase free water11.75
39.其中，ssdna荧光探针为5
’‑
fam-ttattatt-bhq1-3’，也可以把探针3’端bhq1基团替换为biotin基团，开发成试纸条产品。
40.实施例3
41.本实施例提供基于rt-rpa和crispr/cas12a的坦布苏病毒核酸检测方法。
42.3.1、核酸提取
43.利用axyprep
tm body fluid viral dna/rna miniprep kit，参照说明书上的操作步骤，提取待检样品病毒rna。
44.3.2、rt-rpa扩增靶基因
45.利用本发明中rt-rpa特异性扩增引物对ns1-f(seq no.1)和ns1-r(seqno.2)，按照实施例2表3所示rt-rpa恒温扩增体系依次入各组分并充分混匀，37℃反应30min。其中，阴性对照组的模板rna用灭菌双蒸水代替。
46.3.3、crispr/cas12a检测
47.按照实施例2表4所示配制crispr/cas12a检测反应体系，取3.2中rt-rpa扩增产物1μl添加到检测体系。配制好的反应体系放入荧光定量pcr仪，37℃反应30min，动态收集荧光信号。
48.3.4、结果判断
49.将阴性对照平均值加三倍标准差的荧光值作为区分阳性信号和背景信号的临界值，即荧光阈值；荧光值显著高于阈值的样品即可判定为坦布苏病毒阳性。
50.实施例4
51.基于rt-rpa和crispr/cas12a的坦布苏病毒核酸检测方法的特异性检验。
52.利用axyprep
tm body fluid viral dna/rna miniprep kit提取本实验室保存的h9亚型禽流感病毒(aiv-h9)、1型鸭甲型肝炎病毒(dhav-1)、3型鸭甲型肝炎病毒(dhav-3)、番鸭细小病毒(mdpv)、新型呼肠股病毒(ndrv)、鸭瘟病毒(dpv)以及坦布苏病毒(tmuv)的基因组核酸。按照实施例3建立的检测方法，以上述病毒核酸为模板进行rt-rpa恒温扩增并应用crispr/cas12a检测反应体系和程序进行检测，同时设置阴性对照，评估该方法的特异性。
53.检测结果如图1所示，其它鸭常见的易感病毒样品aiv-h9、dhav-1、dhav-3、mdpv、ndrv及dpv的荧光值与阴性对照无显著差异，而tmuv样品的荧光值显著高于阴性对照，表明所构建的基于rt-rpa和crispr/cas12a的坦布苏病毒核酸检测方法具有良好的特异性。
54.实施例5
55.基于rt-rpa和crispr/cas12a的坦布苏病毒核酸检测方法的灵敏性检验。
56.将已知tmuv拷贝数的样品进行10倍系列的倍比稀释，浓度分别为100copies/μl、101copies/μl、102copies/μl、103copies/μl、104copies/μl及105copies/μl。以梯度稀释的样品为模板，按照实施例3建立的方法进行扩增和检测，同时设置阴性对照，评估该方法的灵敏性。
57.检测结果如图2所示，梯度稀释样品的荧光值均显著高于阴性对照，最低检测限可达100copies/μl，表明所构建的基于rt-rpa和crispr/cas12a的坦布苏病毒核酸检测方法具有很高的灵敏性。
58.实施例6
59.基于rt-rpa和crispr/cas12a的坦布苏病毒核酸检测方法的临床样品检验。
60.从江苏部分鸭场采集了35份疑似发病鸭的脾脏组织，采用本发明实施例3建立的基于rt-rpa和crispr/cas12a的坦布苏病毒核酸检测方法和本发明人实验室建立的坦布苏病毒一步法sybr green实时定量rt-pcr方法同时进行检测，并设立阴性对照。
61.检测结果如表5所示，两种方法的阴性对照皆成立且检测结果一致，即35份临床样品中13份为阴性，22份为阳性，表明基于rt-rpa和crispr/cas12a的坦布苏病毒核酸检测方法能够应用于临床样品的检测。
62.表5-一步法rt-qpcr和rt-rpa-crispr/cas12a临床样品检测结果
[0063][0064]
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种基于rt-rpa和crispr/cas12a的坦布苏病毒核酸检测组合物，其特征在于，包括rt-rpa恒温扩增体系和crispr/cas12a检测体系；所述rt-rpa恒温扩增体系包括针对坦布苏病毒ns1基因的特异性恒温扩增引物ns1-f和ns1-r；其中，引物ns1-f核苷酸序列如seq id no.1所示；引物ns1-r核苷酸序列如seq id no.2所示；所述crispr/cas12a检测体系包括靶向坦布苏病毒ns1基因的特异性crrna、crispr/cas12a蛋白和检测探针，所述特异性crrna为ns1-crrna1，其核苷酸序列如seq id no.3所示。2.根据权利要求1所述的基于rt-rpa和crispr/cas12a的坦布苏病毒核酸检测组合物，其特征在于，所述检测探针为ssdna荧光探针，所述荧光探针的序列为5
’‑
fam-ttattatt-bhq1-3’，或者，所述检测探针为把探针3’端bhq1基团替换为biotin基团后获得的探针。3.根据权利要求1所述的基于rt-rpa和crispr/cas12a的坦布苏病毒核酸检测组合物，其特征在于，所述rt-rpa恒温扩增体系还包括rehydration buffer、rnase inhibitor、模板rna、rnase free water和乙酸镁。4.根据权利要求1所述的基于rt-rpa和crispr/cas12a的坦布苏病毒核酸检测组合物，其特征在于，所述crispr/cas12a检测体系还包括rnase inhibitor、rt-rpa扩增产物和rnase free water。5.权利要求1～4任意一项所述的基于rt-rpa和crispr/cas12a的坦布苏病毒核酸检测组合物用于非疾病诊断的检测坦布苏病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)：提取待检样品的rna；步骤2)：利用rt-rpa恒温扩增体系的引物对步骤1)中提取的病毒rna反转录后进行恒温扩增，获得目标片段；步骤3)：将步骤2)获得的rt-rpa扩增产物加入至crispr/cas12a检测体系中，恒温反应，将产物进行荧光检测或者在蓝光或凝胶成像系统下观察显色反应。6.一种采用权利要求1～4任意一项所述的基于rt-rpa和crispr/cas12a的坦布苏病毒核酸检测组合物的坦布苏病毒核酸检测试剂盒。7.根据权利要求6所述的坦布苏病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述坦布苏病毒核酸检测试剂盒包括等体积的rt-rpa恒温扩增体系和crispr/cas12a检测体系；每20μl rt-rpa恒温扩增体系包括：10μm引物ns1-f 1μl、10μm引物ns1-r 1μl、rehydration buffer 11.8μl、20u/μl rnase inhibitor 0.2μl、模板rna 1μl、rnase free water 4μl、280mm乙酸镁1μl；每20μlcrispr/cas12a检测体系包括：10
×
buffer 2μl、450nm lbcas 12a 2μl、450nm ns1-crrna1 1μl、2μm ssdna荧光探针2μl、20u/μl rnase inhibitor 0.25μl、rt-rpa扩增产物1μl、rnase free water 11.75μl。

技术总结
本发明提供一种基于RT-RPA和CRISPR/Cas12a的坦布苏病毒核酸检测组合物、试剂盒及检测方法，所述坦布苏病毒核酸检测组合物包括RT-RPA恒温扩增体系和CRISPR/Cas12a检测体系；所述RT-RPA恒温扩增体系包括针对坦布苏病毒的RT-RPA扩增引物；所述CRISPR/Cas12a检测体系包括靶向坦布苏病毒的特异性CrRNA、CRISPR/Cas12a蛋白和检测探针。本发明首次基于RT-RPA和CRISPR/Cas12a系统检测坦布苏病毒核酸，具有特异性强、灵敏度高、简单快速、不依赖复杂大型仪器等优点，利于基层普及应用。利于基层普及应用。


技术研发人员：章丽娇 吴凤瑶 刘青涛 赵冬敏 韩凯凯 黄欣梅 杨婧 卢凤英 刘宇卓 李银 张小飞
受保护的技术使用者：江苏省农业科学院
技术研发日：2023.08.30
技术公布日：2023/10/19