芝麻素在制备治疗食物过敏产品上的应用

1.本发明属于生物制药技术领域，具体涉及芝麻素在制备治疗食物过敏产品上的应用。


背景技术：

2.食物过敏(food allergy,fa)是一种因免疫系统对食物致敏原的错误识别引发的免疫排斥反应，影响食物过敏发展的因素有很多，包括环境因素、生活习惯因素和饮食因素等。随着经济社会的发展和生活方式的现代化，食物过敏的患病人数持续增多。迄今为止仍缺乏有效的食物过敏治疗药物，探寻缓解食物过敏症状的天然活性物质成为近期免疫学和生物学研究的热点之一。由于传统抗过敏药物对肝肾具有较强的毒性，长期服用会对神经系统和消化系统产生明显的副作用。因此开发一种对食物过敏反应具有显著抑制效果的天然来源药物/产品势在必行。鉴于此，特提出此发明。
3.多酚是植物的次生代谢产物，对人体健康具有众多潜在益处，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，在维持人体健康、调节免疫平衡方面具有巨大潜力；近期研究发现多酚在调节免疫系统失衡，缓解炎症损伤等方面展现出优秀的功效。
4.芝麻素，外文名sesamin，分子式是c
20h18
o6，cas编号：607-80-7，是一种来源于芝麻籽的木脂素。芝麻素的脂溶性很高，口服容易吸收，显现出优秀的免疫调节和抗氧化效果，但是，对于芝麻素缓解食物过敏的具体效果，目前尚无相关的研究。芝麻素经小肠吸收后经肝脏代谢后随血液运送至全身，最后经尿液和粪便排出。


技术实现要素：

5.针对现阶段治疗食物过敏的药物存在的问题，本发明提供一种治疗食物过敏的药物。
6.本发明的技术方案如下：
7.芝麻素在制备治疗食物过敏药品上的应用，所述的芝麻素的结构式如式ⅰ所示：
[0008][0009]
式ⅰ。
[0010]
优选地，药品中含有效剂量1wt.％-99wt.％的芝麻素。
[0011]
本发明的另一目的，保护芝麻素在制备治疗食物过敏食品上的应用。
[0012]
优选地，食品中含有效剂量1wt.％-99wt.％的芝麻素。
[0013]
本发明的另一目的，保护芝麻素在制备治疗食物过敏保健品上的应用。
[0014]
优选地，保健品中含有效剂量1wt.％-99wt.％的芝麻素。
[0015]
本发明的有益效果：
[0016]
(1)本发明研究发现芝麻素(5-80μm)对ige抗体和hsa抗原联合诱导的肥大细胞脱
颗粒反应具有显著的抑制效果，使肥大细胞脱颗粒程度降低，抑制β-氨基己糖苷酶和组胺的胞外释放，具有缓解由肥大细胞介导的过敏反应的活性。
[0017]
(2)本发明研究发现口服芝麻素(10、20、40mg/kg)对ige抗体、hsa抗原和伊文思蓝建模的小鼠被动皮肤过敏反应具有显著的抑制效果，抑制小鼠耳朵中因过敏引发的血管通透性增加、组织水肿增厚和血管内染料外渗，具有缓解急性过敏反应的活性。
[0018]
(3)本发明研究发现口服芝麻素(10、20、40mg/kg)对卵清蛋白和氢氧化铝佐剂建模的小鼠主动系统性食物过敏反应具有显著的抑制效果。芝麻素缓解小鼠食物过敏症状、调节免疫th细胞分化平衡、降低血浆中炎症和过敏因子水平，抑制脾脏中过敏相关fcεri信号通路的磷酸化水平，具有缓解食物过敏反应的能力。
附图说明
[0019]
图1：芝麻素对rbl-2h3细胞脱颗粒反应的抑制效果；其中(a)芝麻素处理12小时后细胞的相对活力；(b)组胺释放含量；(c)β-氨基己糖苷酶的释放率和(d)抑制率；
[0020]
图2：芝麻素对小鼠被动皮肤过敏反应的抑制效果：耳朵中染料渗漏情况的代表性图像；
[0021]
图3：芝麻素对小鼠被动皮肤过敏反应的抑制效果：小鼠耳朵h&e染色(200
×
)；
[0022]
图4：芝麻素对小鼠被动皮肤过敏反应的抑制效果：小鼠耳朵甲苯胺蓝染色(200
×
)；
[0023]
图5：芝麻素对小鼠被动皮肤过敏反应的抑制效果：(a)耳朵厚度测量；(b)耳朵浸提液中伊文斯蓝含量。
[0024]
图6：芝麻素对小鼠食物过敏临床症状的缓解效果；其中(a)建模过程中小鼠的体重变化；(b)建模过程中小鼠的体温变化；(c)过敏临床评分评估；(d)小鼠脾脏/体重指数；(e)各组小鼠脾脏的代表性图像。
[0025]
图7：芝麻素对由小鼠因食物过敏引起的炎症和过敏因子水平的抑制效果；其中(a)ova特异性ige、(b)ova特异性igg1、(c)组胺、(d)白细胞介素-4(il-4)、(e)粘膜肥大细胞蛋白酶-1(mmcp-1)。
[0026]
图8：芝麻素对由小鼠因食物过敏引起的th细胞分化情况的调整效果；通过qrt-pcr检测脾脏th细胞分化失衡的mrna表达水平：(a)gata-3、(b)t-bet、(c)rorγt和(d)foxp3。
[0027]
图9：芝麻素对由小鼠因食物过敏引起的fcεri信号通路磷酸化水平的抑制效果；通过抑制asa反应引起的脾脏中syk及其下游信号蛋白(erk、p38、p65)的磷酸化水平：(a)wb代表性免疫印迹图像；(b)p-syk/syk；(c)p-erk/erk；(d)p-p38/p38；(e)p-p65/p65的相对表达量密度比。
具体实施方式
[0028]
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合实施例详细说明本发明的构思及技术方案进行完整且清楚的表述。所述实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下获得的其他实施例，均属于本发明的保护范围。
[0029]
实施例1：芝麻素对rbl-2h3细胞毒性和脱颗粒的影响
[0030]
1.1rbl-2h3细胞培养条件
[0031]
本实验构建了anti-dnp-ige-/dnp-hsa诱导的ⅰ型过敏肥大细胞脱颗粒模型。使用胰酶消化处于指数生长期的rbl-2h3细胞，配备成单细胞悬液，使用细胞计数板进行计数。调节细胞数至2.5
×
105个/ml并接种至平底24孔板中，每孔接种500μl。在接种过程中吹打混匀细胞悬液，保持每孔接种的细胞数大致相同。接种后置于恒温培养箱中于37℃5％ co2条件下培养12小时，观察细胞贴壁正常生长后吸走培养基。贴壁正常生长的细胞被分为阳性对照组、空白组和芝麻素试验组
[0032]
1.2mtt法测定不同浓度芝麻素对细胞活力的影响
[0033]
使用mtt测定细胞的活性是一种常用的方法。噻唑蓝(mtt)能够被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为不溶于水的蓝紫色甲臜(formazan)并沉积在细胞中。经二甲基亚砜(dmso)溶解后。通过酶标仪测定吸光值，计算出活细胞比例。由于甲臜的生成量与活细胞数量成正比，所以可以通过甲臜的生成量反映活细胞的数量，在本实验中可研究不同浓度目标多酚对rbl-2h3细胞的毒性剂量关系。
[0034]
实验结果：当芝麻素浓度小于等于60μm时，各芝麻素处理组之间的细胞活力没有显著差异(图1a)。当浓度超过80μm时，细胞活力下降至87.08％但因细胞活力大于70％，仍可视该药物浓度为无毒。
[0035]
1.3不同浓度芝麻素对rbl-2h3细胞脱颗粒反应的影响
[0036]
对照组和试验组每孔加入500μl含有200ng/ml抗-dnp ige的致敏缓冲液，持续12小时。空白组全称使用等体积的tyrode’s缓冲液处理。随后，试验组分别用500μl含有5、10、20、40和80μm芝麻素的tyrode’s缓冲液处理1小时，而对照组和空白组加入tyrode’s缓冲液。在每个步骤之后，使用tyrode’s缓冲液冲洗细胞。对照组和试验组的细胞加入500μl含500ng/ml的dnp-hsa，并孵育0.5小时以刺激细胞脱颗粒。脱颗粒反应在冰浴上终止10分钟，并收集细胞上清液。然后将裂解液(0.5％triton x-100)加入孔板中处理30分钟，在4℃下以3000rpm(800
×
g)离心10分钟，收集上清液进行测量后分别采用底物显色法和邻苯二甲醛荧光分光光度检测上清液中β-氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase,β-hex)和组胺(histamine)含量。
[0037]
实验结果：与对照组相比，芝麻素处理组的β-hex和组胺释放水平显著降低(图1b-c)。此外，β-hex释放抑制率也显著增加，呈现出剂量依赖性效应(图1d)。在不同的浓度下，40μm芝麻素处理显示出显著的抑制效果增加。这些结果表明，芝麻素能够降低ige抗体/hsa抗原诱导的细胞脱颗粒程度，并抑制组胺等细胞因子的释放。
[0038]
实施例2：芝麻素对ige与hsa诱导的被动皮肤过敏反应的影响
[0039]
我们将适应性培养后的小鼠分为对照组(0.9％生理盐水)、低剂量芝麻素处理组(ld,10mg/kg芝麻素)、中剂量芝麻素处理组(md,20mg/kg芝麻素)和高剂量芝麻素处理组(hd,40mg/kg芝麻素)。每只小鼠左耳注射10μl含有20μganti-dnp-ige的致敏液，右耳注射等体积的生理盐水作为空白对照。致敏12小时后，ld、md、hd组口服不同剂量的芝麻素，对照组口服安慰剂。一小时后尾静脉注射200μl含有250μg dnp-hsa和2％伊文思蓝的激发液。激发1小时后，将小鼠麻醉并牺牲，摘取耳朵并保存在4％多聚甲醛中，在石蜡包埋和切片后进行he染色和甲苯胺蓝染色。用游标卡尺测量小鼠耳朵同厚度，并检测耳朵甲酰胺浸提液在
620nm处的吸光度强度以量化耳朵中的染料含量。
[0040]
实验结果：随着芝麻素剂量的增加，治疗小鼠耳内的斑块面积减少，染料外渗和斑块形成明显减少(图2)。耳部切片h&e染色结果分析表明，芝麻素有效减少耳部肿胀和结缔组织厚度，使组织结构更加有序，减轻结构紊乱(图3)。为了确定肥大细胞的位置和脱颗粒，将切片用甲苯胺蓝染色(图4)。分析结果可知，与空白组相比，对照组的肥大细胞表现出较浅的颜色、模糊的边界和较高水平的脱颗粒。芝麻素干预组组(ld,md,hd)的肥大细胞脱颗粒程度降低，呈剂量依赖性趋势。肥大细胞脱颗粒导致过敏介质的释放，从而导致血管通透性增加和组织水肿。与空白组相比，对照组的耳朵厚度明显增加，但随着芝麻素干预剂量的增加，耳朵厚度显着减小(图5a)。用于测试血管通透性的伊文思蓝染料的光密度值随着芝麻素干预剂量的增加而显着降低(图5b)。这些结果表明，芝麻素可以呈剂量依赖性地缓解急性过敏反应的严重程度。
[0041]
实施例3：芝麻素对ova与氢氧化铝诱导的主动系统性食物过敏反应的影响
[0042]
3.1小鼠主动系统性食物过敏模型建模过程
[0043]
50只小鼠经适应性培养一周后随机被分为5组(n＝10):对照组，低剂量芝麻素处理组(ld,10mg/kg芝麻素)、中剂量芝麻素处理组(md,20mg/kg芝麻素)和高剂量芝麻素处理组(hd,40mg/kg芝麻素)和空白组。在建模的第0、7、14天，对照组和治疗组均腹腔注射含50μg ova的致敏液，空白组腹腔注射等体积的生理盐水。在第21、23、25、27、29天时，ld、md、hd组分别灌胃总量为10、20、40mg/kg的芝麻素，对照组和空白组灌胃等体积安慰剂。1h后对照组和芝麻素处理组再灌胃含50mg ova的激发液，在第32天灌胃含100mg ova的激发液，空白组灌胃等体积安慰剂。在激发后60分钟内，每隔10分钟进行一次肛温测量。建模过程中每隔四天统计各组小鼠体重。第32天灌胃激发液后连续观察60min，结合小鼠的行为、粪便、形貌状态并通过基于症状的评分量表(表1)量化食物过敏症状的严重程度。灌胃激发液1h后，水合氯醛麻醉小鼠取血，血液经3000rpm(800
×
g)10min离心后，吸取上层血浆进行elisa检测。收集脾脏计算脾脏系数并拍照观察，提取脾脏中的mrna与蛋白质，并进行处理以备qrt-pcr与western blot实验分析。
[0044]
表1小鼠临床过敏症状评分量表
[0045][0046]
实验结果：与空白组相比，对照组小鼠在乱清蛋白激发后呈现出体重下降、肛温下降、临床评分升高和脾脏-体重比升高等症状。分析结果可知，芝麻素给药有效减轻了体重趋势所反映的过敏性损伤(图6a)；芝麻素给药可有效缓解因过敏引起的体温降低(失温)和温度波动(图6b)；芝麻素给药有效改善小鼠形貌状态和粪便形态，缓解因食物过敏引起的临床症状(图6c)；芝麻素给药有效改善小鼠脾脏的形态和脾脏/体重指数(图6d)。
[0047]
3.2elisa法检测食物过敏小鼠血清中的过敏因子含量
[0048]
ova-specific-ige(bpe20761)、ova-specific-igg1(bpe20928)、mmcp-1(bpe20157)、il-4(bpe20011)和组胺(bpe20452)elisa试剂盒购自朗顿生物科技公司(中国上海)。按照商品化试剂盒说明书，测定asa小鼠血浆中过敏因子水平。使用spectramax m5酶标仪测量450nm处的吸光度。利用标准品的吸光度值绘制浓度-吸光度标准曲线，将样品代入标准曲线计算过敏因子含量。
[0049]
实验结果：分析图7可知，与空白组相比，对照组ova特异性ige、ova特异性igg1、组胺、白细胞介素4(il-4)和粘膜肥大细胞蛋白酶1(mmcp-1)的水平显著升高(p《0.05)；随着芝麻素给药剂量的增加而降低，这些结果表明芝麻素能有效减少卵清蛋白(ova)诱导的免疫球蛋白和促炎因子的释放。
[0050]
3.3qrt-pcr检测小鼠脾脏中th细胞标志基因的表达水平
[0051]
在食物过敏的整个过程中，免疫系统原本平衡的th1/th2与treg/th17细胞分化平衡被打破。t-bet、gata3、ror-γt和foxp3分别是th1、th2、th17和treg细胞的标志基因，通过检测mrna表达量可间接指示th1/th2与treg/th17细胞分化情况。我们提取小鼠脾脏的mrna，反转录获得cdna，通过qrt-pcr进行扩增定量。检测脾脏中th细胞标志基因的表达水平。
[0052]
实验结果：分析图8可知，与空白对照相比，对照中gata3和rorγt的mrna表达量显着升高，而t-bet和foxp3的mrna表达量显著降低。这表明th1和treg亚群减少，th2和th17亚群增加，导致免疫稳态破坏。随着芝麻素剂量的增加，转录因子mrna表达水平的异常变化得到极大缓解，显示出优秀的调节th细胞分化、缓解过敏症状、维持免疫系统平衡的能力。
[0053]
3.4小鼠脾脏蛋白免疫印迹分析
[0054]
通过蛋白质印迹分析测量小鼠脾脏中syk及其下游蛋白(p38、erk和p65)的表达和磷酸化水平。抗体均为abcam公司商品化抗体，使用的一抗为syk(ab40781)、syk(phospho y352)(ab300398)、p38β/mapk11+p38α/mapk14(ab32142)、p38(phospho t180+y182)(ab195049)、erk1+erk2(ab184699)、erk1(phospho t202)+erk2(phospho t185)(ab201015)、nf-κb p65(ab32536)、p-nf-κb p65(phospho s536)(ab76302)和β-actin(ab179467)。使用的二抗是山羊抗兔igg h&l(hrp)(ab97051)。之后对蛋白条带进行定量分析，检测脾脏中通路蛋白的磷酸化水平。
[0055]
实验结果：分析图9可知，与空白组相比，对照组的syk、p65、p38、erk的磷酸化水平显著升高；随着芝麻素给药剂量增大，syk的磷酸化水平显著降低，有效抑制了p38、erk和p65磷酸化的下游信号通路激活，呈现出剂量依赖性。这些结果证明了芝麻素在抑制免疫细胞内信号传导、维持免疫系统稳态等方面的出色能力。
[0056]
以上所述仅为本技术的优选实施例，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.芝麻素在制备治疗食物过敏药品上的应用，其特征在于，所述的芝麻素的结构式如式ⅰ所示：2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，药品中含有效剂量1wt.％-99wt.％的芝麻素。3.芝麻素在制备治疗食物过敏食品上的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，食品中含有效剂量1wt.％-99wt.％的芝麻素。5.芝麻素在制备治疗食物过敏保健品上的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，保健品中含有效剂量1wt.％-99wt.％的芝麻素。

技术总结
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及芝麻素在制备治疗食物过敏产品上的应用。芝麻素降低了肥大细胞β-氨基己糖苷酶与组胺的释放率；缓解了被动皮肤过敏(PCA)反应中小鼠的染料外渗、血管通透性增高和组织水肿；抑制了主动系统性食物过敏(ASA)反应中因食物过敏引起的小鼠体重降低，脾脏指数升高，体温异常降低，过敏临床症状；抑制过敏因子(IgE、IgG1、IL-4、mMCP-1、Histamine)的产生；恢复了小鼠脾脏中Th1/Th2和Treg/Th17细胞分化失衡；抑制了脾脏中Syk、p65、p38、ERK等信号蛋白的磷酸化激活。综上所述，芝麻素对食物过敏具有显著的缓解效果，本发明拓展了芝麻素对食物过敏的药理作用，为芝麻素临床治疗和/或缓解食物过敏提供理论依据和应用思路。理论依据和应用思路。理论依据和应用思路。


技术研发人员：李锋 李宇 李大鹏 刘慧 郝日礼 董婧潇
受保护的技术使用者：山东农业大学
技术研发日：2023.08.02
技术公布日：2023/10/15