RNF152蛋白在制备抗胆囊癌化疗药物耐药增敏剂中的应用

rnf152蛋白在制备抗胆囊癌化疗药物耐药增敏剂中的应用
技术领域
1.本发明属于胆囊癌研究技术领域，具体涉及rnf152蛋白在制备抗胆囊癌化疗药物耐药增敏剂中的应用。


背景技术：

2.胆囊癌(gallbladder cancer,gbc)作为胆道系统最为常见的恶性肿瘤，占据胆道恶性肿瘤总体发病率的80-95％。由于胆囊癌起病隐匿，根治性切除率低，易出现侵袭转移和放化疗效果不佳等原因，其总体预后很差，中位生存期仅为6个月，5年生存率仅为5-10％。因此，胆囊癌又被称作癌中的“无冕之王”。相对于胃癌、结直肠癌等近十年来在治疗方面取得的可喜进步而言，胆囊癌的治疗几乎原地踏步，不同于其他消化系统恶性肿瘤对其标准化疗药物的敏感性，胆囊癌存在的高耐药性可能是导致其极差疗效的关键。


技术实现要素：

3.鉴于此，本发明的目的在于提供一种rnf152蛋白在制备抗胆囊癌化疗药物耐药增敏剂中的应用。
4.为实现上述目的，本发明所采取的解决方案如下：
5.第一个方面，本发明提供一种rnf152蛋白在制备抗胆囊癌化疗药物耐药增敏剂中的应用。
6.优选地，所述rnf152蛋白能够抑制胆囊癌的增殖、迁移与侵袭，以及提高对抗胆囊癌化疗药物吉西他滨的敏感性。
7.优选地，所述rnf152蛋白通过抑制mtorc-1信号通路抑制胆囊癌糖酵解过程。
8.优选地，所述rnf152蛋白通过泛素化作用破坏p18复合体的稳定性，负向调控mtorc-1通路。
9.优选地，rnf152在胆囊癌细胞中的表达被抑制，模拟禁食条件能够上调rnf152的表达，辅助抑制胆囊癌的发生和发展。
10.第二个方面，本发明还提供一种抗胆囊癌化疗药物的耐药增敏剂，所述抗胆囊癌化疗药物的耐药增敏剂包括rnf152蛋白。
11.第三个方面，本发明还提供一种增加胆囊癌细胞对抗胆囊癌化疗药物的敏感性的方法，所述方法包括模拟禁食饮食。
12.本发明提供的rnf152蛋白为指环蛋白152(ring finger protein 152,rnf152)，是由203个氨基酸组成的ring家族e3泛素连接酶，被发现其与多种肿瘤发生发展密切相关，本发明对胆囊癌吉西他滨耐药的分子机制进行研究，证实了rnf152蛋白与抗胆囊癌化疗药物吉西他滨的敏感性的关联性，从而提出一种rnf152蛋白在制备抗胆囊癌化疗药物耐药增敏剂中的应用。
13.现有技术相比，本发明的有益效果在于：
14.(1)本发明提供一种rnf152蛋白在制备抗胆囊癌化疗药物耐药增敏剂中的应用，
通过试验证实rnf152在胆囊癌发展、耐药机制中起到了关键作用，是调控模拟禁食饮食提高胆囊癌对吉西他滨敏感性的重要因子，有望成为治疗胆囊癌抗肿瘤治疗领域的潜在增敏剂。
15.(2)本发明首次详细证实rnf152/p18/mtorc1信号通路在抑制胆囊癌对吉西他滨的耐药作用的具体分子机制，rnf152可作为胆囊癌抗肿瘤治疗领域的一种潜在增敏剂。禁食条件能促进rnf152表达，为后续通过模拟禁食饮食治疗胆囊癌的机制研究提供了理论基础及临床应用价值。
附图说明
16.图1为本发明实施例1关于模拟禁食饮食能够抑制胆囊癌细胞糖酵解以及对吉西他滨耐药的说明图例；图中，图1a为葡萄糖吸收检测实验证实了模拟禁食饮食能显著降低胆囊癌细胞gbc-sd的葡萄糖吸收水平；图1b为乳酸比色检测实验证实了模拟禁食饮食能显著降低胆囊癌细胞gbc-sd乳酸生成水平；图1c为细胞外通量分析仪检测胆囊癌细胞经禁食处理后胆囊癌细胞gbc-sd的下细胞外酸化率均降低；图1d为细胞外通量分析仪检测胆囊癌细胞经禁食处理后胆囊癌细胞gbc-sd的氧耗率均显著升高；图1e为免疫印迹法证实模拟禁食饮食能显著降低胆囊癌细胞gbc-sd中各糖酵解限速酶(pdk1、pkm2和hk-2)的蛋白表达水平；图1f为cck-8实验检测模拟禁食饮食后胆囊癌细胞gbc-sd对吉西他滨的敏感性增加；图1g为免疫荧光法证实了模拟禁食饮食后胆囊癌细胞gbc-sd对吉西他滨的敏感性增加；图1h为条形图证实模拟禁食后胆囊癌细胞株gbc-sd对吉西他滨的敏感性增加。
17.图2为本发明实施例2中关于rnf152的表达在胆囊癌细胞中的表达被抑制的说明图例；图中，图2a为免疫印迹法检测7对胆囊癌患者癌组织、癌旁组织证实胆囊癌组织中rnf152蛋白表达水平在低于癌旁组织；图2b为qrt-pcr方法检测25对胆囊癌及癌旁组织证实胆囊癌中rnf152的mrna水平低于癌旁组织；图2c为免疫组化方法证实了rnf152的蛋白水平在肿瘤组织中表达下调；图2d为在胆囊癌细胞gbc-sd、sgc-996上构建敲减rnf152的转染效率图；图2e为cck-8实验证实敲减rnf152能增强胆囊癌细胞gbc-sd、sgc-996的增殖能力；图2f为条形图计数cck-8实验证实敲减rnf152能增强胆囊癌细胞gbc-sd、sgc-996的增殖能力；图2g为免疫荧光实验证实敲减rnf152能降低胆囊癌细胞的细胞活力；图2h为细胞划痕实验实验敲低rnf152能增强胆囊癌细胞gbc-sd的迁移、侵袭能力。
18.图3为本发明实施例3中关于模拟禁食能调节胆囊癌细胞中rnf152的下游通路的说明图例；图中，图3a为通过免疫印迹实验证实经模拟禁食48h后和过表达rnf152的胆囊癌细胞sgc-996和gbc-sd中rnf152表达水平；图3b cck-8法实证实过表达rnf152及禁食48h后能抑制胆囊癌细胞gbc-sd、sgc-996的增殖能力；图3c、3d为运用胆囊癌细胞gbc-sd与过表达rnf152的细胞株构建裸鼠皮下移植瘤模型，实验证实过表达rnf152与模拟禁食饮食联合能抑制移植瘤的大小和体积；图3e为cck-8法实证实敲低rnf152及禁食48h后能抑制胆囊癌细胞gbc-sd、sgc-996的增殖能力；图3f、3g为禁食条件下裸鼠移植瘤的生长速度与体积被抑制，rnf152敲低后能促进移植瘤的生长速度与体积，联合禁食及敲低rnf152表达无法抑制移植瘤的生长速度与体积。
19.图4为本发明实施例4中关于rnf152缺失能降低胆囊癌细胞对吉西他滨的敏感性的说明图例；图中，图4a为采用吉西他滨处理胆囊癌细胞sgc-996和gbc-sd 72h,细胞活性
检测证实rnf152表达缺失能降低sgc-996和gbc-sd对吉西他滨的敏感性；图4b为流式细胞技术证实敲低rnf152能显著降低胆囊癌细胞凋亡数量，增加半数抑制浓度；图4c为条形图证实敲低rnf152后sgc-996和gbc-sd的细胞凋亡数目降低；图4d为细胞克隆实验证实敲低rnf152厚，经吉西他滨处理后的胆囊癌细胞敏感性降低
20.图5为本发明实施例5中关于模拟禁食条件下rnf152能抑制mtorc1介导的糖酵解水平的说明图例；图中，图5a为免疫印迹法证实过表达rnf152和禁食均能抑制mtorc1的激活(p-4e-bp1和ps6k1表达下调)，禁食联合过表达rnf152能加强这种抑制作用；图5b为免疫印迹法证实沉默rnf152表达能促进糖酵解途径(限速酶pdk1、pkm2和hk-2表达上调)，增强mtorc1通路的活性(p-4e-bp1和ps6k1表达上调)，这种增强效应能被mtorc1抑制剂torin1(250nm)抑制；图5c为葡萄糖吸收检测实验证实了敲低rnf152能显著升高胆囊癌细胞gbc-sd的葡萄糖吸收水平，而加入torin1(250nm)葡萄糖吸收水平下降；图5d为乳酸比色检测实验证实了敲低rnf152显著升高胆囊癌细胞gbc-sd乳酸生成水平，加入torin1(250nm)乳酸生成水平下降。
21.图6为本发明实施例6中关于rnf152能通过蛋白酶体途径调节体内p18的水平的说明图例；图6a为免疫组化法检测胆囊癌组织、癌旁组织，rnf152呈低表达水平，p18呈高表达水平；图6b为免疫印迹法证实敲低sgc-996和gbc-sd的rnf152表达，p18表达上调，过表达rnf152，p18表达下调；图6c为；图6d为免疫共沉淀法证实rnf152与p18存在内源性交互作用；图6e为免疫共沉淀法证实过表达rnf152后p18的泛素化水平显著上调。
22.图7为本发明实施例7中关于p18上调能促进rag复合体、mtorc1锚定于溶酶体的说明图例；图7a为免疫荧光共定位法检测p18表达敲低的胆囊癌细胞中lamp2(红)、mtorc(绿)的表达水平下调；图7b为免疫荧光共定位法检测p18表达敲低的胆囊癌细胞中lamp2(红)、raga(绿)的表达水平下调；图7c为免疫荧光共定位法检测p18表达敲低的胆囊癌细胞中lamp2(红)、p14(绿)的表达水平下调；图7d为条形图量化mtor、raga、p14的表达水平在p18表达缺失的条件下均降低；图7e为免疫共沉淀法证实p18与ragc、raga、p14在细胞内相互作用。
23.图8为本发明实施例8中关于rnf152表达缺失会抑制p18的交互作用进而导致mtorc1信号通路异常的说明图例；图中，图8a为免疫印迹法表明敲低胆囊癌细胞株sgc-996和gbc-sd的rnf152表达能增强糖酵解途径(限速酶pdk1、pkm2和hk-2表达上调)，增强mtorc1通路的活性(p-4e-bp1和ps6k1表达上调)，联合敲低p18表达会抑制这种增强效应；图8b为细胞克隆实验证实rnf152表达缺失能促进囊癌细胞株sgc-996和gbc-sd的增殖能力，同时敲低p18会抑制其增殖能力；图8c为细胞划痕实验证实rnf152表达缺失能促进囊癌细胞株sgc-996和gbc-sd的迁移、侵袭能力，同时敲低p18会逆转这种效应。
24.图9为本发明实施例9中关于rnf152能通过抑制mtorc1信号通路和糖酵解增强胆囊癌细胞对吉西他滨的敏感性的说明图例；图中，图9a为构建rnf152过表达、rnf152敲低的裸鼠移植瘤模型，免疫印迹法证实rnf152过表达的移植瘤p-4e-bp1、ps6k1、4e-bp1、s6k1、pdk1、pkm2和hk-2表达水平下降，敲低rnf152表达后，移植瘤p-4e-bp1、ps6k1、4e-bp1、s6k1、pdk1、pkm2和hk-2表达水平上升；图9b为吉西他滨能抑制动物模型移植瘤的体积大小，过表达rnf152能增强其抗肿瘤效应；图9c为免疫组化法证实吉西他滨能抑制胆囊癌细胞的增殖活性，过表达rnf152能增强这种抑制效应。
具体实施方式
25.本发明提供了一种rnf152蛋白在制备抗胆囊癌化疗药物耐药增敏剂中的应用。
26.以吉西他滨为主的化疗方案是治疗晚期以及局部进展期胆囊恶性肿瘤的一线方案。然而多数患者在治疗早期就出现吉西他滨耐药，迫切需要揭示胆囊癌中吉西他滨耐药的生物学机制，并探索克服吉西他滨耐药的潜在治疗靶点。mtorc1通路是细胞内最主要的能量感受器，能感知细胞内营养物质水平、调节代谢平衡，以及调节细胞生长，也是影响肿瘤细胞生长、迁移及耐药的重要信号通路。rnf152作为mtorc1通路的负向调控因子，也是对饥饿刺激产生响应的基因。本发明通过体内外实验证实，通过rnf152的过表达，胆囊癌的生长、迁移明显受抑，对吉西他滨敏感性增加，而模拟禁食条件能促进胆囊癌细胞表达rnf152。进一步实验证实模拟禁食通过rnf152/p18/mtorc1途径抑制胆囊癌的糖酵解，可以辅助增强癌细胞对吉西他滨的敏感性。
27.以下结合具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
28.实施例一：模拟禁食饮食能够抑制胆囊癌细胞糖酵解以及对吉西他滨耐药
29.本实施例首先通过模拟禁食方式培养胆囊癌细胞(gbc-sd)48小时，检测发现细胞葡萄糖摄取能力和乳酸含量下降(图1a、1b)，而细胞外酸化率(ecar)下降，耗氧率增加，提示gbc-sd的糖酵解水平下降，线粒体呼吸水平上升(图1c、1d)。上述结果说明模拟禁食饮食能够抑制胆囊癌细胞的糖酵解水平，提高线粒体有氧呼吸水平。
30.此外，模拟禁食还能下调糖酵解途径相关限速酶(pkm2,hk2,pfk1)的表达水平(图1e)。吉西他滨是治疗胆囊癌的主要化疗药，本实施例通过cck-8法和免疫荧光法证实模拟禁食能增强吉西他滨对gbc-sd的杀伤力(图1f-1h)。
31.模拟禁食细胞模型方法：用dmem培养基(葡萄糖：0.5g/l，fbs1％)培养细胞24小时、48小时。
32.实施例二：rnf152的表达在胆囊癌细胞中的表达被抑制
33.本实施例通过qrt-pcr、免疫印迹法、免疫组化法检测了25对胆囊癌组织及癌旁组织中的mrna表达水平和蛋白表达水平，发现rnf152在胆囊癌组织中mrna及蛋白表达水平显著下调(图2a，2b，2c)。本实施例进一步通过sirna法沉默rnf152在胆囊癌细胞株gbc-sd和sgc-996(图2d)。进一步构建了敲减及过表达rnf15的胆囊癌细胞株，细胞集落实验证实rnf152表达被敲低后，gbc-sd和sgc-996的生长速度加快，而过表达rnf152，胆囊癌细胞的生长速度则被抑制(图2d，2e，2f)。edu是一种染色示踪剂，能标记处于细胞分裂s期的活细胞，免疫荧光实验证实，rnf152能促抑制胆囊癌细胞生长(图2g)。细胞划痕实验同样证实了以上结论(图2h)。本实施例证实了抑制rnf152表达能抑制胆囊癌细胞的增殖能力。
34.构建敲低rnf152的胆囊癌细胞株方法：构建沉默rnf152表达的si-rna，通过lipo-rnaimax(美国，thermo fisher scientific)将si-rna-rnf152转染至gbc细胞株，进而敲低胆囊癌细胞株rnf152的表达。
35.sirna-rnf152的序列为：
[0036]5’‑
ccggatgtcagatctgtttcaattactcgagtaattgaaacagatctgacatttttttg-3’。
[0037]
实施例三：模拟禁食能调节胆囊癌细胞中rnf152的下游通路
[0038]
为了验证模拟禁食是否能调控rnf152的下游通路，本实施例通过免疫印迹法检测模拟禁食胆囊癌细胞模型中rnf152的表达，结果显示rnf152的表达显著上调，细胞的增殖能力被抑制(图3a，3b)。然后，进一步将胆囊癌细胞，过表达rnf152胆囊癌细胞，模拟禁食的胆囊癌细胞，模拟禁食+过表达rnf152，敲低rnf152表达组，模拟禁食+敲低rnf152组的胆囊癌细胞移植在裸鼠身上，构建胆囊癌的裸鼠瘤模型，其中过表达rnf152、模拟禁食组的肿瘤生长被抑制，模拟禁食+过表达rnf152组的肿瘤体积最小，被抑制程度更显著(图3c，3d)。相反地，抑制rnf152表达并不能改变胆囊癌的生长(图3e，3f，3g)。综上所述，通过体内、体外实验证实模拟禁食能促进rnf152的表达，并调控其相关下游通路。
[0039]
实施例四：rnf152缺失能降低胆囊癌细胞对吉西他滨的敏感性
[0040]
众所周知，胆囊癌细胞抗肿瘤治疗过程中容易产生耐药性，为进一步验证rnf152是否影响胆囊癌的耐药性，本实施例使用吉西他滨处理rnf152表达缺失的胆囊癌细胞，结果显示rnf152表达敲低后，gbc-sd与sgc996的ic
50
较对照组升高，即胆囊癌细胞对吉西他滨的敏感性降低(图4a)。细胞凋亡实验也证实，rnf152敲低后，经吉西他滨处理的胆囊癌细胞株凋亡比例降低(图4b，4c)。此外，细胞集落形成实验证实经过ic
50
的吉西他滨处理后，rnf表达缺失的胆囊癌细胞株细胞生长速度明显加快(图4d)。以上结果均说明敲低rnf152表达后，胆囊癌对吉西他滨的耐药性增加。
[0041]
实施例五：模拟禁食条件下rnf152能抑制mtorc1介导的糖酵解水平
[0042]
糖酵解途径主要通过mtorc1通路及s6k和4e-bp底物磷酸化发挥作用。本实施例通过构建质粒，进一步研究禁食条件下过表达胆囊癌细胞株内rnf152是否影响mtorc1信号通路相关蛋白的表达水平。western blot法结果显示，4e-bp1和s6k1的磷酸化水平下调，说明模拟禁食和过表达rnf152均能抑制mtorc1通路活化，二者结合能够明显增强这种抑制效应(图5a)。相反地，敲低rnf152表达能促进糖酵解效应和mtorc1通路活化，且这种影响能被mtorc1抑制剂torin1逆转(图5b)。rnf152敲低后葡萄糖摄取水平和乳酸含量明显上升，即糖酵解途径增强，而这种效应同样也能被torin1抑制(图5c、5d)。因此，胆囊癌细胞中的rnf152表达水平在模拟禁食条件下上调可能受mtorc1通路活化抑制的影响。
[0043]
实施例六：rnf152能通过蛋白酶体途径调节体内p18的水平
[0044]
p18通过将mtorc1锚定在溶酶体膜表面进而正向调控mtorc1的表达。因此我们研究了rnf152的差异性表达是否会影响p18水平。通过免疫组化实验，在胆囊癌组织中，rnf152呈低表达水平，p18呈高表达水平，而在癌旁组织中rnf152呈高表达水平，p18呈低表达水平(图6a)。当沉默gbc-sd细胞中rnf152的表达，p18表达上调；而过表达细胞内rnf152时，p18表达下调(图6b)。此外，本实施例进一步使用蛋白酶抑制剂mg132(10mm)、溶酶体抑制剂巴佛洛霉素a1(bafa,100nm)处理胆囊癌细胞，westernblot实验证实通过mg132处理后p18表达增加，这说明p18是受蛋白酶体途径调控(图6c)。进一步通过免疫共沉淀法发现胆囊癌细胞内源性rnf152与p18具有交互作用(图6d)。在rnf152过表达的条件下，细胞内泛素化水平上升(图6e)。以上实验证实rnf152通过蛋白酶体途径调节p18的表达。
[0045]
实施例七：p18上调能促进rag复合体、mtorc1锚定于溶酶体
[0046]
为了证实p18表达水平是否与rag复合体、mtorc1在溶酶体定位有关，本实施例采用免疫荧光法研究溶酶体蛋白lamp2，mtor,raga,p14在p18表达或表达缺失条件下的水平(图7a-c)。当p18表达时，mtor-lamp2,rag-lamp2，mtor,raga,p14的表达明显上调(图7d)。
进一步通过免疫共沉淀法证实p18与raga,ragc和p14交互作用(图7e)。以上结论说明高表达p18能促使rag复合体定位于溶酶体和mtorc1激活。
[0047]
sirna-p18的序列为：5
’‑
ggagcugguuguacaguuu-3’[0048]
实施例八：rnf152表达缺失会抑制p18的交互作用进而导致mtorc1信号通路异常
[0049]
敲低胆囊癌细胞gbc-sd与sgc-996中rnf152表达，糖酵解途径限速酶，hk-2、pkm2、pfk与s6k1、4e-bp-1磷酸化水平上调，而同时敲低p18，能逆转这种增强效应(图8a)。平板克隆实验和细胞划痕实验证实，同时敲低p18和rnf152，胆囊癌细胞的增殖和迁移能力受到抑制(图8b、8c)。说明p18并非模拟禁食下线粒体氧化磷酸化的必要条件，p18在糖酵解和细胞生长过程中起到重要作用。
[0050]
实施例九：rnf152能通过抑制mtorc1信号通路和糖酵解增强胆囊癌细胞对吉西他滨的敏感性
[0051]
前续细胞实验已经验证rnf152能通过抑制mtorc1信号通路和糖酵解增强胆囊癌细胞对吉西他滨的敏感性，本实施例在动物模型上也得出同样的结果。将过表达rnf152的胆囊癌细胞移植到裸鼠身上，建立动物模型。24天后利用westernblot法检测肿瘤组织rnf152,p18,mtorc1底物、糖酵解途径关键酶(hk-2、pkm2、pfk)的表达水平，过表达rnf152能下调p18表达水平及hk-2、pkm2、pfk的表达(图9a)。将吉西他滨用于构建的动物模型发现，过表达rnf152组肿瘤生长速度明显小于对照组(图9b)。采用免疫组化法检测肿瘤组织中ki-67发现，过表达rnf152会降低ki-67表达，即抑制胆囊癌的增殖，增强对吉西他滨的敏感性(图9c)。这一系列的实验结果表明模拟禁食介导的rnf152上调能通过抑制mtorc1信号通路和糖酵解降低胆囊癌细胞对吉西他滨的耐药性。
[0052]
吉西他滨是用于治疗胆囊癌的主要化疗药物，rnf152能通过抑制mtorc1信号通路和糖酵解途径，降低胆囊癌细胞对吉西他滨的耐药性。此外，模拟禁食条件能上调rnf152的表达，即rnf152可作为吉一种潜在的新型西他滨的化疗增敏剂，联合模拟禁食方式，可用于胆囊癌的术后辅助治疗或姑息治疗，达到降低化疗耐药性的目的。
[0053]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.rnf152蛋白在制备抗胆囊癌化疗药物耐药增敏剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述rnf152蛋白能够抑制胆囊癌的增殖、迁移与侵袭，以及提高对抗胆囊癌化疗药物吉西他滨的敏感性。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述rnf152蛋白通过抑制mtorc-1信号通路抑制胆囊癌糖酵解过程。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述rnf152蛋白通过泛素化作用破坏p18复合体的稳定性，负向调控mtorc-1通路。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，rnf152在胆囊癌细胞中的表达被抑制，模拟禁食条件能够上调rnf152的表达，辅助抑制胆囊癌的发生和发展。6.一种抗胆囊癌化疗药物的耐药增敏剂，其特征在于，所述抗胆囊癌化疗药物的耐药增敏剂包括rnf152蛋白。7.一种增加胆囊癌细胞对抗胆囊癌化疗药物的敏感性的方法，其特征在于，所述方法包括模拟禁食饮食。

技术总结
本发明属于胆囊癌研究技术领域，具体涉及RNF152蛋白在制备抗胆囊癌化疗药物耐药增敏剂中的应用，通过试验证实RNF152在胆囊癌发展、耐药机制中起到了关键作用，是调控模拟禁食饮食提高胆囊癌对吉西他滨敏感性的重要因子，有望成为治疗胆囊癌抗肿瘤治疗领域的潜在增敏剂。增敏剂。增敏剂。


技术研发人员：沈盛 巩子君 陶颖 昝睿 孙文韬 锁涛 刘厚宝
受保护的技术使用者：复旦大学附属中山医院
技术研发日：2023.07.31
技术公布日：2023/10/15