一种无菌脱细胞基质温敏凝胶支架及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物组织工程材料技术领域，具体涉及一种无菌脱细胞基质温敏凝胶支架及其制备方法和应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.目前研究载药和载细胞的胶原蛋白温敏凝胶基质制备多采用无菌加工和无菌过滤的方式，从原料处理到制备出成品全程无菌加工成本高，无菌过滤可以节约成本。无菌过滤技术，即在一定压力下，使溶质和溶剂穿过小于0.22μm的薄膜，而使细菌和大分子溶质不能透过，从而达到除菌过滤的目的，但由于胶原蛋白具有高粘度、易成膜等特征，在膜的表面上易生成凝胶层，使膜的通量急剧下降，无菌过滤效率低，使得无菌过滤的应用受到一定程度的限制。
4.真空冷冻干燥技术可以有效地防止制品理化及生物特性的改变，有效保护了许多热敏性药物生物制品有效成份的稳定性。其次，冻干制品在干燥后形态疏松、颜色基本不发生改变，此外，制品经过冻干后水分含量非常低，使制品的稳定性提高，受污染的机会减小，这不仅方便了运输还延长了制品保存期限。但是如何使高浓度胶原蛋白冻干基质能够快速溶解至水相中，是本领域急需解决的问题。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供一种无菌脱细胞基质温敏凝胶支架及其制备方法和应用。具体的，本发明通过优化制备工艺，获得一种高生物活性及大孔径的无菌脱细胞基质冻干纤维，其能够与水相快速融合形成均一溶胶溶液，并可在体温温度刺激下发生溶胶-凝胶的相转变，从而成功获得上述无菌脱细胞基质温敏凝胶支架。基于上述研究成果，从而完成本发明。
6.为了实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：
7.本发明的第一个方面，提供一种无菌脱细胞基质温敏凝胶支架，其至少包括溶于水相中的无菌脱细胞基质冻干纤维；
8.其中，所述无菌脱细胞基质冻干纤维的重量百分含量为0.2-2％，进一步为0.5-1.5％，更进一步为1％。
9.所述脱细胞基质冻干纤维是利用非人哺乳动物的细胞外基质经0.5-2％(优选为1％)柠檬酸-胃蛋白酶-尿素溶液酶解、无菌过滤、去除胃蛋白酶和尿素、中和以及冻干后获得。
10.本发明的第二个方面，提供上述无菌脱细胞基质温敏凝胶支架的制备方法，所述制备方法包括：将水相加入无菌脱细胞基质冻干纤维中，混匀后即得。
11.所述水相可以为灭菌注射用水，在实际生产过程中，可采用无菌注射器将水相即灭菌注射用水注入到无菌脱细胞基质冻干纤维。
12.进一步的，所述制备方法还包括向其中加入细胞、药物以及非药物活性成分中的至少一种。
13.本发明的第三个方面，提供上述无菌脱细胞基质温敏凝胶支架在如下至少一种中的应用：
14.(a)药物释放或制备药物释放的产品；
15.(b)作为组织细胞支架或制备组织细胞支架；
16.(c)组织修复或制备组织修复的产品。
17.以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
18.(1)上述技术方案提供的方法将来自于哺乳动物的细胞外基质转入1％柠檬酸-胃蛋白酶-尿素溶液中，然后放入反应釜中进行常温剪切搅拌酶解12-48h，酶解过程中引入间歇式剪切功能，增大了物料与胃蛋白酶的接触面积，大大提高了物料的酶解速度，缩短了酶解时间，节约生产成本；并且酶解液中增加了尿素，利用尿素可以有效破坏蛋白质的二级结构使蛋白质展开并暴露出可电离的结构群体使之溶解性增强的原理，能够降低其黏度，增加了无菌过滤通量/cm2，减少了滤膜用量，节约了生产成本。
19.(2)酶解液采用1％柠檬酸作为溶剂，不仅可以增大胶原的溶解度，中和至中性时，脱细胞基质凝胶溶液恰好为等渗缓冲溶液，所以水相中无需再加入磷酸盐、氯化钠等盐溶质，简化生产步骤，节约生产成本。
20.(3)上述技术方案先采用灭菌处理后的强酸性阳离子交换树脂去除尿素，再经过灭菌处理后的分子筛去除胃蛋白酶，有效的去除助剂残留，所以不会具有潜在的细胞毒性，生物安全性高。
21.(4)上述技术方案的方法将不锈钢网状滤头与灌装管道直接相连，目的使中和后的料液分散为低粒径均一溶液，保证了灌装时干物质含量的稳定，同时也增加了冻干后脱细胞基质冻干纤维的溶解度。
22.(5)上述技术方案采用对制备的脱细胞基质凝胶溶液在冻干前先进行37℃条件下凝胶化为固态，形成大孔径水凝胶后再预冻冻干，既不破坏其三螺旋结构，保留其生物活性，又能形成大孔径的脱细胞基质冻干纤维，使其和水相能快速融合成均一溶胶溶液。
23.(6)上述技术方案制备的温敏凝胶支架在溶胶液状态时，可自由加载各种不同性质的细胞或药物组合物，以溶液形式注射到需要治疗的区域后，在体温温度刺激下可以在用药部位发生溶胶-凝胶的相转变，形成的凝胶支架有利于细胞生长，使得该凝胶在需要这种治疗的身体区域中保持治疗剂，促进组织创面修复。
24.(7)上述技术方案制备的温敏凝胶支架经过冻干后水分含量非常低，使制品的稳定性提高，受污染的机会减小，方便运输、存储。
附图说明
25.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
26.图1为冷冻干燥后的温敏凝胶支架材料。
27.图2为各实施例和对比例酶解液状态。
28.图3为测试例4尿素含量标准曲线。
29.图4为实施例1样品37℃水浴30min内凝胶化温敏凝胶的形态。
30.图5为实施例1样品37℃水浴中30min内凝胶化放入4℃又呈溶胶液的形态。
31.图6为冷冻干燥后的温敏凝胶支架材料扫描电镜图。
32.图7为用实施例1制备的温敏凝胶包被96孔细胞培养板，培养48h后，显微镜下观察细胞增殖情况，a为有凝胶试验组，b为无凝胶试验组。
33.图8为用实施例1制备的温敏凝胶包被96孔细胞培养板，培养48h后细胞活力检测。
34.图9为造模组修复12d后，he染色，100x。
35.图10为造模组修复12d后，he染色，400x。
36.图11为凝胶修复组修复12d后，he染色，100x。
37.图12为凝胶修复组修复12d后，he染色，400x。
具体实施方式
38.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
39.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
40.本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种无菌脱细胞基质温敏凝胶支架，其至少包括溶于水相中的无菌脱细胞基质冻干纤维；
41.本发明的又一具体实施方式中，所述无菌脱细胞基质冻干纤维的重量百分含量为0.2-2％，进一步为0.5-1.5％，更进一步为1％。
42.所述脱细胞基质冻干纤维是利用非人哺乳动物的细胞外基质经0.5-2％(优选为1％)柠檬酸-胃蛋白酶-尿素溶液酶解、无菌过滤、去除胃蛋白酶和尿素、中和以及冻干后获得。
43.具体的，所述非人哺乳动物的细胞外基质中，所述非人哺乳动物包括但不限于猪、牛、狗、羊、兔和鼠；进一步优选为(小)猪和(小)牛。
44.所述细胞外基质包括但不限于非人哺乳动物的腹膜、肌腱、松质骨、小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、真皮基质、心包膜、脑膜、羊膜和脏器膜中任意一种或多种；进一步优选为腹膜。
45.所述非人哺乳动物的细胞外基质与0.5-2％柠檬酸-胃蛋白酶-尿素溶液的质量比为0.2-2:100，进一步优选为1:100；
46.细胞外基质与胃蛋白酶的质量比为50～10:1；尿素溶液质量浓度为0.5％～2％。
47.所述酶解的具体方法包括：将上述酶解液至于酶解容器(如反应釜)中进行常温剪
切搅拌酶解；更具体的，所述剪切可以为间歇式剪切，剪切参数为30s/次，每次剪切间隔时间为2h，反应釜搅拌速度80～150r/min；酶解时间控制为12-48h。
48.所述无菌过滤具体方法包括：依次经过200目
→
0.45μm
→
0.22μm
→
0.1μm滤膜实现快速无菌过滤，得到无菌过滤酶解液。
49.其中，所述滤膜材质为聚醚砜材质、聚砜材质、聚偏二氟乙烯；进一步优选聚砜材质。直径为47mm-300mm，孔径为0.1μm-0.45μm。
50.所述去除胃蛋白酶和尿素的具体方法包括：将上述无菌过滤酶解液经灭菌处理后的强酸性阳离子交换树脂(如苯乙烯-二乙烯基苯共聚体树脂)去除尿素，再经过灭菌处理后的分子筛(如介孔sba-15)去除胃蛋白酶，得到酸性脱细胞基质凝胶溶液。
51.上述离子交换树脂或分子筛均采用辐照灭菌处理。
52.所述中和的方法具体为向上述酸性脱细胞基质凝胶溶液中加入无菌碱液调节ph至6.5-7.5。
53.本发明的又一具体实施方式中，所述碱液可以为5-15mol/l(优选为10mol/l)氢氧化钠溶液。
54.所述冻干过程还可包括灌装以及定型过程，具体的，将经中和后的脱细胞基质凝胶溶液经200目滤头后直接无菌灌装至容器(如西林瓶)内放入冻干机内，设置冻干机温度为33-38℃保持10min～1h使样液凝胶化为固态，然后启动-30℃预冻3h，启动冻干程序(预冻：-20℃3.5h；主干燥：0℃12h；10℃2h；20℃1h；30℃1h)，冻干后获得大孔径(孔径为20～100μm)的无菌脱细胞基质冻干纤维。
55.需要说明的是，所述滤头可以为不锈钢网状滤头，其与灌装管道直接相连，从而使中和后的料液分散为低粒径均一溶液，保证了灌装时干物质含量的稳定，同时也增加了冻干后脱细胞基质冻干纤维的溶解度。
56.上述方法获得的脱细胞基质冻干纤维是无菌的，其孔径大、低残留、溶解度大。
57.同时，在本发明中，所述水相可以为灭菌注射用水。
58.本发明的又一具体实施方式中，上述获得的无菌脱细胞基质温敏凝胶支架材料是溶胶-凝胶相变临界点为33～38℃的温敏水凝胶，从而使其可以以溶液形式注射到需要治疗的区域后，在体温温度刺激下可以在用药部位发生溶胶-凝胶的相转变。
59.也因此，上述无菌脱细胞基质温敏凝胶支架还可以负载细胞和/或药物，其中，所述细胞可以是传统体细胞、免疫细胞以及各种不同的干细胞等。如肝细胞、胰岛细胞、软骨细胞、树突状细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、体外加工的骨髓或造血干细胞和体外处理的肿瘤细胞等。其中体外载细胞浓度为1
×
10
3-1
×
105cells/ml；优选1
×
10
4-1
×
105cells/ml；体内载细胞浓度为1
×
10
8-1
×
10
10
cells/ml；优选1
×
108‑×
109cells/ml。
60.所述药物包括核酸、抗生素、抗炎剂、抗体或其抗体片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子、金属、碳水化合物或类似物、脂质、激素、微粒体、其衍生物或变体、以及其任何组合。
61.一般的，上述细胞和药物均可认定为(药物)活性成分，从而进一步发挥预防和/或治疗相关疾病的作用。显然，也可以向无菌脱细胞基质温敏凝胶支架材料加入非药物活性成分，包括适宜的辅料，如增稠剂(可以选自环糊精、hpmc、mc和hpc等)。当然，辅料的用量可
根据药学上可接受的量确定，在此无需做具体限定。
62.本发明的又一具体实施方式中，提供上述无菌脱细胞基质温敏凝胶支架的制备方法，所述制备方法包括：将水相加入无菌脱细胞基质冻干纤维中，混匀后即得。
63.所述水相可以为灭菌注射用水，在实际生产过程中，可采用无菌注射器将水相即灭菌注射用水注入到无菌脱细胞基质冻干纤维。
64.本发明的又一具体实施方式中，所述制备方法还包括向其中加入细胞、药物以及非药物活性成分中的至少一种。
65.所述细胞、药物以及非药物活性成分在上述第一方面已经有明确的说明，在此不再赘述。
66.本发明的又一具体实施方式中，提供上述无菌脱细胞基质温敏凝胶支架在如下至少一种中的应用：
67.(a)药物释放或制备药物释放的产品；
68.(b)作为组织细胞支架或制备组织细胞支架；
69.(c)组织修复或制备组织修复的产品。
70.显然，上述产品可以为(外用)医疗产品。
71.以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
72.实施例1
73.用于脱细胞基质冻干纤维的制备：
74.将10g牛源腹膜细胞外基质、333mg胃蛋白酶和10g尿素加入1000g 1％柠檬酸溶液中，在反应釜中进行常温剪切搅拌酶解36h得到酶解液，其中剪切参数为30s/次，间隔2h，反应釜搅拌速度150r/min。
75.酶解液需按照顺序依次经过200目
→
0.45μm
→
0.22μm
→
0.1μm的聚砜滤膜实现快速无菌过滤，得到无菌过滤液，其中聚砜滤膜直径为47mm。
76.将无菌过滤液先经过辐照灭菌后的强酸性阳离子交换树脂(以苯乙烯-二乙烯苯共聚体为骨架，含水量42～48％，湿视密度0.73～0.88g/ml)去除尿素，再经过辐照灭菌后介孔sba-15分子筛去除胃蛋白酶，得到酸性脱细胞基质凝胶溶液。
77.将14.2ml 10mol/l的无菌氢氧化钠溶液加入酸性脱细胞基质凝胶溶液后，快速搅拌并调节ph至6.5-7.5，得到脱细胞基质凝胶溶液。
78.将脱细胞基质凝胶溶液经200目滤头过滤后直接无菌灌装至西林瓶内，然后将西林瓶放入冻干机内，设置冻干机温度为37℃并保持30min，得到脱细胞基质凝胶溶液凝胶化的固态物，然后启动-30℃预冻3h后，启动冻干程序(预冻：-20℃3.5h；主干燥：0℃12h；10℃2h；20℃1h；30℃1h)。程序结束后获得大孔径的无菌脱细胞基质冻干纤维，孔径为20～100μm。
79.用于温敏凝胶支架的制备：
80.按照之前无菌灌装的体积用量将相应体积的灭菌注射用水用无菌注射器注入到大孔径的无菌脱细胞基质冻干纤维中，迅速混匀后即得等渗的一种温敏凝胶支架。
81.对比例1
82.用于脱细胞基质冻干纤维的制备和用于温敏凝胶支架的制备：
83.与实施例1相比，区别仅在于不添加尿素。
84.对比例2
85.用于脱细胞基质冻干纤维的制备和用于温敏凝胶支架的制备：
86.与实施例1相比，区别仅在于在反应釜中不进行剪切。
87.对比例3
88.用于脱细胞基质冻干纤维的制备：
89.将10g牛源腹膜细胞外基质、333mg胃蛋白酶和10g尿素加入1000g0.01mol/l盐酸中，在反应釜中进行常温剪切搅拌酶解36h得到酶解液，其中剪切参数为30s/次，间隔2h，反应釜搅拌速度150r/min。
90.酶解液需按照顺序依次经过200目
→
0.45μm
→
0.22μm
→
0.1μm的聚砜滤膜实现快速无菌过滤，得到无菌过滤液，其中聚砜滤膜直径为47mm。
91.将无菌过滤液先经过辐照灭菌后的强酸性阳离子交换树脂(以苯乙烯-二乙烯苯共聚体为骨架，含水量42～48％，湿视密度0.73～0.88g/ml)去除尿素，再经过辐照灭菌后的介孔sba-15分子筛去除胃蛋白酶，得到酸性脱细胞基质凝胶溶液。
92.将1ml 10mol/l的无菌氢氧化钠溶液加入酸性脱细胞基质凝胶溶液后，快速搅拌并调节ph至6.5-7.5，得到脱细胞基质凝胶溶液。
93.将脱细胞基质凝胶溶液经200目滤头过滤后直接无菌灌装至西林瓶内，然后将西林瓶放入冻干机内，设置冻干机温度为37℃并保持30min，得到脱细胞基质凝胶溶液凝胶化的固态物，然后启动-30℃预冻3h后，启动冻干程序，程序结束后获得大孔径的无菌脱细胞基质冻干纤维。
94.用于温敏凝胶支架的制备：
95.按照之前无菌灌装的体积用量将相应体积的灭菌注射用水用无菌注射器注入到大孔径的无菌脱细胞基质冻干纤维中，迅速混匀后即得一种凝胶支架。
96.对比例4
97.用于脱细胞基质冻干纤维的制备和用于温敏凝胶支架的制备：
98.与实施例1相比，区别仅在于无菌过滤液不经过分子筛除杂。
99.测试例1酶解液的状态观察
100.通过目力观察酶解液的外观状态，对比各组酶解液中肉眼可见固形物的数量，可以判断出各组酶解情况。(表1，图2)
101.表1各组酶解液外观状态
102.分组酶解液状态实施例1无肉眼可见固形物对比例1有少量肉眼可见固形物对比例2有少量肉眼可见固形物，较对比例1多对比例3有少量肉眼可见固形物，较对比例1稍少对比例4无肉眼可见固形物
103.从表1的结果可知，实施例1和对比例4酶解的效果最好，各组使用相同的牛源腹膜细胞外基质和胃蛋白酶，并在反应釜中酶解的时间一致，造成酶解情况差别的原因在于制
备方法中的关键步骤差别。对比例1、对比例2、对比例3、对比例4与实施例1的差别分别在于没使用尿素、没有剪切酶解、使用盐酸溶液替代柠檬酸溶液、没有经分子筛除杂，由此对上述数据进行分析：通过对比实施例1、对比例4和对比例1可知，无菌脱细胞基质温敏凝胶制备中加入尿素可以提高原料酶解效率；通过对比实施例1和对比例2可知，无菌脱细胞基质温敏凝胶酶解时是否剪切原料对酶解情况有很大影响；通过对比实施例1和对比例3可知，无菌脱细胞基质温敏凝胶制备时使用1％柠檬酸溶液提供的酶解反应环境比盐酸溶液更适合。
104.测试例2过滤通量测定
105.通过对比各组按照相同顺序依次经过200目
→
0.45μm
→
0.22μm
→
0.1μm的聚砜滤膜实现快速无菌过滤所消耗的时间和过滤通量，可以判断出各组酶解情况，其中聚砜滤膜直径为47mm。
106.表2各组无菌过滤所消耗的时间和过滤通量
107.分组耗时(min)过滤通量(ml)实施例193960对比例1144796对比例2196477对比例3129813对比例4102955
108.从表2的结果可知，实施例1过滤通量最大且耗时最短，各组使用相同的牛源腹膜细胞外基质和胃蛋白酶，并在反应釜中酶解的时间一致，造成酶解情况差别的原因在于制备方法中的关键步骤差别。对比例1、对比例2、对比例3、对比例4与实施例1的差别分别在于没使用尿素、没有剪切酶解、使用盐酸溶液替代柠檬酸溶液、没有经分子筛除杂，由此对上述数据进行分析：通过对比实施例1、对比例4和对比例1可知，无菌脱细胞基质温敏凝胶制备中加入尿素可以提高原料酶解效率，进而提高能通过滤膜的酶解液体积；通过对比实施例1和对比例2可知，无菌脱细胞基质温敏凝胶酶解时是否剪切原料对酶解情况有很大影响，剪切便于减少肉眼可见固化物(未完全酶解的原料)堵塞滤膜的情况发生，可提高过滤通量；通过对比实施例1和对比例3可知，无菌脱细胞基质温敏凝胶制备时使用1％柠檬酸溶液提供的酶解反应环境比盐酸溶液更适合，进而可以提高能通过滤膜的酶解液体积。
109.测试例3胶原蛋白含量测定
110.按照yy/t 1511-2017胶原蛋白海绵附录a凯氏定氮法蛋白含量测定进行无菌过滤后实施例和各对比例酶解液的胶原蛋白含量检测。样品的消化：精确称取各组冻干前的脱细胞基质凝胶溶液样品1g左右(约相当于含氮量1.0mg～2.0mg胶原蛋白海绵)，记为m1，置于消化管中，加消化剂0.3g，加浓硫酸2.0ml，置电热消化灶上，在通风橱内消化至澄明，呈蓝绿色，继续消化60min。同时做空白消化对照。非蛋白氮的消化：精确称取各组冻干前的脱细胞基质凝胶溶液样品8g左右，记为m2，加水8ml浸泡30min，过滤。取溶液2ml，加水14ml，10％钨酸钠溶液2ml，硫酸溶液(1.86
→
100)2ml，摇匀，静置30min过滤，精密量取滤液5ml，置消化管中，按样品的消化中自加消化剂起进行消化。
111.测定方法为：取2％硼酸吸收液10ml置150ml锥形瓶内，将定氮仪冷凝管末端浸入硼酸吸收液内。将消化好的样品(m1)移入定氮管内，用少量蒸馏水洗涤消化管3～4次，将洗
涤液移入定氮管内，再加入50％氢氧化钠10ml，然后进行蒸馏。待接收液总体积约35ml～50ml，将冷凝管末端移出液面，让蒸汽继续冲约1min，用少量蒸馏水冲洗冷凝管末端后停止蒸馏。接收液用0.005mol/l硫酸滴定液进行滴定，至溶液由蓝绿色变为灰紫色，记录所消耗的硫酸滴定液体积v1。将消化好的样品(m2)移入定氮管内，重复以上蒸馏、滴定步骤，记录所消耗的硫酸滴定液体积v2。将空白消化对照移入定氮管内，重复以上蒸馏、滴定步骤，记录所消耗的硫酸滴定液体积v0，用空白试验进行校正。按下式计算样品中总氮含量：
[0112][0113]
注：式中w1代表样品中总氮含量，％；
[0114]v1
代表滴定样品(m1)消耗的硫酸滴定液体积，单位为毫升(ml)；
[0115]v0
代表空白消耗的硫酸滴定液体积，单位为毫升(ml)；
[0116]
c代表硫酸滴定液浓度，单位为摩尔每升(mol/l)；
[0117]
m1代表样品质量，单位为毫克(mg)；
[0118]
m0代表干燥失重，％。
[0119]
按下式计算样品中非蛋白氮含量：
[0120][0121]
注：式中w2代表样品中非蛋白氮含量，％；
[0122]v2
代表滴定样品(m2)消耗的硫酸滴定液体积，单位为毫升(ml)；
[0123]v0
代表空白消耗的硫酸滴定液体积，单位为毫升(ml)；
[0124]
c代表硫酸滴定液浓度，单位为摩尔每升(mol/l)；
[0125]
m2代表样品质量，单位为毫克(mg)；
[0126]
m0代表干燥失重，％。
[0127]
按下式计算样品中蛋白质含量：
[0128]
w＝(w
1-w2)
×f×
100
[0129]
注：式中w代表样品中蛋白质含量，％；
[0130]
f代表5.55，换算系数。
[0131]
表3各组胶原蛋白含量
[0132][0133][0134]
从表3的结果可知，实施例1和对比例4的蛋白含量较高，各组使用相同的牛源腹膜细胞外基质，造成蛋白含量差别的原因在于制备方法中的关键步骤差别。对比例1、对比例
2、对比例3、对比例4与实施例1的差别分别在于没使用尿素、没有剪切酶解、使用盐酸溶液替代柠檬酸溶液、没有经分子筛除杂，由此对上述数据进行分析：通过比较实施例1和对比例1可知，无菌脱细胞基质温敏凝胶制备中加入尿素可以提高酶解效率，增加膜的有效过滤量，进而提高脱细胞基质凝胶溶液中胶原蛋白含量；通过比较实施例1和对比例2可知，无菌脱细胞基质温敏凝胶酶解时是否剪切原料对酶解情况有很大影响，即若酶解相同时间，基质溶解量实施例1明显高于对比例2，所以实施例1膜的有效过滤量明显高于对比例2，进而会影响脱细胞基质凝胶溶液中胶原蛋白含量；通过对比实施例1和对比例3可知，无菌脱细胞基质温敏凝胶制备时使用1％柠檬酸溶液提供的酶解反应环境比盐酸溶液更利于缩短酶解时间和增加膜的有效过滤面积：因为相同酶解时间，柠檬酸-酶解液酶解基质能力强于盐酸-酶解液能力；对比例4的蛋白含量比实施例1相差不大：因为对比例4未进行胃酶和尿素的去除，由于溶剂体积很大，对冻干前脱细胞基质凝胶中蛋白含量影响很小。
[0135]
测试例4尿素残留量
[0136]
按照gb/t 36859-2018饲料中尿素含量的测定进行尿素残留量的检测。样品按照gb/t 20195制备试样，粉碎过0.45mm孔径筛，混合均匀，装入密封容器中保存。试样溶液制备：平行做两份试样，称取约1g试样(精确至0.0001g)，置于100ml容量瓶中，加入1g活性炭，加水约70ml，摇匀，放置10min，再分别加入5ml乙酸锌溶液和5ml亚铁氰化钾溶液，振荡提取30min。用水定容至刻度，摇匀，静置10min。用中速滤纸过滤，收集滤液。同时做试样提取溶液的试剂空白。标准曲线绘制：准确吸取浓度为1.0mg/ml的标准工作液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml(含尿素0mg、0.20mg、0.40mg、0.60mg、0.80mg、1.00mg、2.00mg、5.00mg)分别置于25ml比色管中，准确加入5ml磷酸盐缓冲液，立即加入5.0ml对二甲氨基苯甲醛(dmab)溶液，加水至刻度，摇匀，放置20min。用30mm光径比色皿，以0ml标准工作液的溶液(试剂空白)为参比，于420nm波长测定吸光度，以尿素含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
[0137]
试样测定：准确吸取试样溶液5ml～10ml于25ml比色管中，同标准工作液加入磷酸盐缓冲液和dmab试剂溶液显色，20min后，以试剂空白为参比，对试样溶液和试样提取溶液的试剂空白进行比色测定。测得试样及试样试剂空白的吸光度，在标准曲线上查得其尿素含量，通过计算，即得试样的尿素含量。试样中尿素含量w以质量分数计，数值以％表示，按式计算：
[0138][0139]
注：式中w代表样品中尿素含量，％；
[0140]
m1代表从标准曲线上查得的试样尿素含量，单位为毫克(mg)；
[0141]
m2代表从标准曲线上查得的试样提取溶液试剂空白的尿素含量，单位为毫克(mg)；
[0142]
m代表称取的试样质量，单位为克(g)；
[0143]
v代表试样提取液定容体积，单位为毫升(ml)；
[0144]v1
代表测定时移取试样提取液体积，单位为毫升(ml)。
[0145]
表4各组尿素残留量
[0146]
分组尿素残留量
实施例1未检出对比例1未检出对比例2未检出对比例3未检出对比例41.5％
[0147]
从表4的结果可知，除对比例1组没使用尿素、对比例4组没有经分子筛除杂外，各组的尿素残留量均未检出，说明经过辐照灭菌后特异性强酸性阳离子交换树脂分子筛后尿素均可基本上被除去。
[0148]
由此对上述数据进行分析：结合表2和表3可知，加入尿素还可以提高滤过通量，说明尿素的存在促进了酶解反应，可以减少肉眼可见固体(未完全酶解的原料)，进而提高了胶原蛋白的含量；虽然加入尿素对反应呈正向作用，但是酶解后未对尿素进行除杂会导致样品中尿素残留量偏高，存在潜在风险。
[0149]
测试例5胃蛋白酶残留量
[0150]
(1)按照《中华人民共和国药典》二部胃蛋白酶效价测定法进行制剂中的胃蛋白酶效价测定。盐酸溶液：取1mol/l盐酸溶液65ml，加水至1000ml。供试品溶液：取本品适量，精密称定，加盐酸溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.2～0.4单位的溶液。对照品溶液：取酪氨酸对照品适量，精密称定，加盐酸溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含0.5mg的溶液。
[0151]
测定法：取试管6支，其中3支各精密加入对照品溶液1ml，另3支各精密加入供试品溶液1ml，至37℃
±
0.5℃水浴中，保温5分钟，精密加入预热至37℃
±
0.5℃的血红蛋白试液5ml，摇匀，并准确计时，在37℃
±
0.5℃水浴中反应10分钟，立即精密加入5％三氯醋酸溶液5ml，摇匀，滤过，取滤液备用。另取试管2支，各精密加入血红蛋白试液5ml，置37℃
±
0.5℃水浴中保温10分钟，再精密加入5％三氯醋酸溶液5ml，其中1支加供试品溶液1ml，另1支加盐酸溶液1ml，摇匀，滤过，取滤液，分别作为供试品与对照品的空白对照，在275nm的波长处测定吸光度，算出平均值和按下式计算。
[0152][0153]
注：式中为对照品的平均吸光度；
[0154]
为供试品的平均吸光度；
[0155]ws
为每1ml对照品溶液中含酪氨酸的量，μg；
[0156]
w为供试品取样量，g；
[0157]
n为供试品稀释倍数。
[0158]
在上述条件下，每分钟能催化水解血红蛋白生成1μmol酪氨酸的酶量，为一个蛋白酶活力的单位。
[0159]
表5各组胃蛋白酶残留量
[0160][0161][0162]
从表5的结果可知，除了对比例4组由于没有经分子筛除杂导致样品中胃蛋白酶残留量偏高外，其余各组均为检出残留，说明经过辐照灭菌后特异性酪蛋白分子筛填料后胃蛋白酶均可基本被除去。由此对上述数据进行分析：结合表2和表3可知，由于对比例2组未进行剪切，造成较多胃蛋白酶未能深入原料中进行酶解反应，导致肉眼可见固体较多、酶解液过滤通量较小，但是即便如此，较多的胃蛋白酶经过辐照灭菌后特异性酪蛋白分子筛填料后均可被基本去除，说明胃蛋白酶残留量可通过经辐照灭菌后特异性酪蛋白分子筛填料过滤进行控制；结合表3和表5可知，对比例4中测得样品的蛋白含量里，有一部分是未经除杂残留的酶失活后形成的杂蛋白。
[0163]
测试例6冻干前酶解液凝胶化情况
[0164]
通过目力观察冻干前各组酶解液37℃，孵育30min条件下是否凝胶化。(表6，图4、5)
[0165]
表6各组37℃孵育凝胶化情况
[0166]
分组冻干前酶解液37℃是否凝胶化实施例1是对比例1是对比例2是对比例3否对比例4否
[0167]
从表6的结果可知，冻干前的各组酶解液在37℃，30min的条件下均凝胶化为固态物。由此对上述数据进行分析：对比例4中未除掉尿素，使产品无法实现凝胶化；对比例3用盐酸-酶溶液酶解，中和后酶解液不是等渗溶液，盐浓度偏低，使产品无法实现凝胶化，需要改进。对比例1和2与实施例1的差别不会影响无菌灌装后的脱细胞基质凝胶溶液的凝胶化条件，也不会影响后续冻干后获得大孔径的无菌脱细胞基质冻干纤维。
[0168]
测试例7无菌实验
[0169]
按照《中华人民共和国药典》1101无菌检查法中的直接接种法，选择金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌进行无菌检测。供试品制备：采用直接接种法，每个样品用3ml相应的无菌培养基(温度不超过45℃)复溶，每个样品分别加入30ml硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基中，各制备2管。阴性对照：分别取ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml，接种于30ml装量的硫乙醇酸盐流体培养基中，接种1管。阳性对照：另取一个含供试品的硫乙醇酸盐流体培养基管，再向该培养基中加入金黄色葡萄球菌菌悬液1ml，制备1管，培养14
天，其中硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃培养，胰酪大豆胨液体培养基20～25℃培养，阳性对照管培养5天。
[0170]
表7各组无菌实验结果
[0171]
分组是否无菌实施例1是对比例1是对比例2是对比例3是对比例4是
[0172]
从表7的结果可知，各组经过无菌灌装、冻干得到的无菌脱细胞基质冻干纤维的无菌检验结果均合格。由此对上述数据进行分析：无菌灌装系统可以保证最终产物的无菌状态，对比例1、对比例2、对比例3、对比例4与实施例1的差别不会影响最终产物——大孔径的无菌脱细胞基质冻干纤维的无菌状态。
[0173]
测试例8孔径大小
[0174]
将实施例1制备的样品固定于样品台上，真空镀金2min，随后将样品置于扫描电子显微镜下，加速电压1kv条件下分别观察况。根据孔径选取3个放大倍数扫描电镜图片，一张体现全貌(50
×
)，一张孔分布形态图(100
×
)，一张孔细节图(200
×
)选取合适的放大倍数测量孔径，选取20个孔，图中标注尺寸。
[0175]
从图6的结果可知，实施例1样品孔径基本在20-100μm范围内。证明制备的无菌脱细胞基质冻干纤维具有较大孔径。
[0176]
测试例9细胞增殖实验
[0177]
用实施例1制备的温敏凝胶包被96孔细胞培养板，同时以无凝胶包被的细胞培养板作为对照，接种原代培养的大鼠宫腔基底膜细胞，接种密度1000个/孔左右，设置5个平行孔；同时以不含细胞的dmem培养基作为空白对照组。放置培养箱(37℃、5％ co2)培养48h，每孔加入10μl cck-8溶液，置于37℃培养箱孵育3h后，吸取80μl液体加入新的96孔板内，使用酶标仪在450nm波长下检测吸光度值，计算细胞活力。
[0178]
从图7结果可知，显微镜下观察到有凝胶组细胞数量和状态明显优于无凝胶组，从图8结果可知，细胞在有凝胶试验组的吸光度值为1.004
±
0.002，在无凝胶试验组的吸光度值为0.757
±
0.013，有显著的统计学差异(p＜0.001)，说明实施例1工艺制备的凝胶可以有效促进细胞增殖；实验结果证明原代培养的大鼠宫腔基底膜细胞在二者的生长性能有显著性差异，说明有实施例1无菌凝胶的体外细胞增殖性能比无凝胶试验组好。此外，细胞增殖性反映该无菌凝胶无细胞毒性，生物安全性好。
[0179]
测试例10对大鼠子宫内膜修复性能试验
[0180]
选取8-10周龄(200-250g)的雌性sd大鼠，适应性饲养一周后，采用机械损伤法构建模型。大鼠具有双侧子宫，因此一侧用于空白对照，一侧用于构建模型。
[0181]
造模组：暴露右侧子宫，用刮宫器(1号长勺)，自卵巢至子宫方向，刮12次，缝合伤口，完成造模。
[0182]
凝胶修复组：暴露右侧子宫，用刮宫器(1号长勺)，自卵巢至子宫方向，刮12次，缝合伤口并注射0.2ml实施例1制备的凝胶。
[0183]
12d后分别取观察造模组和凝胶修复组大鼠右侧子宫，肉眼可见凝胶修复组右侧子宫内无明显凝胶残留，支持材料的可降解性能；对子宫损伤区域做病理切片，进行he染色，观察微观子宫壁修复情况。
[0184]
造模组结果：造模组子宫壁3层结构均较薄(图7)，约为0.26mm。高倍镜下(图8)，子宫内膜上皮较扁平(黑色箭头)，厚度约为0.146mm，部分上皮细胞含有胞质空泡，固有层、肌层和外膜内见少量的嗜中性粒细胞浸润。
[0185]
凝胶修复组结果：实施例1温敏凝胶修复后子宫壁的组织学层次结构均完整，无明显异常。子宫内膜厚度比造模组厚，约为0.275mm，子宫厚度约为0.6mm，说明本工艺制备的凝胶能够有效修复损伤的子宫内膜。
[0186]
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种无菌脱细胞基质温敏凝胶支架，其特征在于，其至少包括溶于水相中的无菌脱细胞基质冻干纤维；所述无菌脱细胞基质冻干纤维的重量百分含量为0.2-2％；所述脱细胞基质冻干纤维是利用非人哺乳动物的细胞外基质经0.5-2％柠檬酸-胃蛋白酶-尿素溶液酶解、无菌过滤、去除胃蛋白酶和尿素、中和以及冻干后获得。2.如权利要求1所述的无菌脱细胞基质温敏凝胶支架，其特征在于，所述非人哺乳动物的细胞外基质中，所述非人哺乳动物包括猪、牛、狗、羊、兔和鼠；进一步为(小)猪和(小)牛；所述细胞外基质包括非人哺乳动物的腹膜、肌腱、松质骨、小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、真皮基质、心包膜、脑膜、羊膜和脏器膜中任意一种或多种；进一步为腹膜。3.如权利要求1所述的无菌脱细胞基质温敏凝胶支架，其特征在于，所述非人哺乳动物的细胞外基质与0.5-2％柠檬酸-胃蛋白酶-尿素溶液的质量比为0.2-2:100，进一步为1:100；细胞外基质与胃蛋白酶的质量比为50～10:1；尿素溶液质量浓度为0.5％～2％。4.如权利要求1所述的无菌脱细胞基质温敏凝胶支架，其特征在于，所述酶解的具体方法包括：将上述酶解液至于酶解容器中进行常温剪切搅拌酶解；具体的，所述剪切为间歇式剪切，剪切参数为30s/次，每次剪切间隔时间为2h，搅拌速度80～150r/min；酶解时间控制为12-48h。5.如权利要求1所述的无菌脱细胞基质温敏凝胶支架，其特征在于，所述无菌过滤具体方法包括：依次经过200目
→
0.45μm
→
0.22μm
→
0.1μm滤膜实现无菌过滤，得到无菌过滤酶解液；所述滤膜材质为聚醚砜材质、聚砜材质、聚偏二氟乙烯；进一步为聚砜材质。6.如权利要求1所述的无菌脱细胞基质温敏凝胶支架，其特征在于，所述去除胃蛋白酶和尿素的具体方法包括：将无菌过滤酶解液经灭菌处理后的强酸性阳离子交换树脂去除尿素，再经过灭菌处理后的分子筛去除胃蛋白酶，得到酸性脱细胞基质凝胶溶液；所述中和的方法具体为向上述酸性脱细胞基质凝胶溶液中加入无菌碱液调节ph至6.5-7.5；进一步的，所述碱液为5-15mol/l氢氧化钠溶液。7.如权利要求1所述的无菌脱细胞基质温敏凝胶支架，其特征在于，所述冻干过程还包括灌装以及定型，具体的，将经中和后的脱细胞基质凝胶溶液经200目滤头后直接无菌灌装至容器内放入冻干机内，设置冻干机温度为33-38℃保持10min～1h使样液凝胶化为固态，然后启动-30℃预冻3h，启动冻干程序冻干后获得大孔径的无菌脱细胞基质冻干纤维；进一步的，所述滤头为不锈钢网状滤头，其与灌装管道直接相连。8.如权利要求1-7任一项所述的无菌脱细胞基质温敏凝胶支架，其特征在于，所述无菌脱细胞基质温敏凝胶支架还负载细胞、药物和/或非药物活性成分。9.权利要求1-8任一项所述无菌脱细胞基质温敏凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将水相加入无菌脱细胞基质冻干纤维中，混匀后即得；进一步的，所述水相为灭菌注射用水；进一步的，所述制备方法还包括向其中加入细胞、药物以及非药物活性成分中的至少一种。10.权利要求1-8任一项所述无菌脱细胞基质温敏凝胶支架在如下至少一种中的应用：
(a)药物释放或制备药物释放的产品；(b)作为组织细胞支架或制备组织细胞支架；(c)组织修复或制备组织修复的产品。

技术总结
本发明属于生物组织工程材料技术领域，具体涉及一种无菌脱细胞基质温敏凝胶支架及其制备方法和应用。本发明通过优化制备工艺，获得一种高生物活性及大孔径的无菌脱细胞基质冻干纤维，其能够与水相快速融合形成均一溶胶溶液，在溶胶状态时，还可自由加载各种不同性质的细胞或药物组合物，以溶液形式注射到需要治疗的区域后，在体温温度刺激下可以在用药部位发生溶胶-凝胶的相转变，用于相关疾病的治疗。同时，上述无菌脱细胞基质温敏凝胶支架制备方法简单，便捷，生产成本低，有助于大规模工业化生产，因此具有良好的实际应用之价值。因此具有良好的实际应用之价值。因此具有良好的实际应用之价值。


技术研发人员：高秀岩 董平格 郑红霞 于娜 高秀伟 姜红
受保护的技术使用者：山东隽秀生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.08.03
技术公布日：2023/10/15