一种石榴皮丙酮提取物及其提取方法和应用

1.本发明涉及一种石榴皮丙酮提取物及其提取方法和应用。


背景技术：

2.鞣质(tannins)，又称为单宁，它是植物中几乎所有部分都存在的多酚次生代谢产物，因此存在于大多数动物饮食中。科学证据表明，在牛和家禽中使用鞣质改善营养和动物健康的潜力很大。鞣质虽然曾经通常被认为是单胃动物的抗营养因子，这是由于可水解鞣质易被消化道内的酯分解，由此产生的产物很容易被尿液吸收和排泄，被吸收的产物可能引起抗营养作用。据报道，饲粮中添加没食子酸会降低雏鸡饲料的适口性和生长率。但现在的研究表明，其有益或有害的特性取决于鞣质性质(即植物来源、化学结构和收敛性)和动物因素(即动物种类、生理状态和饮食组成)以及剂量和配方等给药因素。
3.近年来，许多报道表明，来自不同植物来源的适度鞣质浓度不仅可以改善单胃农场动物的营养，而且可以改善包括家禽在内的健康状况。此外，还发现含有富含多酚的植物提取物可以改善生长猪的增重/饲料比。在家禽中表明，使用板栗提取物对生长性能有积极影响。
4.国外科学研究表明，酚类化合物可提高肉鸡的生长性能，然而，其他鞣质制剂无法提高生长性能，但在鸡生理生产方面能产生不同的有益效果，包括推迟肉脂氧化、提高蛋白质消化率和饲料转化、增强肠道健康和微生物生物多样性，以及提高克服持续热应激有害影响的能力。大量的体外和体内研究证实了鞣质对多种肠道病原体的活性，包括蠕虫、球虫，病毒和细菌。
5.石榴作为近年来我国重点推广和发展的水果之一，近年来其所种植的面积持续增长和扩大，然而，石榴皮作为占据总重量20％～30％的组成部分，大多数却直接被遗弃，造成了严重的自然资源浪费，如何挖掘和开发利用这些石榴皮中的鞣质，是很有研究意义的一个研究项目。


技术实现要素：

6.为了确定石榴皮鞣质提取的最佳工艺条件，本发明通过hplc-esi-q-tof-ms技术对石榴皮丙酮提取物中的成分进行分析研究。质谱条件：以esi离子源作为裂解源，毛细管电压2.5kv，锥孔电压35v，源温度120℃，气帘气40l/h，雾化器6.5bar，脱溶剂气温度350℃，脱溶剂气800l/h。在单因素实验的基础上，通过正交设计实验确定石榴皮鞣质提取的最佳工艺条件。分析结果表明：石榴皮丙酮提取物中含27种以上化合物，其中[2-(叔丁氧基)-4，6-二叔丁基苯基]氧化酰含量最高，没食子酸含量最低；石榴皮鞣质提取的最佳工艺条件为：采用水浴回流提取法，提取温度50℃，丙酮的质量浓度为75％，料液比1:10(g:ml)，提取持续时间0.5h。每10g石榴皮可提取鞣质0.9209g。应用hplc-esi-q-tof-ms技术能够快速准确得发现石榴皮丙酮提取物中的各种成分，水浴回流提取石榴皮鞣质工艺简单、省时、可行。
附图说明
[0007]
图1为石榴皮丙酮提取物lc-ms总离子流图；
[0008]
图2为没食子酸标准曲线；
[0009]
图3为石榴皮粉鞣质含量随提取溶剂丙酮的浓度的变化图；
[0010]
图4为石榴皮粉提取得到得鞣质含量随料液体的变化图；
[0011]
图5为石榴皮粉鞣质含量随提取时间的变化图。
具体实施方式
[0012]
为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。
[0013]
1.材料方法
[0014]
1.1石榴皮的丙酮提取物化学成分分析
[0015]
实验仪器与试药
[0016]
表1实验仪器
[0017][0018][0019]
表2实验试药
[0020][0021]
供试品溶液的制备
[0022]
精密称量10g石榴皮粉倒入圆底烧瓶中，加入10倍量的质量浓度为70％的丙酮，水浴回流1h，待恢复至室温后，过滤，弃去初滤液，取续滤液，挥干溶剂，即得。
[0023]
对照品溶液的制备
[0024]
精密称取伪石榴皮碱、没食子酸、柯里拉京、石榴皮鞣素、儿茶素、原花青素、没食子酸乙酯、原花青素b2对照品适量于5ml容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀，即得浓度为1μg/ml
对照品溶液。
[0025]
分析条件
[0026]
色谱条件：色谱柱：acquity uplc beh c18，(2.1x100mm，1.7pm)流动相：乙腈：水(均含0.1％甲酸)
[0027]
质谱条件：
[0028]
电离方式：正负离子扫描模式；毛细管电压：2.5kv；锥孔电压：35v；源温度：120℃；气帘气：40l/h；雾化器：6.5bar；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气：800l/h。
[0029]
1.2石榴皮鞣质提取的最佳工艺条件
[0030]
总鞣质含量的测定
[0031]
对照品溶液的制备：精密称取没食子酸对照品50mg，置100ml棕色容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。再精密量取5ml，置于50ml棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。即得每1ml中含没食子酸0.05mg。
[0032]
测定波长的选择：精密量取没食子酸对照品溶液2ml，置于25ml棕色容量瓶中，加入福林酚试液1ml，再加入水10ml，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，避光放置30min，以相应试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法，在400～760nm的波长范围进行扫描，结果表明在波长为760nm处有最大吸光度，故选定760nm为没食子酸的检测波长。
[0033]
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0ml、0.2ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml，分别置于25ml棕色容量瓶中，各加入福林酚试液1ml，再分别加入12ml、11.8ml、11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml水，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，避光放置30min，以相应的试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法，在760nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
[0034]
供试品溶液的制备：称取10g石榴皮粉于圆底烧瓶中，加入相应量的提取溶剂进行水浴回流，放冷，摇匀，挥干溶剂，加水250毫升溶解，摇匀，过滤，弃去初滤液50ml，取续滤液10ml，置100ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
[0035]
测定方法：
[0036]
总酚精密量取供试品溶液2ml于25ml棕色容量瓶中，找标准曲线制备项下的方法，自“加入福林酚试液1ml起”，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量，计算，即得。
[0037]
不被吸附的多酚精密量取供试品溶液25ml，加至已盛有干酪素0.6g的100ml具塞锥形瓶中，密塞，置30℃恒温水浴中保温1h，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2ml，置25ml棕色容量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加入福林酚试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量，计算，即得。
[0038]
计算：分别按照标准曲线法计算总酚量和不被吸附的多酚量，两者之差为鞣质含量。即：鞣质含量＝总酚量-不被吸附的多酚量；注：测定时，同时进行干酪素吸附空白实验，计算扣除空白值。
[0039]
提取方法的筛选
[0040]
冷浸法：精密称取石榴皮粉10g倒入具塞锥形瓶中，加入100ml质量浓度为75％的乙醇，室温放置24h，过滤，挥干溶剂，测量计算其中鞣质含量。
[0041]
回流提取法：精密称取石榴皮粉10g倒入圆底烧瓶中，加入100ml质量浓度为75％的乙醇，50℃水浴回流1h，放冷，过滤，挥干溶剂，测量计算其中鞣质含量。
[0042]
超声提取法：精密称取石榴皮粉10g倒入具塞锥形瓶中，加入100ml的质量浓度为75％的乙醇，50℃进行超声波提取0.5h，精密称取石榴皮粉10g倒入具塞锥形瓶中，加入100ml质量浓度为75％的乙醇，50℃超声提取0.5h，放冷，过滤，挥干溶剂，测量计算其中鞣质含量。
[0043]
提取溶剂的筛选：
[0044]
乙醇：精密称取石榴皮粉10g倒入圆底烧瓶中，加入100ml质量浓度为75％的乙醇，50℃水浴回流1h，放冷，过滤，挥干溶剂，测量计算其中鞣质含量。
[0045]
丙酮：精密称取石榴皮粉10g倒入圆底烧瓶中，加入100ml质量浓度为75％的丙酮，50℃水浴回流1h，放冷，过滤，挥干溶剂，测量计算其中鞣质含量。
[0046]
单因素试验
[0047]
首先确定了提取方法和提取溶剂后，再通过单因素试验初步确定提取溶剂的浓度、料液比、提取时间这几个因素的影响范围。称取石榴皮粉10g，用25％丙酮溶液，料液比1:5，回流提取0.5h。当研究某一因素时，其他条件保持不变，测量其鞣质含量。
[0048]
正交试验
[0049]
正交实验设计：根据单因素试验的结果，在提取的温度条件下固定为50℃的情况下，对提取溶剂浓度(a)、料液比(b)、提取时间(c)3个主要影响因素进行综合考察研究。见表3，取石榴皮粉末10g，按l9(34)工作安排表制备9份供试品溶液，见表4，按照上面的总鞣质含量的测定的方法测定石榴皮中的鞣质含量。
[0050]
表3正交实验设计
[0051][0052]
表4正交实验设计安排表
[0053]
[0054]
2.结果与分析
[0055]
石榴皮丙酮提取物成分分析结果
[0056]
根据图1上显示的峰所得到的精确化合物分子质量信息，通过质谱分析软件计算其中可能的元素成分，将其中可能出现的元素成分组成和化合物的分子质量输入sci-finder和中国天然产物化学成分数据库中查找与其有关的化学成分，根据二级质谱图中得到的化合物离子碎片推断出该化合物具有的结构，淘汰不可能存在于石榴皮中的疑似化合物成分，将剩下的疑似化合物成分与前人研究的结果进行比对，筛选最有可能的疑似化合物，初步推断石榴皮丙酮提取物中的化合物。实验结果见图1及表5，由表5可见，石榴皮丙酮提取物中的成分有27种，它们的含量由高到低依次为：[2-(叔丁氧基)-4，6-二叔丁基苯基]氧化酰(1)、(9z，12e)-十八酸-9，12-二烯酸(2)、(9e，12e)-十八烷基-9，12-双烯酸酯(3)、6-十八碳烯酸(6e)-(4)、鞣花酸(5)、2-癸酸己酯(6)、安石榴苷(7)、2-{双环[2.2.1]庚坦-2-基}-1，3-二(叔丁氧基)-1，3-二氧丙烷-2-酰胺(8)、5-二烯-1-基，10-羧基-1-(1-庚-1-基)-2，3-二羟基，(5e)-(9)、石榴皮鞣素(10)、2，5-癸二烯-1-基，10-羧基-1-(1，2-二羟基庚基)-，(5z)-(11)、柯里拉京(12)、urs-12-en-28-oic酸，2，3，23-三羟基，离子(1-)，(2，3，4)-(9ci)(13)、2，4，7-十二碳三烯-1-氧基，12-羧基-1-戊基-，(7z)-(14)、20(29)-28-羽扇酸，3，23-二羟基，离子(1-)，(3，4)-(15)、[2，6-二叔丁基-3-(1，4-二氧六环-2-基)-4-氧环己烷-1，5-二烯-1-基]氧化酰基(16)、2，3-o-六羟基二苯甲酰基-d-葡萄糖苷(17)、urs-12-en-28-oic酸，2，3，19-trihydroxy-，ion(1-)，(2，3，18)(18)、[(8e，11z)-1-羧基庚-8，11-二烯-7-基]氧化酰基(19)、(1e)-10-羧基-1-(3-戊氧基-2-基)-1-烯-3-基(20)、(1e)-1-[3-(7-羧基庚基)氧杂伊朗-2-基]oct-1-en-3-基(21)、5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸(22)、3-[3，5-二甲氧基-1-(甲氧羰基)环己烷-2，5-二烯-1-基]丙基(23)、对己氧基苯酚(24)、槲斗酸双内酯(25)、表儿茶素(26)、没食子酸(27)。
[0057]
石榴皮丙酮提取物中的成分类别复杂，按照化合物含量由高到低可以分为以下几类：
[0058]
(1)单宁类化合物：鞣花酸、安石榴苷、石榴皮鞣素、柯里拉京、2，3-o-六羟基二苯甲酰基-d-葡萄糖苷、槲斗酸双内酯、没食子酸；
[0059]
(2)黄酮类化合物：表儿茶素；
[0060]
(3)酸类化合物：(9z，12e)-十八酸-9，12-二烯酸、6-十八碳烯酸(6e)-、5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸；
[0061]
(4)酰类化合物：[2-(叔丁氧基)-4，6-二叔丁基苯基]氧化酰、2-{双环[2.2.1]庚坦-2-基}-1，3-二(叔丁氧基)-1，3-二氧丙烷-2-酰胺、[2，6-二叔丁基-3-(1，4-二氧六环-2-基)-4-氧环己烷-1，5-二烯-1-基]氧化酰基、[(8e，11z)-1-羧基庚烷-8，11-二烯-7-基]氧化酰基；
[0062]
(5)酯类化合物：(9e，12e)-十八烷基-9，12-双烯酸酯、2-癸酸己酯；
[0063]
(6)苯酚类化合物：对己氧基苯酚。
[0064]
还有部分化合物暂时无法辨别属于哪一类别，后续需要根据功能团与碳链之间的排列顺序进行确定。此外，质谱图中尚有几个响应较高的峰未能鉴别出来，接下来需要进行红外光谱分析及核磁共振图谱解析才能确定。
[0065]
表5石榴皮丙酮提取物中含有的成分以及疑似化合物名称(-esi)
[0066]
[0067]
[0068][0069]
石榴皮鞣质提取最佳工艺条件结果
[0070]
鞣质含量测定法结果
[0071]
没食子酸标准曲线的制备
[0072]
实验结果可参见图2，计算所得的回归方程y＝0.5637x-0.0435，相关系数r2＝0.9975。结果显示，没食子酸含量和吸光度在od760nm值0.16-0.43之间呈良好的线性关系。
[0073]
精密度试验结果
[0074]
精密量取没食子酸对照品溶液2.0ml，按2.2.1项下的方法测定。连续测定6次，精密度值以其相对标准偏差rsd来估计，实验结果见表6，rsd为0.5069％。
[0075]
表6精密度实验结果
[0076][0077]
稳定性试验结果
[0078]
精密量取供试品溶液2.0ml，按总鞣质含量的测定的方法对其进行测定。分别在15、30、45、60、90、120、240、360min时测定样品的吸光度，实验结果见图表7，可知该样品在6h内的吸光度数值随时间的变化而减小，因此，应在30～60分钟内进行测定。
[0079]
表7稳定性实验结果
[0080][0081]
重复性试验结果
[0082]
精密称取石榴皮粉共6份，按供试品溶液法操作，按总鞣质含量的测定的方法进行测定，重复性以其rsd来估计，实验结果见表8，相对标准偏差(rsd)为0.4430％。
[0083]
表8重复性试验结果
[0084][0085][0086]
回收率试验结果
[0087]
精密称取已知含量的石榴皮粉9份，分别加入适量的对照品，按供试品溶液法操作，各份按2.2.1项下的方法进行测定，实验结果见表9，回收率为90.2688％，rsd为2.9533％。
[0088]
表9回收率实验结果
[0089][0090]
提取方法的筛选
[0091]
试验结果见表10，以50℃水浴回流1h提取最完全。
[0092]
表10提取方法的筛选结果
[0093][0094]
提取溶剂的筛选
[0095]
试验结果见表11，以丙酮为溶剂提取最完全。
[0096]
表11提取溶剂的筛选结果
[0097][0098]
单因素试验
[0099]
料液比范围的确定
[0100]
试验保持提取溶剂浓度25％，提取时间0.5h，不变，改变料液比，从石榴皮粉提取得到得鞣质含量的变化见图3。从图中可以看到，随着料液比的上升，鞣质的提取量呈逐渐下降趋势。因此，从实验结果来看，料液比的最佳条件为1：5。
[0101]
表12料液比范围的确定结果
[0102][0103]
提取时间范围的确定
[0104]
试验保持提取溶剂浓度25％，料液比1：5不变，改变提取时间，石榴皮粉鞣质含量的变化见图4。从图中可以看到，随着提取时间的上升，鞣质的提取量呈先上升后下降趋势。因此，从实验结果来看，提取时间的最佳条件为1h。
[0105]
表13提取时间范围的确定结果
[0106][0107]
提取溶剂浓度范围的确定
[0108]
试验保持提取时间0.5h，料液比1：5不变，改变提取溶剂浓度，石榴皮粉鞣质含量的变化见图5。从图5中可以看到，随着有机溶剂丙酮浓度的上升，鞣质的提取量呈现先上升后下降的趋势。因此，从实验结果来看，丙酮浓度的最佳条件为50％。
[0109]
表14提取溶剂浓度范围的确定结果
[0110][0111]
正交设计实验结果
[0112]
表15正交试验结果
[0113][0114][0115]
表16鞣质得率方差分析
[0116][0117]
对表15数据进行处理，得到表16，以石榴皮鞣质含量作为评估指标，从数据中我们可以直观地看出，影响石榴皮提取鞣质含量的因素大小顺序是c》a》b，即提取时间对石榴皮鞣质含量提取的影响最大，提取溶剂浓度其次，料液比的影响较小，且石榴皮鞣质提取的最佳工艺选择方法为a3b3c1，即提取溶剂浓度为75％，料液比1:10，提取时间0.5h。
[0118]
验证实验
[0119]
精密称取石榴皮粉10g，按最佳工艺条件进行验证实验，按前述总鞣质含量测定方法进行测定，计算得石榴皮粉鞣质含量为2.9468μg/ml，与正交实验结果一致。10g石榴皮可
提取0.9209g鞣质。
[0120]
讨论
[0121]
关于应用高效液相色谱质谱联用技术进行成分分析的问题
[0122]
高效液相色谱质谱联用技术的优势和局限
[0123]
hplc-ms联用技术是科研中常用的定性定量分析的有效手段之一。石榴皮丙酮提取物中罕有的化学成分种类众多，结构复杂且含量相对较低，若直接采用传统的分离和鉴定方法，难度较大且得出的结果可能不理想。而利用先进的hplc-ms联用技术进行样品分析既快捷方便，高效快速，灵敏度也较高，与传统的气相色谱法相比，液相色谱法在应用上不受到分析样品的挥发性和化学热稳定性以及相对分子质量的要求所限制，只需要对样品进行简单的预处理即可。当然，也存在一定的局限，如：固定相由聚苯乙烯与二乙烯基苯交联而成时，可以承受的压力较低，当固定相的表面为多孔活性物质如硅胶、氧化铝等时，多孔层薄，进样量受限制。为了克服这些局限，将固定相以二氧化硅为基质，可以承受较高的压力，固定相的表面改为全多孔型-由硅胶颗粒聚集而成，柱容量变大，效率高，分离效果更好。
[0124]
本研究结果与前人研究的差异及价值
[0125]
周本宏等的研究表明，通过hplc-esi-ms技术初步鉴定出石榴皮丙酮提取物中含有没食子酸、安石榴磷(及石榴皮鞣素)、安石榴苷、鞣花酸等5类化合物。刘延泽等的研究表明，利用化学方法和波谱分析确定了石榴皮中含有2，3-o-六羟基二苯甲酰基-d-葡萄糖苷、逆没食子酸、石榴皮亭b等5类化合物。本实验通过hplc-ms联用技术，采用esi负离子检测模式，对石榴皮丙酮提取物进行成分分析，并通过对二级质谱离子碎片的分析得到27种疑似化合物，其中部分与上述前人研究结果相似，部分化合物尚未查到报导，可能是首次从石榴皮丙酮提取物中分离出来的化合物，需进一步查阅文献方能确定。
[0126]
本实验采用回流提取法对石榴皮中鞣质进行提取，并通过单因素试验、正交试验确定了石榴皮鞣质提取的最佳工艺条件，本研究每10g石榴皮可提取0.9209g鞣质，计算可得石榴皮鞣质提取率为9.21％。
[0127]
关于鞣质提取工艺的问题
[0128]
参考以往文献，提取方式、提取的溶剂种类、提取的溶剂浓度、提取的时间、提取次数、料液比等多种影响因素都有可能对于鞣质的提取效果产生交叉影响。虽然一般采用甲醇、乙醇、丙酮作为鞣质的提取溶剂，但本次实验考虑到甲醇对人体的毒性较大，且后期可能存在残留问题，故在此研究中不考虑用甲醇作为提取溶剂。
[0129]
根据文献可知，提取次数对鞣质的提取率影响较大，但本次研究中的石榴皮药材为粉末状，提取过滤后的粉末会粘在滤纸上，造成后期的提取结果误差较大，不具有实验意义。故在此研究中单因素实验不考虑提取次数对石榴皮提取率的影响。
[0130]
关于鞣质测定方法的问题
[0131]
参考以往文献我们可以发现关于鞣质的测定方法很多，其中最常见的方法是皮粉法、干酪素法、高锰酸钾法等，从节约时间、节省成本和减少误差的角度出发，本次研究选择了采用干酪素法进行鞣质的测定。但从相关文献中可知，干酪素法在实际应用中仍然存在着检测得鞣质的含量明显较差或偏低的情况，原因是不同批次生产的干酪素，干扰实验物质含量有明显差异，导致空白对照值有明显的差异，为了减小误差，在实验过程中，应该采
用同一批次的干酪素。
[0132]
结论
[0133]
1、本次研究通过高效液相色谱质谱联用技术对石榴皮丙酮提取物进行成分分析，得到27种疑似化合物以及10种尚不明确的化合物。
[0134]
2、本实验采用分光光度法检测石榴皮鞣质，通过单因素试验、正交实验确定了石榴皮鞣质提取的最佳工艺条件为：采用水浴回流提取法，提取温度50℃，提取溶剂丙酮浓度75％，料液比1：10(g:ml)，提取时间0.5h。
[0135]
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种石榴皮丙酮提取物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：采用水浴回流提取法，精密称取石榴皮粉于容器中，加入质量浓度为75％的丙酮，料液比1:10(g:ml)；50℃水浴回流0.5h，放冷，过滤，挥干溶剂。2.如权利要求1所述的提取方法得到的石榴皮丙酮提取物。3.石榴皮丙酮提取物在鸡饲料添加剂中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，石榴皮丙酮提取物的提取方法，包括如下步骤：采用水浴回流提取法，精密称取石榴皮粉于容器中，加入质量浓度为75％的丙酮，料液比1:10(g:ml)；50℃水浴回流0.5h，放冷，过滤，挥干溶剂。

技术总结
本发明公开了一种石榴皮丙酮提取物及其提取方法和应用。本发明中石榴皮粉末采用水浴回流提取法，提取温度50℃，丙酮的质量浓度为75％，料液比1:10(g:mL)，提取持续时间0.5h。每10g石榴皮可提取鞣质0.9209g。应用HPLC-ESI-Q-TOF-MS技术能够快速准确得发现石榴皮丙酮提取物中的各种成分，水浴回流提取石榴皮鞣质工艺简单、省时、可行。可行。可行。


技术研发人员：彭新宇 康桦华 张妍璘 周廷斤 徐志宏 唐兴刚 田雅 向蓉 袁明贵 尹烨华
受保护的技术使用者：广东省农业科学院动物卫生研究所
技术研发日：2023.07.31
技术公布日：2023/10/15