一种具有抗氧化活性的中药组合物及其制备方法与流程

1.本发明涉及中药组合物制备技术领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的中药组合物及其制备方法。


背景技术：

2.抗氧化是指抗氧化自由基的简称，英文anti-oxidant。抗氧化是一个比较广泛的人体代谢物质变化的概念，在机体组织中皆有自由基代谢发生，当自由基产生过多(剧烈运动时)或机体清除能力降低时，自由基可造成许多生物分子如蛋白质、核酸的损伤，引起超氧化反应，导致细胞结构和功能的广泛性损害。抗氧化包括了过氧自由基清除、超氧自由基清除、羟自由基清除等内容，它们通过各自的作用途径，维持着体内自由基产生和清除的动态平衡。抗氧化就是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质，其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。人体在不可避免地产生自由基的同时，也在自然产生着抵抗自由基的抗氧化物质，以抵消自由基对人体细胞的氧化攻击。
3.目前，亟需研发一种活性高、副作用少，同时也无需额外添加辅助性药物的纯天然抗氧化中药组合物。


技术实现要素：

4.本发明从人群天然抗氧化需求问题出发，以dpph、abts、sorac抗氧化高通量筛选模型为关键手段，筛选天然成分，从而获得具有高抗氧化活性的玫瑰花、西青果、肉桂、丁香中药组合物。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
6.一种具有抗氧化活性的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
7.(1)提取：按照质量百分比分别称取肉桂10％-15％、玫瑰花20％-25％、西青果25％-30％和丁香35-40％药材进行粉碎处理，添加10-15倍35％乙醇溶液，在450-500w超声提取2-3次，每次60-80min，提取结束后冷却至室温，过滤，合并滤液；
8.(2)浓缩干燥：将上述过滤后的提取液减压真空浓缩干燥；
9.(3)制备纯化：取上述提取物加入乙醇溶液进行溶解，上ab-8树脂柱吸附2小时，利用6倍超纯水洗脱2小时，使用6倍低浓度乙醇溶液洗脱2小时，使用高浓度乙醇溶液洗脱2小时，收集洗脱液；
10.(4)浓缩干燥：将上述收集的35％乙醇和超纯水洗脱液减压真空浓缩干燥。
11.肉桂(cinnamomum cassia presl)是樟科樟属树种，主要分布在我国的广东、广西等省区。肉桂的化学成分包括多糖类化合物、倍半萜、二萜及糖苷类化合物、黄酮类化合物等，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、加强消化功能以及镇痛等作用。
12.玫瑰(rosa rugosa thunb)是小型的落叶灌木，茎高且生长刺和细毛，叶脉明显折邹。花期不同，主要在4～7月开放。花色多为赤色与深红色，少数为白色或黄色。玫瑰花中含
有大量的多酚类、多糖和黄酮类，还含有大量的膳食纤维、糖、氨基酸、亚麻酸等，具有较高的营养价值和功能活性。
13.西青果又称“藏青果”，为使君子科植物诃子(terminalia chebula retz.)的干燥幼果，在中医临床中作为清热解毒药用于复方配伍治疗肺炎、喉炎、扁桃体炎、咽炎、细菌性痢疾等症。西青果中鞣质与酚酸类成分含量丰富，主要化学成分为诃子酸、诃黎勒酸及没食子酸等。
14.丁香(syzygium aromaticum)为桃金娘科(myrtales)蒲桃属(syzygium)植物，系常绿乔木，是原产于印度尼西亚的一种香料。丁香含有多种化学成分，具有抗菌消炎、解热镇痛、抗癌、抗氧化、抗抑郁、降糖等功效，在食品、香精香料、医药等行业具有多种应用。
15.优选地，步骤(2)和步骤(4)的干燥温度为45-50℃。
16.优选地，步骤(3)具体为：取上述提取物加入6倍50vol％乙醇溶液进行溶解，上ab-8树脂柱吸附2小时，利用6倍超纯水洗脱2小时，使用6倍35vol％乙醇溶液洗脱2小时，使用95vol％乙醇溶液洗脱2小时，收集洗脱液。
17.优选地，原料为：肉桂10％、玫瑰20％、西青果30％和丁香40％。
18.优选地，原料为：肉桂12％、玫瑰22％、西青果28％和丁香38％。
19.优选地，原料为：肉桂15％、玫瑰25％、西青果25％和丁香35％。
20.作为本发明的另一发明目的，本发明还公开了采用上述方法制备得到的具有抗氧化活性的中药组合物。
21.本发明具有以下有益效果：
22.1、工艺简单，副作用小：与其他抗氧化产品相比，本组合使用的均为天然产物的组合，无需进行合成与结构修饰，减少人体副作用的产生。同时也无需额外添加辅助性药物，保持了成分来源的纯天然。
23.2、高抑制率：与其他的抗氧化产品相比，本发明的中药组合物利用dpph、abts、sorac抗氧化高通量筛选实验，发现其有较好的自由基抑制作用，抗氧化效果明显。
具体实施方式
24.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.以下实施例按照如下方法制备抗氧化中药组合物：
26.(1)提取：按照质量百分比分别称取肉桂10％-15％、玫瑰花20％-25％、西青果25％-30％和丁香35-40％药材进行粉碎处理，添加10-15倍35％乙醇溶液，在450-500w超声提取2-3次，每次60-80min，提取结束后冷却至室温，过滤，合并滤液。
27.(2)浓缩干燥：将上述过滤后的提取液减压真空浓缩干燥，温度为45-50℃。
28.(3)制备纯化：取上述提取物加入6倍50％乙醇进行溶解，上ab-8树脂柱吸附2小时，利用6倍超纯水洗脱2小时，使用6倍35％乙醇洗脱2小时，使用95％乙醇洗脱2小时，收集洗脱液。
29.(4)浓缩干燥：将上述收集的35％乙醇和超纯水洗脱液减压真空浓缩干燥，温度为
45-50℃。
30.(5)对制备得到的中药组合物进行dpph、abts、sorac抗氧化高通量筛选：
31.1、基于dpph(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基是合成的以氮为中心的稳定自由基，因氮原子上不成对的电子在517nm处有一强吸收峰(其醇溶液呈深紫色)，当有抗氧化剂存在时，dpph(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)捕捉一个电子与游离电子配对，而使其吸收逐渐消失，紫色褪去，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用酶标仪等检测dpph(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基与试样反应后吸光值的变化，可检定样品清除自由基能力。2、abts是一种过氧化氢酶的底物，abts/abts+的氧化还原电位为0.68v，容易发生电子转移，生成稳定的绿色自由基abts+
·
。配置的abts溶液在过二硫酸钾的催化下发生电子转移，生成稳定的abts+
·
自由基。检测样品对abts自由基的清除能力(自由基被清除，数量减少会使溶液颜色会变浅，从而导致734nm下吸光度降低，由此可以来判断样品清除abts+
·
自由基的能力。3、黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的催化作用下产生超氧自由基，将二氢乙锭氧化生成2-二氢乙锭，荧光强度增加。当抗氧化剂存在时，可与二氢乙锭竞争氧化剂，抑制由自由基引起的荧光变化，减缓其荧光增加的速度，抑制程度反映了它对自由基的抗氧化能力。
32.实施例1
33.一种具有抗氧化活性的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
34.(1)提取：按照质量百分比分别称取肉桂10％、玫瑰20％、西青果30％和丁香40％药材进行粉碎处理，添加10倍35％乙醇溶液，在450w超声提取2次，每次60min，提取结束后冷却至室温，过滤，合并滤液。
35.(2)浓缩干燥：将上述收集的馏分减压真空浓缩干燥，温度45℃；
36.(3)制备纯化：制备纯化：取上述提取物加入6倍50％乙醇进行溶解，上ab-8树脂柱吸附2小时，利用6倍超纯水洗脱2小时，使用6倍35％乙醇洗脱2小时，使用95％乙醇洗脱2小时，收集洗脱液。
37.(4)将上述收集的35％乙醇和超纯水洗脱液减压真空浓缩干燥，温度45℃。
38.(5)对制备得到的中药组合物进行dpph抗氧化高通量检测：配置dpph溶液使其在96孔板中的吸光度为0.7
±
0.02(100微升dpph+100微升乙醇)，将样品用乙醇稀释1000倍分为四组，分别加入10、20、30、40μl于孔板中，用乙醇补至100μl，每组做3组平行样，在向每个孔中加入100μl dpph溶液后迅速放入酶标仪中进行测试。得到其ic
50
值为0.033mg/ml(ic
50
：以实验所得的抗氧化剂浓度为横坐标，清除率为纵坐标，然后计算线性回归方程。将清除率50％代入方程中求得对应的横坐标值即为ic
50
值)。
39.(6)对制备得到的中药组合物进行abts抗氧化高通量检测：用磷酸二氢钠和磷酸氢二钾配置成0.75m ph＝7.4的缓冲液，将abts溶液和过二硫酸钾反应18h后稀释至其在96孔板中的吸光度为0.7
±
0.02(100微升abts反应液+100微升缓冲液)，将样品用缓冲液稀释1000倍分为四组，分别加入10、20、30、40μl于孔板中，用缓冲液补至100μl，每组做3组平行样，在向每个孔中加入100μl abts反应液后迅速放入酶标仪中进行测试。得到其ic
50
值为0.0133mg/ml(ic
50
：以实验所得的抗氧化剂浓度为横坐标，清除率为纵坐标，然后计算线性回归方程。将清除率50％代入方程中求得对应的横坐标值即为ic
50
值)。
40.(7)对制备得到的中药组合物进行sorac抗氧化高通量检测：用磷酸二氢钠、磷酸
氢二钾、二乙烯三胺五乙酸配置成0.75m ph＝7.4的缓冲液，配置19.08μm的he荧光素工作液，配置黄嘌呤溶液(准确称取7.5mg的黄嘌呤于50ml容量瓶中，加入2.5ml 0.1m的氢氧化钠充分溶解后，用缓冲溶液定容)，配置黄嘌呤氧化酶(工作浓度：0.1u/ml)，配置sod工作液(300units/ml)。将空白(缓冲溶液)、样品(稀释1000倍)和标准抗氧化物(sod)各25μl分别与150μl二氢乙锭荧光素he(含黄嘌呤)溶液混合后，孔板盖上盖子在37℃孵育10min后，立即加入25μl的黄嘌呤氧化酶溶液，使用酶标仪进行追踪记录，得到其抑制率为84.8％。
41.实施例2
42.一种具有抗氧化活性的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
43.(1)提取：按照质量百分比分别称取肉桂12％、玫瑰22％、西青果28％和丁香38％药材进行粉碎处理，添加12倍35％乙醇溶液，在480w超声提取2次，每次70min，提取结束后冷却至室温，过滤，合并滤液。
44.(2)浓缩干燥：将上述收集的馏分减压真空浓缩干燥，温度45℃；
45.(3)制备纯化：制备纯化：取上述提取物加入6倍50％乙醇进行溶解，上ab-8树脂柱吸附2小时，利用6倍超纯水洗脱2小时，使用6倍35％乙醇洗脱2小时，使用95％乙醇洗脱2小时，收集洗脱液。
46.(4)将上述收集的35％乙醇和超纯水洗脱液减压真空浓缩干燥，温度45℃。
47.(5)对制备得到的中药组合物进行dpph抗氧化高通量检测：配置dpph溶液使其在96孔板中的吸光度为0.7
±
0.02(100微升dpph+100微升乙醇)，将样品用乙醇稀释1000倍分为四组，分别加入10、20、30、40μl于孔板中，用乙醇补至100μl，每组做3组平行样，在向每个孔中加入100μl dpph溶液后迅速放入酶标仪中进行测试。得到其ic
50
值为0.034mg/ml(ic
50
：以实验所得的抗氧化剂浓度为横坐标，清除率为纵坐标，然后计算线性回归方程。将清除率50％代入方程中求得对应的横坐标值即为ic
50
值)。
48.(6)对制备得到的中药组合物进行abts抗氧化高通量检测：用磷酸二氢钠和磷酸氢二钾配置成0.75m ph＝7.4的缓冲液，将abts溶液和过二硫酸钾反应18h后稀释至其在96孔板中的吸光度为0.7
±
0.02(100微升abts反应液+100微升缓冲液)，将样品用缓冲液稀释1000倍分为四组，分别加入10、20、30、40μl于孔板中，用缓冲液补至100μl，每组做3组平行样，在向每个孔中加入100μl abts反应液后迅速放入酶标仪中进行测试。得到其ic
50
值为0.0134mg/ml(ic
50
：以实验所得的抗氧化剂浓度为横坐标，清除率为纵坐标，然后计算线性回归方程。将清除率50％代入方程中求得对应的横坐标值即为ic
50
值)。
49.(7)对制备得到的中药组合物进行sorac抗氧化高通量检测：用磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、二乙烯三胺五乙酸配置成0.75m ph＝7.4的缓冲液，配置19.08μm的he荧光素工作液，配置黄嘌呤溶液(准确称取7.5mg的黄嘌呤于50ml容量瓶中，加入2.5ml 0.1m的氢氧化钠充分溶解后，用缓冲溶液定容)，配置黄嘌呤氧化酶(工作浓度：0.1u/ml)，配置sod工作液(300units/ml)。将空白(缓冲溶液)、样品(稀释1000倍)和标准抗氧化物(sod)各25μl分别与150μl二氢乙锭荧光素he(含黄嘌呤)溶液混合后，孔板盖上盖子在37℃孵育10min后，立即加入25μl的黄嘌呤氧化酶溶液，使用酶标仪进行追踪记录，得到其抑制率为83.5％。
50.实施例3
51.一种具有抗氧化活性的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
52.(1)提取：按照质量百分比分别称取肉桂15％、玫瑰25％、西青果25％和丁香35％
药材进行粉碎处理，添加12倍50％乙醇溶液，在500w超声提取3次，每次80min，提取结束后冷却至室温，过滤，合并滤液。
53.(2)浓缩干燥：将上述收集的馏分减压真空浓缩干燥，温度45℃；
54.(3)制备纯化：制备纯化：取上述提取物加入6倍50％乙醇进行溶解，上ab-8树脂柱吸附2小时，利用6倍超纯水洗脱2小时，使用6倍35％乙醇洗脱2小时，使用95％乙醇洗脱2小时，收集洗脱液。
55.(4)将上述收集的35％乙醇和超纯水洗脱液减压真空浓缩干燥，温度45℃。
56.(5)对制备得到的中药组合物进行dpph抗氧化高通量检测：配置dpph溶液使其在96孔板中的吸光度为0.7
±
0.02(100微升dpph+100微升乙醇)，将样品用乙醇稀释1000倍分为四组，分别加入10、20、30、40μl于孔板中，用乙醇补至100μl，每组做3组平行样，在向每个孔中加入100μl dpph溶液后迅速放入酶标仪中进行测试。得到其ic
50
值为0.038mg/ml(ic
50
：以实验所得的抗氧化剂浓度为横坐标，清除率为纵坐标，然后计算线性回归方程。将清除率50％代入方程中求得对应的横坐标值即为ic
50
值)。
57.(6)对制备得到的中药组合物进行abts抗氧化高通量检测：用磷酸二氢钠和磷酸氢二钾配置成0.75m ph＝7.4的缓冲液，将abts溶液和过二硫酸钾反应18h后稀释至其在96孔板中的吸光度为0.7
±
0.02(100微升abts反应液+100微升缓冲液)，将样品用缓冲液稀释1000倍分为四组，分别加入10、20、30、40μl于孔板中，用缓冲液补至100μl，每组做3组平行样，在向每个孔中加入100μl abts反应液后迅速放入酶标仪中进行测试。得到其ic
50
值为0.0154mg/ml(ic
50
：以实验所得的抗氧化剂浓度为横坐标，清除率为纵坐标，然后计算线性回归方程。将清除率50％代入方程中求得对应的横坐标值即为ic
50
值)。
58.(7)对制备得到的中药组合物进行sorac抗氧化高通量检测：用磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、二乙烯三胺五乙酸配置成0.75m ph＝7.4的缓冲液，配置19.08μm的he荧光素工作液，配置黄嘌呤溶液(准确称取7.5mg的黄嘌呤于50ml容量瓶中，加入2.5ml 0.1m的氢氧化钠充分溶解后，用缓冲溶液定容)，配置黄嘌呤氧化酶(工作浓度：0.1u/ml)，配置sod工作液(300units/ml)。将空白(缓冲溶液)、样品(稀释1000倍)和标准抗氧化物(sod)各25μl分别与150μl二氢乙锭荧光素he(含黄嘌呤)溶液混合后，孔板盖上盖子在37℃孵育10min后，立即加入25μl的黄嘌呤氧化酶溶液，使用酶标仪进行追踪记录，得到其抑制率为82.6％。
59.对比例1
60.该对比例的具有抗氧化活性的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
61.(1)按照质量百分比分别称取肉桂30％、玫瑰30％、西青果40％药材进行粉碎处理，添加15倍35％乙醇溶液，在500w超声提取3次，每次80min，提取结束后冷却至室温，过滤，合并滤液。
62.(2)浓缩干燥：将上述过滤后的提取液减压真空浓缩干燥，温度45-50℃。
63.(3)制备纯化：取上述提取物加入6倍50％乙醇进行溶解，上ab-8树脂柱吸附2小时，利用6倍超纯水洗脱2小时，使用6倍35％乙醇洗脱2小时，使用95％乙醇洗脱2小时，收集洗脱液。
64.(4)浓缩干燥：将上述收集的35％乙醇和超纯水洗脱液减压真空浓缩干燥，温度45-50℃。
65.(5)对制备得到的中药组合物进行dpph抗氧化高通量检测：配置dpph溶液使其在
96孔板中的吸光度为0.7
±
0.02(100微升dpph+100微升乙醇)，将样品用乙醇稀释1000倍分为四组，分别加入10、20、30、40μl于孔板中，用乙醇补至100μl，每组做3组平行样，在向每个孔中加入100μl dpph溶液后迅速放入酶标仪中进行测试。得到其ic
50
值为0.062mg/ml。
66.(6)对制备得到的中药组合物进行abts抗氧化高通量检测：用磷酸二氢钠和磷酸氢二钾配置成0.75m ph＝7.4的缓冲液，将abts溶液和过二硫酸钾反应18h后稀释至其在96孔板中的吸光度为0.7
±
0.02(100微升abts反应液+100微升缓冲液)，将样品用缓冲液稀释1000倍分为四组，分别加入10、20、30、40μl于孔板中，用缓冲液补至100μl，每组做3组平行样，在向每个孔中加入100μl abts反应液后迅速放入酶标仪中进行测试。得到其ic
50
值为0.057mg/ml(ic
50
：以实验所得的抗氧化剂浓度为横坐标，清除率为纵坐标，然后计算线性回归方程。将清除率50％代入方程中求得对应的横坐标值即为ic
50
值)。
67.(7)对制备得到的中药组合物进行sorac抗氧化高通量检测：用磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、二乙烯三胺五乙酸配置成0.75m ph＝7.4的缓冲液，配置19.08μm的he荧光素工作液，配置黄嘌呤溶液(准确称取7.5mg的黄嘌呤于50ml容量瓶中，加入2.5ml 0.1m的氢氧化钠充分溶解后，用缓冲溶液定容)，配置黄嘌呤氧化酶(工作浓度：0.1u/ml)，配置sod工作液(300units/ml)。将空白(缓冲溶液)、样品(稀释1000倍)和标准抗氧化物(sod)各25μl分别与150μl二氢乙锭荧光素he(含黄嘌呤)溶液混合后，孔板盖上盖子在37℃孵育10min后，立即加入25μl的黄嘌呤氧化酶溶液，使用酶标仪进行追踪记录。
68.与实施例1对比，对比例1缺少了丁香药材后，dpph抗氧化活性ic
50
值由0.033mg/ml上升到0.062mg/ml，abts抗氧化活性ic
50
值由0.0133mg/ml上升到0.057mg/ml(ic
50
数值越小，抗氧化活性越大)，对比例1的sorac抗氧化活性(黄嘌呤氧化酶抑制率)由84.8％下降到62.4％。
69.对比例2
70.该对比例的具有抗氧化活性的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
71.(1)按照质量百分比分别称取肉桂40％、玫瑰40％、西青果20％药材进行粉碎处理，添加15倍35％乙醇溶液，在500w超声提取3次，每次80min，提取结束后冷却至室温，过滤，合并滤液。
72.(2)浓缩干燥：将上述过滤后的提取液减压真空浓缩干燥，温度45-50℃。
73.(3)制备纯化：取上述提取物加入6倍50％乙醇进行溶解，上ab-8树脂柱吸附2小时，利用6倍超纯水洗脱2小时，使用6倍35％乙醇洗脱2小时，使用95％乙醇洗脱2小时，收集洗脱液。
74.(4)浓缩干燥：将上述收集的35％乙醇和超纯水洗脱液减压真空浓缩干燥，温度45-50℃。
75.(5)对制备得到的中药组合物进行dpph抗氧化高通量检测：配置dpph溶液使其在96孔板中的吸光度为0.7
±
0.02(100微升dpph+100微升乙醇)，将样品用乙醇稀释1000倍分为四组，分别加入10、20、30、40μl于孔板中，用乙醇补至100μl，每组做3组平行样，在向每个孔中加入100μl dpph溶液后迅速放入酶标仪中进行测试，得到其ic
50
值为0.067mg/ml。
76.(6)对制备得到的中药组合物进行abts抗氧化高通量检测：用磷酸二氢钠和磷酸氢二钾配置成0.75m ph＝7.4的缓冲液，将abts溶液和过二硫酸钾反应18h后稀释至其在96孔板中的吸光度为0.7
±
0.02(100微升abts反应液+100微升缓冲液)，将样品用缓冲液稀释
1000倍分为四组，分别加入10、20、30、40μl于孔板中，用缓冲液补至100μl，每组做3组平行样，在向每个孔中加入100μl abts反应液后迅速放入酶标仪中进行测试。得到其ic
50
值为0.064mg/ml(ic
50
：以实验所得的抗氧化剂浓度为横坐标，清除率为纵坐标，然后计算线性回归方程。将清除率50％代入方程中求得对应的横坐标值即为ic
50
值)。
77.(7)对制备得到的中药组合物进行sorac抗氧化高通量检测：用磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、二乙烯三胺五乙酸配置成0.75m ph＝7.4的缓冲液，配置19.08μm的he荧光素工作液，配置黄嘌呤溶液(准确称取7.5mg的黄嘌呤于50ml容量瓶中，加入2.5ml 0.1m的氢氧化钠充分溶解后，用缓冲溶液定容)，配置黄嘌呤氧化酶(工作浓度：0.1u/ml)，配置sod工作液(300units/ml)。将空白(缓冲溶液)、样品(稀释1000倍)和标准抗氧化物(sod)各25μl分别与150μl二氢乙锭荧光素he(含黄嘌呤)溶液混合后，孔板盖上盖子在37℃孵育10min后，立即加入25μl的黄嘌呤氧化酶溶液，使用酶标仪进行追踪记录，得到其抑制率为66.7％。
78.与实施例1比，对比例2缺少了丁香药材后，dpph抗氧化活性ic
50
值由0.033mg/ml上升到0.067mg/ml，abts抗氧化活性ic
50
值由0.0133mg/ml上升到0.064mg/ml，sorac抗氧化活性(黄嘌呤氧化酶抑制率)由84.8％下降到66.7％。
79.对比例3
80.该对比例的具有抗氧化活性的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
81.(1)按照质量百分比分别称取肉桂40％、玫瑰30％、丁香30％药材进行粉碎处理，添加15倍35％乙醇溶液，在500w超声提取3次，每次80min，提取结束后冷却至室温，过滤，合并滤液。
82.(2)浓缩干燥：将上述过滤后的提取液减压真空浓缩干燥，温度45-50℃。
83.(3)制备纯化：取上述提取物加入6倍50％乙醇进行溶解，上ab-8树脂柱吸附2小时，利用6倍超纯水洗脱2小时，使用6倍35％乙醇洗脱2小时，使用95％乙醇洗脱2小时，收集洗脱液。
84.(4)浓缩干燥：将上述收集的35％乙醇和超纯水洗脱液减压真空浓缩干燥，温度45-50℃。
85.(5)对制备得到的中药组合物进行dpph抗氧化高通量检测：配置dpph溶液使其在96孔板中的吸光度为0.7
±
0.02(100微升dpph+100微升乙醇)，将样品用乙醇稀释1000倍分为四组，分别加入10、20、30、40μl于孔板中，用乙醇补至100μl，每组做3组平行样，在向每个孔中加入100μl dpph溶液后迅速放入酶标仪中进行测试，得到其ic
50
值为0.043mg/ml。
86.(6)对制备得到的中药组合物进行abts抗氧化高通量检测：用磷酸二氢钠和磷酸氢二钾配置成0.75m ph＝7.4的缓冲液，将abts溶液和过二硫酸钾反应18h后稀释至其在96孔板中的吸光度为0.7
±
0.02(100微升abts反应液+100微升缓冲液)，将样品用缓冲液稀释1000倍分为四组，分别加入10、20、30、40μl于孔板中，用缓冲液补至100μl，每组做3组平行样，在向每个孔中加入100μl abts反应液后迅速放入酶标仪中进行测试。得到其ic
50
值为0.021mg/ml(ic
50
：以实验所得的抗氧化剂浓度为横坐标，清除率为纵坐标，然后计算线性回归方程。将清除率50％代入方程中求得对应的横坐标值即为ic
50
值)。
87.(7)对制备得到的中药组合物进行sorac抗氧化高通量检测：用磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、二乙烯三胺五乙酸配置成0.75m ph＝7.4的缓冲液，配置19.08μm的he荧光素工作液，配置黄嘌呤溶液(准确称取7.5mg的黄嘌呤于50ml容量瓶中，加入2.5ml 0.1m的氢氧化
钠充分溶解后，用缓冲溶液定容)，配置黄嘌呤氧化酶(工作浓度：0.1u/ml)，配置sod工作液(300units/ml)。将空白(缓冲溶液)、样品(稀释1000倍)和标准抗氧化物(sod)各25μl分别与150μl二氢乙锭荧光素he(含黄嘌呤)溶液混合后，孔板盖上盖子在37℃孵育10min后，立即加入25μl的黄嘌呤氧化酶溶液，使用酶标仪进行追踪记录。
88.与实施例1比，对比例3缺少了西青果药材后，dpph抗氧化活性ic
50
值由0.033mg/ml上升到0.043mg/ml，abts抗氧化活性ic
50
值由0.0133mg/ml上升到0.021mg/ml，sorac抗氧化活性(黄嘌呤氧化酶抑制率)由84.8％下降到78.4％。
89.对比例4
90.该对比例的具有抗氧化活性的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
91.(1)按照质量百分比分别称取肉桂40％、西青果30％、丁香30％药材进行粉碎处理，添加15倍35％乙醇溶液，在500w超声提取3次，每次80min，提取结束后冷却至室温，过滤，合并滤液。
92.(2)浓缩干燥：将上述过滤后的提取液减压真空浓缩干燥，温度45-50℃。
93.(3)制备纯化：取上述提取物加入6倍50％乙醇进行溶解，上ab-8树脂柱吸附2小时，利用6倍超纯水洗脱2小时，使用6倍35％乙醇洗脱2小时，使用95％乙醇洗脱2小时，收集洗脱液。
94.(4)浓缩干燥：将上述收集的35％乙醇和超纯水洗脱液减压真空浓缩干燥，温度45-50℃。
95.(5)对制备得到的中药组合物进行dpph抗氧化高通量检测：配置dpph溶液使其在96孔板中的吸光度为0.7
±
0.02(100微升dpph+100微升乙醇)，将样品用乙醇稀释1000倍分为四组，分别加入10、20、30、40μl于孔板中，用乙醇补至100μl，每组做3组平行样，在向每个孔中加入100μl dpph溶液后迅速放入酶标仪中进行测试。得到其ic
50
值为0.047mg/ml。
96.(6)对制备得到的中药组合物进行abts抗氧化高通量检测：用磷酸二氢钠和磷酸氢二钾配置成0.75m ph＝7.4的缓冲液，将abts溶液和过二硫酸钾反应18h后稀释至其在96孔板中的吸光度为0.7
±
0.02(100微升abts反应液+100微升缓冲液)，将样品用缓冲液稀释1000倍分为四组，分别加入10、20、30、40μl于孔板中，用缓冲液补至100μl，每组做3组平行样，在向每个孔中加入100μl abts反应液后迅速放入酶标仪中进行测试。得到其ic
50
值为0.029mg/ml(ic
50
：以实验所得的抗氧化剂浓度为横坐标，清除率为纵坐标，然后计算线性回归方程。将清除率50％代入方程中求得对应的横坐标值即为ic
50
值)。
97.(7)对制备得到的中药组合物进行sorac抗氧化高通量检测：用磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、二乙烯三胺五乙酸配置成0.75m ph＝7.4的缓冲液，配置19.08μm的he荧光素工作液，配置黄嘌呤溶液(准确称取7.5mg的黄嘌呤于50ml容量瓶中，加入2.5ml 0.1m的氢氧化钠充分溶解后，用缓冲溶液定容)，配置黄嘌呤氧化酶(工作浓度：0.1u/ml)，配置sod工作液(300units/ml)。将空白(缓冲溶液)、样品(稀释1000倍)和标准抗氧化物(sod)各25μl分别与150μl二氢乙锭荧光素he(含黄嘌呤)溶液混合后，孔板盖上盖子在37℃孵育10min后，立即加入25μl的黄嘌呤氧化酶溶液，使用酶标仪进行追踪记录。得到其抑制率为72.5％。
98.与实施例1比，对比例4去除玫瑰药材后，dpph抗氧化活性ic
50
值由0.033mg/ml上升到0.047mg/ml，abts抗氧化活性ic
50
值由0.0133mg/ml上升到0.029mg/ml，sorac抗氧化活性(黄嘌呤氧化酶抑制率)由84.8％下降到72.5％。
99.对比例5
100.该对比例的具有抗氧化活性的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
101.(1)按照质量百分比分别称取西青果40％、玫瑰30％、丁香30％药材进行粉碎处理，添加15倍35％乙醇溶液，在500w超声提取3次，每次80min，提取结束后冷却至室温，过滤，合并滤液。
102.(2)浓缩干燥：将上述过滤后的提取液减压真空浓缩干燥，温度45-50℃。
103.(3)制备纯化：取上述提取物加入6倍50％乙醇进行溶解，上ab-8树脂柱吸附2小时，利用6倍超纯水洗脱2小时，使用6倍35％乙醇洗脱2小时，使用95％乙醇洗脱2小时，收集洗脱液。
104.(4)浓缩干燥：将上述收集的35％乙醇和超纯水洗脱液减压真空浓缩干燥，温度45-50℃。
105.(5)对制备得到的中药组合物进行dpph抗氧化高通量检测：配置dpph溶液使其在96孔板中的吸光度为0.7
±
0.02(100微升dpph+100微升乙醇)，将样品用乙醇稀释1000倍分为四组，分别加入10、20、30、40μl于孔板中，用乙醇补至100μl，每组做3组平行样，在向每个孔中加入100μl dpph溶液后迅速放入酶标仪中进行测试。得到其ic
50
值为0.039mg/ml。
106.(6)对制备得到的中药组合物进行abts抗氧化高通量检测：用磷酸二氢钠和磷酸氢二钾配置成0.75m ph＝7.4的缓冲液，将abts溶液和过二硫酸钾反应18h后稀释至其在96孔板中的吸光度为0.7
±
0.02(100微升abts反应液+100微升缓冲液)，将样品用缓冲液稀释1000倍分为四组，分别加入10、20、30、40μl于孔板中，用缓冲液补至100μl，每组做3组平行样，在向每个孔中加入100μl abts反应液后迅速放入酶标仪中进行测试。得到其ic
50
值为0.017mg/ml(ic
50
：以实验所得的抗氧化剂浓度为横坐标，清除率为纵坐标，然后计算线性回归方程。将清除率50％代入方程中求得对应的横坐标值即为ic
50
值)。
107.(7)对制备得到的中药组合物进行sorac抗氧化高通量检测：用磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、二乙烯三胺五乙酸配置成0.75m ph＝7.4的缓冲液，配置19.08μm的he荧光素工作液，配置黄嘌呤溶液(准确称取7.5mg的黄嘌呤于50ml容量瓶中，加入2.5ml 0.1m的氢氧化钠充分溶解后，用缓冲溶液定容)，配置黄嘌呤氧化酶(工作浓度：0.1u/ml)，配置sod工作液(300units/ml)。将空白(缓冲溶液)、样品(稀释1000倍)和标准抗氧化物(sod)各25μl分别与150μl二氢乙锭荧光素he(含黄嘌呤)溶液混合后，孔板盖上盖子在37℃孵育10min后，立即加入25μl的黄嘌呤氧化酶溶液，使用酶标仪进行追踪记录。
108.与实施例1比，对比例5去除肉桂药材后，dpph抗氧化活性ic
50
值由0.033mg/ml上升到0.039mg/ml，abts抗氧化活性ic
50
值由0.0133mg/ml上升到0.017mg/ml，sorac抗氧化活性(黄嘌呤氧化酶抑制率)由84.8％下降到81.2％。

技术特征：
1.一种具有抗氧化活性的中药组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取：按照质量百分比分别称取肉桂10％-15％、玫瑰花20％-25％、西青果25％-30％和丁香35-40％药材进行粉碎处理，添加10-15倍35％乙醇溶液，在450-500w超声提取2-3次，每次60-80min，提取结束后冷却至室温，过滤，合并滤液；(2)浓缩干燥：将上述过滤后的提取液减压真空浓缩干燥；(3)制备纯化：取上述提取物加入乙醇溶液进行溶解，上ab-8树脂柱吸附2小时，利用6倍超纯水洗脱2小时，使用6倍低浓度乙醇溶液洗脱2小时，使用高浓度乙醇溶液洗脱2小时，收集洗脱液；(4)浓缩干燥：将上述收集的35％乙醇和超纯水洗脱液减压真空浓缩干燥。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(4)的干燥温度为45-50℃。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)具体为：取上述提取物加入6倍50vol％乙醇溶液进行溶解，上ab-8树脂柱吸附2小时，利用6倍超纯水洗脱2小时，使用6倍35vol％乙醇溶液洗脱2小时，使用95vol％乙醇溶液洗脱2小时，收集洗脱液。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，原料为：肉桂10％、玫瑰20％、西青果30％和丁香40％。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，原料为：肉桂12％、玫瑰22％、西青果28％和丁香38％。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，肉桂15％、玫瑰25％、西青果25％和丁香35％。7.一种采用权利要求1-6中任一项所述的制备方法制备得到的具有抗氧化活性的中药组合物。

技术总结
本发明公开了一种具有抗氧化活性的中药组合物及其制备方法，其原料按照质量百分比分别为肉桂10％-15％、玫瑰花20％-25％、西青果25％-30％和丁香35-40％，采用提取、浓缩、纯化和干燥的步骤制备而成。本发明所得组合物较好的自由基抑制作用，抗氧化效果明显。抗氧化效果明显。


技术研发人员：周俊强 赖富丽 徐剑 王喆 郝桂芳 唐万 陈阳 崔灵敏 李韦琴
受保护的技术使用者：劲牌有限公司
技术研发日：2023.08.01
技术公布日：2023/10/15