NAT10抑制剂remodelin在制备治疗特应性皮炎的药物中的用途

nat10抑制剂remodelin在制备治疗特应性皮炎的药物中的用途
技术领域
1.本发明涉及医药领域，尤其涉及一种nat10抑制剂remodelin在制备治疗特应性皮炎的药物中的用途。


背景技术：

2.特应性皮炎(atopic dermatitis，ad)又称特应性湿疹，是一种最为常见的慢性、瘙痒性、反复性和炎症性皮肤病。随着工业化城镇化发展，在过去30年ad患病率显著升高了2-3倍，成人患病率约为2-10％，儿童是ad的易发群体，其发病率更是高达10-30％。虽然ad部分症状会在儿童时期或之后恢复，但大部分会持续慢性复发直到成年。其临床主要表现为严重的瘙痒以及伴随对多种环境刺激、生理和情绪压力等引发的皮肤超敏反应。研究显示ad常伴随有鼻炎和过敏性哮喘等严重的并发症，中度及重度ad患者往往患有严重的睡眠障碍、抑郁症和焦虑症，其中56.5％ ad患者还伴随有中度或极度皮肤疼痛。可见ad严重影响患者的生活质量，给患者及其家人带来沉重的心理和经济负担。
3.目前临床上ad的主要手段有局部应用糖皮质激素或系统使用抗组胺药、免疫抑制剂、免疫调节剂、光疗等疗法。pitrakinra(il-4突变蛋白)、lebrikizuma(il-13单克隆抗体)、nemolizumab(il-31r单克隆抗体)和omadzumab等免疫抑制剂ⅱ期临床试验结果显示：因其靶向细胞因子较为单一，疗效都不甚理想，并不能很好地缓解ad的症状，部分抑制剂也已经终止临床ⅲ期试验。dupilumab是fda批准的一种多靶点抑制剂(阻断il-4和il-13信号通路)，也是目前治疗ad效果最好的生物制品药物，但是其不仅价格十分昂贵，而且还容易产生结膜炎等副作用。长期使用这些药物还会出现生长障碍，骨质疏松，白内障及淋巴细胞减少症等一系列的副作用。因此，发现治疗ad的特异性分子以及分子通路，寻找治疗ad的药物靶点具有非常重要的理论和临床意义。
4.ad的发病机制目前尚不清楚，但关于它的发病机制研究相当热门。近年来一系列的研究认为表观遗传再ad的发病机制中扮演着重要角色。ad表观遗传的不断深入研究对揭示其发病机制及寻找更有效的治疗方法具有重大意义。4-乙酰胞苷(n4-acetylcytidine，ac4c)是一种存在于多种rnas上保守的转录后化学修饰核苷类型。ac4c的形成主要受n-乙酰基转移酶10(n-acetyltransferase 10，nat10)的催化，参与多种疾病的发病及进展，包括免疫炎症反应、代谢性疾病、自身免疫性疾病以及癌症等。目前，nat10抑制剂的应用可见肿瘤、抑郁症、心力衰竭、缺血性脑卒中、脓毒症的治疗等，但仍处于初步探索阶段，尚未进入临床研究。而关于nat10抑制剂在制备特应性皮炎中的作用还未见报道。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供nat10抑制剂remodelin的新应用，具体是nat10抑制剂remodelin在制备治疗特应性皮炎的药物中的用途。
6.具体地，本发明以nat10抑制剂remodelin作为研究对象，采用卵清蛋白(ova)和二
硝基氯苯(dncb)诱导的两种小鼠特应性皮炎模型考察nat10抑制剂remodelin对小鼠特应性皮炎的影响。结果显示相较于ad模型组，nat10抑制剂remodelin 1mg/kg和remodelin2mg/kg分别对两种小鼠ad模型具有治疗作用，能够显著改善皮肤屏障结构，抑制皮肤炎症。进一步研究显示，nat10抑制剂通过调控角质形成细胞的趋化因子分泌而发挥作用。因此，本发明提供了nat10抑制剂remodelin在制备治疗特应性皮炎的药物中的用途。
7.优选地，所述nat10基因或蛋白的抑制剂包括remodelin，其分子式为c
15h14
n4s4，分子量为282.36，化学结构式为：
[0008][0009]
本发明还提供了一种nat10抑制剂remodelin在制备治疗特应性皮炎的药物或药物组合物中的用途。
[0010]
进一步地，所述药物或药物组合物包括药学上可接受的载体和有效剂量的活性成分，所述活性成分包括nat10基因或蛋白的抑制剂。
[0011]
可选地，药学上可接受的载体包括乳糖、甲基纤维素等。
[0012]
优选地，所述nat10基因或蛋白的抑制剂包括remodelin。
[0013]
优选地，remodelin的给药浓度为1mg/kg。
[0014]
优选地，remodelin的给药方式为全身给药。
[0015]
本发明还提供了用于检测nat10基因或蛋白的表达或活性的试剂在制备诊断特应性皮炎的试剂或试剂盒中的应用。
[0016]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明利用nat10的特异性抑制剂remodelin来干预ova和dncb诱导的小鼠特应性皮炎，发现remodelin干预后可显著改善小鼠皮肤屏障结构，抑制皮肤炎症，本发明为临床上诊治特应性皮炎提供了新的靶点和策略。
附图说明
[0017]
图1是本发明的dncb诱导的小鼠特应性皮炎模型皮肤和耳朵两个组织nat10的表达水平对比示意图；其中，a为正常对照组和dncb模型组小鼠皮肤和耳朵组织中nat10的蛋白表达水平对比示意图，b为正常对照组和dncb模型组小鼠皮肤组织中nat10的mrna表达水平对比示意图，*p《0.05，与正常对照组相比。
[0018]
图2是本发明中正常对照组、dncb模型与dncb模型基础上进行12天的nat10抑制剂腹腔注射后的对比图，其中，a为整个实验流程图，b为三组小鼠皮损程度对比图，c为三组屏
障功能和炎症细胞浸润对比图。
[0019]
图3是本发明中正常对照组、ova模型与ova模型基础上进行7天的nat10抑制剂腹腔注射后的对比图，其中，a为整个实验流程图，b为三组小鼠皮损程度对比图，c为三组屏障功能和炎症细胞浸润对比图。
[0020]
图4是本发明中ifn-γ/tnf-α诱导体外ad模型与体外模型上给nat10抑制剂24小时后的对比图，其中，a为正常组和ifn-γ/tnf-α模型组角质细胞中nat10的蛋白表达水平对比示意图，其中fmo组为流式检测所需的荧光扣除对照；b为正常组和ifn-γ/tnf-α模型组角质细胞中nat10的mrna表达水平对比示意图，*p《0.05，与正常对照组相比，c为抗体阵列检测角质细胞分泌趋化因子对比图，d为c图的光密度分析定量图。
具体实施方式
[0021]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0022]
实施例1：dncb小鼠特应性皮炎模型的建立
[0023]
5-7周龄雌性balb/c小鼠经戊巴比妥麻醉后，用剃毛器将小鼠背部约1cm
×
2cm面积脱毛。将溶剂为丙酮和橄榄油(配制比例v
丙酮
：v
橄榄油
＝3：1)的1％ dncb溶液200μl涂抹于模型组小鼠的背部剃毛区以及双耳背侧，记为day 1，每2天涂抹1次。重复4次后，每2天用0.5％ dncb溶液200μl反复刺激背部皮肤直至实验结束。正常对照组小鼠按照同样时间每只涂抹dncb溶剂200μl。待模型组背部出现炎症表现后模型建立成功，即特应性皮炎模型建立成功。
[0024]
实施例2：dncb模型小鼠皮肤和耳朵标本的nat10蛋白水平及mrna水平检测
[0025]
收集上述正常对照组与dncb模型组的小鼠皮肤和耳朵组织。取4％多聚甲醛固定的组织脱水、包埋，制作组织病理切片，采用免疫组化法检测nat10蛋白的表达水平。取-80℃冻存的组织，用rnaiso plus通用型rna提取裂解液(takara)提取皮肤样本的总rna，用primescript
tm
rt master mix(takara)逆转录，采用rt-qpcr法检测nat10 mrna的表达水平(引物序列为nat10-f 5
’‑
gagctgggatttagcagtcac-3’；nat10-r 5
’‑
cagtagcgaatgtttgtggct-3’)。如图1所示，结果显示，dncb模型组的小鼠皮肤和耳朵组织中nat10蛋白水平和mrna水平显著增加。
[0026]
实施例3：nat10抑制剂remodelin干预dncb诱导特应性皮炎小鼠模型
[0027]
按照实施例1所述的方法进行ad模型建立。治疗组第10天开始腹腔注射nat10抑制剂(2mg/kg)，隔天一次，持续12天。
[0028]
皮肤标本切片观察：试验结束皮肤取材，多聚甲醛固定后行常规石蜡包埋及切片。切片制作完成后常规脱蜡水化，进行he染色，观察皮肤组织表皮变化。如图2所示，结果显示，治疗组小鼠在remodelin干预后皮肤损伤程度减轻，皮肤角化不全或过度等屏障异常得到改善，炎性细胞浸润减少。
[0029]
实施例4：nat10抑制剂remodelin干预ova诱导特应性皮炎小鼠模型
[0030]
选择5-7周龄balb/c雌性小鼠，经戊巴比妥麻醉后，先用剃毛器去除较长的毛发，
再用脱毛膏去除较短的毛发，然后贴上胶带剥8到10次破坏其皮肤屏障。将浸有400μl 400μg(即400μl浓度为1μg/μl)ova的1
×
3cm的无菌敷贴贴于小鼠背部。将贴片贴于每只小鼠的背部皮肤上，每天更换。正常对照组小鼠按照同样时间每只涂抹ova溶剂(生理盐水)400μl。待模型背部出现炎症表现后模型建立成功。按照所述的方法进行ad模型建立。治疗组第10天开始腹腔注射nat10抑制剂(1mg/kg)每只，每天一次，持续7天。
[0031]
皮肤标本切片观察：试验结束皮肤取材，多聚甲醛固定后行常规石蜡包埋及切片。切片制作完成后常规脱蜡水化，进行he染色，观察皮肤组织表皮变化。其结果如图3所示，remodelin治疗效果与dncb模型上较为一致，治疗组小鼠皮损程度减轻，屏障功能得到改善，炎性细胞浸润减少。
[0032]
实施例5：nat10抑制剂remodelin干预小鼠特应性皮炎机制
[0033]
选取人角质形成细胞株hacat细胞构建ad体外模型，按照每孔2
×
105个细胞种于6孔板，过夜后弃去培养液，正常对照组加入2ml含有10％血清的dmem高糖培养液，模型组加入2ml含有10％血清和10μg/ml tnf-α、ifn-γ的dmem高糖培养液。37℃和5％ co2的环境中培养48小时，3000rpm/s离心10min，收集细胞固定、破膜、洗涤，采用流式细胞仪检测正常对照组和模型组细胞nat10蛋白的表达水平。采用rt-qpcr法检测正常对照组和模型组细胞nat10 mrna的表达水平(引物序列为nat10-f 5
’‑
atagcagccacaaacattcgc-3’；nat10-r 5
’‑
acacacatgccgaaggtattg-3’)。
[0034]
按照所述的方法进行ad体外模型建立，治疗组加入2ml含有10％血清、10μg/ml tnf-α、ifn-γ和5μmol/ml的remodelin的dmem高糖培养液。收集细胞上清冻于-80℃冰箱，采用proteome profiler human chemokine array kit(r&d)检测正常对照组、模型组和治疗组三组角质细胞分泌的趋化因子水平，采用gel-pro analyzer4.0软件对以上结果进行定量分析。以上结果显示如图4所示，可以看出ad模型中nat10主要在角质形成细胞中高表达，采用抑制剂remodelin可降低角质形成细胞趋化因子的分泌水平。
[0035]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.nat10抑制剂remodelin在制备治疗特应性皮炎的药物中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述nat10抑制剂remodelin的给药浓度为1mg/kg。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述nat10抑制剂remodelin的给药方式为全身给药。4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体。

技术总结
本发明公开了NAT10抑制剂remodelin在制备治疗特应性皮炎的药物中的用途，本发明的实验表明在特应性皮炎模型小鼠皮肤组织中NAT10蛋白水平和mRNA水平明显增加，NAT10抑制剂remodelin能够明显改善特应性皮炎小鼠皮肤损伤程度，以及减轻炎性细胞浸润和角化不全/角化过度程度，进一步机制研究发现NAT10抑制剂通过抑制角质形成细胞趋化因子分泌水平而发挥作用。NAT10抑制剂remodelin可用于制备治疗特应性皮炎的药物，具有较高的临床应用价值和开发前景。开发前景。开发前景。


技术研发人员：邵金金 叶志超 谢智奇 张立将 史煜华
受保护的技术使用者：杭州医学院
技术研发日：2023.08.07
技术公布日：2023/10/15