一种用于鉴别延边牛和延黄牛的微卫星标记及其应用

1.本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种用于鉴别延边牛和延黄牛的微卫星标记及其应用。


背景技术：

2.微卫星标记技术已经相当成熟，因其价格低廉，操作简单，而且对dna质量要求适中，在动植物品种鉴别方面早已被国内外广泛应用。不同物种在同一个微卫星位点等位基因数目和频率的差异，可作为区分品种类型的依据。r.b.aitnazarov
1.使用11个微卫星标记研究了新西伯利亚地区6个养殖企业的4788头黑皮牛dna样品。在个体群体之间没有发现遗传变异参数的显著差异。在六分之五的牛群中发现了特有等位基因。通过种群分布检验、主成分分析、fst值、聚类分析和系统发育分析揭示了两个种群在遗传上不同于其他种群。李智军
2.通过利用5个微卫星位点对柯尔克孜马、俄罗斯速步马、纯血马这3个品种进行分析，得出结论可以通过筛选出的微卫星位点的有效等位基因数(ne)，以及所选微卫星标记的等位基因，通过各品种的特有基因型达到初步鉴别三个马匹品种的目的。王统苗
3.通过利用5个微卫星位点对攸县麻鸭、三穗鸭、金定鸭、麻旺鸭、绍兴鸭、荆江麻鸭、山麻鸭7个地方蛋鸭品种进行鉴别，发现可以通过绘制不同的基因型频率来达到品种鉴别的目的。anne-sodhie
4.通过10个微卫星标记对加拿大阿尔伯塔省开发的20个马铃薯品种进行指纹分析。发现stm0037、stm1016、stm1104是检测马铃薯品种间遗传变异的的最佳ssr位点，区分20种马铃薯品种至少需要2个微卫星标记，而且这种高信息含量的分子工具证实了开发的马铃薯品种间的遗传差异。宋亚倩[5]通过用10对能够扩增出稳定条带的微卫星标记引物将纯种宁夏滩羊、纯种宁夏细毛羊和纯种藏绵羊进行遗传多样性分析，发现宁夏滩羊的遗传多样性高于其他两个品种。通过毛细管电泳实验发现scaffold632、scaffold31384、scaffold7676这三个位点可以对宁夏滩羊、新疆细毛羊和藏绵羊进行有效区分，并且建立了我国西北地区可用于科学准确判断3个纯种绵羊肉品种的基因库。陈赢男等
[6]
验证10对多态性信息含量高的引物组合的有效性并用其验证了浙江红花山茶等油茶品种。
[0003]
如今虽然国家对畜禽资源的保护利用与开发足够重视，但是保种育种工作不是一朝一夕就能完成的，而是一场持久战，延边牛作为中国五大地方良种牛之一，无论是在延边州还是吉林省的畜牧业中都发挥着重要作用，并且占有重要地位。保护延边牛品种资源仍然是一项重要的工作，而且由于延边牛和延黄牛在表型上极为相似，所以只从表型上区分这两个品种，受主观意识的影响，极有可能造成判断错误，这无形又为育种工作造成了一定的困扰。目前微卫星标记在延边牛和延黄牛品种鉴别方面还少有研究。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种微卫星标记，对延边牛和延黄牛进行品种鉴别，为今后的延边牛和延黄牛在品种鉴别方面提供一定的理论支持。
[0005]
本发明提供了一种用于鉴别延边牛和延黄牛的微卫星标记，包括以下两种以上微
卫星标记：eth225、csrm60和hel5；
[0006]
所述eth225的扩增引物包括核苷酸序列如seq id no：1所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no：2所示的反向引物；
[0007]
所述csrm60的扩增引物包括核苷酸序列如seq id no：3所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no：4所示的反向引物；
[0008]
所述hel5的扩增引物包括核苷酸序列如seq id no：5所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no：6所示的反向引物。
[0009]
本发明提供了一种用于鉴别延边牛和延黄牛的检测试剂盒，包括以下成分：
[0010]
用于扩增所述微卫星标记的引物和pcr反应预混液。
[0011]
优选的，所述pcr反应预混液包括dntp、含镁离子的taq buffer和taq酶。
[0012]
本发明提供了所述微卫星标记或所述检测试剂盒在鉴别延边牛和延黄牛中的应用。
[0013]
优选的，所述鉴别延边牛和延黄牛的方法，包括以下步骤：
[0014]
提取样本的基因组dna；
[0015]
将提取的基因组dna为模板，以扩增所述微卫星标记的引物进行pcr扩增，得到pcr产物；
[0016]
根据所述pcr产物的基因型，判断样本为延边牛或延黄牛。
[0017]
优选的，当微卫星标记为csrm60和hel5时，根据延边牛和延黄牛中检测出来的特有等位基因，参照赋值标准，得到样本的分子身份证，根据延边牛或延黄牛的分子身份证判断样本为延边牛或延黄牛。
[0018]
优选的，所述延边牛的csrm60位点的特有等位基因包括89bd；
[0019]
所述延边牛的hel5位点的特有等位基因包括147bp、155bp、158bp和159bp；
[0020]
所述延黄牛的csrm60位点的特有等位基因包括81bp和105bp；
[0021]
所述延黄牛的hel5位点的特有等位基因包括148bp、149bp和156bp。
[0022]
优选的，当微卫星标记为eth225、csrm60和hel5时，根据延边牛和延黄牛中检测出来的共有等位基因型的基因频率进行延边牛和延黄牛品种的鉴别。
[0023]
优选的，当微卫星标记为eth225时，延边牛和延黄牛中检测出来的共有等位基因型为140/140；
[0024]
当微卫星标记为hel5时，延边牛和延黄牛中检测出来的共有等位基因型为167/167；
[0025]
当微卫星标记为csrm60时，延边牛和延黄牛中检测出来的共有等位基因型为91/103。
[0026]
优选的，在eth225位点上，延边牛的共有等位基因型频率显著高于延黄牛，在hel5位点，延边牛的共有等位基因型频率低于延黄牛；在csrm60位点，延边牛的共有等位基因型频率低于延黄牛。
[0027]
本发明提供的用于鉴别延边牛和延黄牛的微卫星标记，包括以下两种以上微卫星标记：eth225、csrm60和hel5；所述eth225的扩增引物包括核苷酸序列如seq id no：1所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no：2所示的反向引物；所述csrm60的扩增引物包括核苷酸序列如seq id no：3所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no：4所示的反向引物；所
述hel5的扩增引物包括核苷酸序列如seq id no：5所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no：6所示的反向引物。本发明分别测定了15个微卫星位点在延边牛和延黄牛2个群体中的群体遗传学参数，筛选得到上述3个微卫星位点，其中2或3个微卫星位点能够实现延边牛和延黄牛品种的鉴别，具有准确率高，快速简便的特点。
附图说明
[0028]
图1为部分延边牛dna质量检测电泳图；
[0029]
图2为16个微卫星位点引物琼脂糖凝胶电泳图；
[0030]
图3为延边牛yb1个体在hel5位点的str分型结果；
[0031]
图4为延边牛和延黄牛主坐标分析结果；
[0032]
图5为延边牛和延黄牛品种鉴定柱形图。
具体实施方式
[0033]
本发明提供了一种用于鉴别延边牛和延黄牛的微卫星标记，包括以下两种以上微卫星标记：eth225、csrm60和hel5；所述eth225的扩增引物包括核苷酸序列如seq id no：1所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no：2所示的反向引物；所述csrm60的扩增引物包括核苷酸序列如seq id no：3所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no：4所示的反向引物；所述hel5的扩增引物包括核苷酸序列如seq id no：5所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no：6所示的反向引物。
[0034]
在本发明中，首先针对16个微卫星位点设计了扩增引物，经pcr扩增验证，有一对引物未成功扩增目标片段，剩余15对引物分别对延边牛和延黄牛进行荧光pcr，确定每个微卫星位点在每种牛品种的str基因型，测定15个微卫星位点的遗传参数，包括等位基因数量(na)、有效等位基因数(ne)、测杂合度(ho)和期望杂合度(he)和pic值。15对荧光str位点共检测到179个等位基因，平均每个位点12个，其中cssm66的等位基因数量最多，共有20个；整个群体的有效等位基因数为4.376，其中cssm66的位点最多，为8.692；eth3位点上最少，为2.034；15个微卫星位点平均观测杂合度在0.771，期望杂合度在0.740，15个座位均为中高度多态位点，其中仅有eth3位点为中度多态位点；pic值为0.416，其他均为高度多态位点(pic＞0.5)，hel13位点的多态信息含量最高为0.822。
[0035]
本发明提供了一种用于鉴别延边牛和延黄牛的检测试剂盒，包括以下成分：用于扩增所述微卫星标记的引物和pcr反应预混液。
[0036]
在本发明中，所述pcr反应预混液优选包括dntp、含镁离子的taq buffer和taq酶。本发明对所述引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的人工合成方法即可。
[0037]
本发明提供了所述微卫星标记或所述检测试剂盒在鉴别延边牛和延黄牛中的应用。
[0038]
在本发明中，所述鉴别延边牛和延黄牛的方法，优选包括以下步骤：
[0039]
提取样本的基因组dna；
[0040]
将提取的基因组dna为模板，以扩增所述微卫星标记的引物进行pcr扩增，得到pcr产物；
[0041]
根据所述pcr产物的基因型，判断样本为延边牛或延黄牛。
[0042]
本发明对提取样本的基因组dna的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取基因组dna的方法即可。在本发明实施例中，采用试剂盒法提取血液样本的基因组dna。提取后，优选对提取的基因组dna进行dna的浓度和完整度的检测。所述dna的od
260
/od
280
的比值优选在1.8-2.0之间。经1％琼脂糖凝胶电泳检测基因dna，条带明亮且没有弥散，说明提取的基因组dna完整性良好，适于后续实验。
[0043]
在本发明中，所述pcr扩增优选为荧光pcr扩增。所述荧光pcr扩增的反应体系优选为20～50ng/μl模板dna 1μl、10μm正向引物或反向引物0.5μl、5μm dntp(mix)0.5μl、10
×
taq buffer(含mgcl2)2.5μl、5u/μl taq酶0.2μl、ddh2o补充至25μl。所述pcr扩增的反应程序优选为预变性95℃5min；变性94℃30sec，退火60℃，-0.5℃30sec，延伸72℃30sec，循环10个循环；变性94℃30sec，退火55℃30sec，延伸72℃30sec，循环30个循环；修复延伸72℃10min。
[0044]
在本发明中，基于abi-3730xl型dna测序平台对荧光pcr扩增产物进行扫描，根据扫描结果进行str分型。
[0045]
在本发明中，当微卫星标记为csrm60和hel5时，优选根据延边牛和延黄牛中检测出来的特有等位基因型，参照赋值标准，得到样本的分子身份证，根据已知的延边牛或延黄牛的分子身份证判断样本为延边牛或延黄牛。
[0046]
在本发明中，所述延边牛的特有等位基因型是指相对于延黄牛而言，延边牛中存在的特有的各微卫星位点对应的等位基因。所述延黄牛的特有等位基因是指相对于延边牛而言，延黄牛中存在的特有的各微卫星位点对应的等位基因。
[0047]
在本发明中，所述延边牛的csrm60位点的特有等位基因优选包括89bp；所述延边牛的hel5位点的特有等位基因优选包括147bp、155bp、158bp和159bp；所述延黄牛的csrm60位点的特有等位基因优选包括81bp、105bp；所述延黄牛的hel5位点的特有等位基因优选包括148bp、149bp、156bp。
[0048]
在本发明中，所述赋值标准为针对csrm60和hel5两个位点特有等位基因进行编码。所述已知的延边牛或延黄牛的分子身份证的获得方法，优选如下：比对赋值标准，根据延边牛或延黄牛中两个微卫星位点分别对应的基因型找出对应的编号进行顺序排列，得到样本中两个微卫星位点分别对应的分子身份证，根据已知的延边牛或延黄牛的csrm60和hel5的分子身份证进行比对，若与延边牛的结果一致说明，样本来源于延边牛；若与延黄牛的身份证一致，说明样本来源于延黄牛。
[0049]
在本发明中，当微卫星标记优选为eth225、csrm60和hel5时，根据延边牛和延黄牛中检测出来的共有等位基因型的基因频率进行延边牛和延黄牛品种的鉴别。当微卫星标记优选为eth225时，延边牛和延黄牛中检测出来的共有等位基因型为140/140；当微卫星标记为hel5时，延边牛和延黄牛中检测出来的共有等位基因型为167/167；当微卫星标记为csrm60时，延边牛和延黄牛中检测出来的共有等位基因型为91/103。实验结果表明，在eth225位点上，延边牛的共有等位基因型频率显著高于延黄牛，在hel5位点，延边牛的共有等位基因型频率低于延黄牛；在csrm60位点，延边牛的共有等位基因型频率低于延黄牛。
[0050]
下面结合实施例对本发明提供的一种用于鉴别延边牛和延黄牛的微卫星标记及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0051]
实施例1
[0052]
1.材料和方法
[0053]
1.1样品采集
[0054]
选择在同等饲喂条件下且系谱明确的初生到24月龄纯种延边牛母牛和延黄牛母牛各60头。对其体尺性状进行同期测量，将数据进行统计分析，延边牛由延边东盛黄牛资源保种有限公司提供，延黄牛由延边畜牧开发集团有限公司提供。
[0055]
1.2提取血液dna
[0056]
(1)取250μl的牛血液样品(抗凝血)到盛有500μl buffer ap1的1.5ml的离心管中，并用移液器反复吸混几次，将移液器枪头上残留的血液彻底溶解在离心管里，将离心管盖子盖紧后，进行涡旋振荡，时间为10s；
[0057]
(2)加入100μl的buffer ap2，涡旋振荡10s；
[0058]
(3)12000
×
g离心10min；
[0059]
(4)将制备管置于2ml的离心管中，将离心后的滤液加入到制备管中，12000
×
g离心1min；
[0060]
(5)弃掉滤液，将制备管置于原2ml离心管中，加入700μl buffer w1a，室温放置2min，12000
×
g离心30s；
[0061]
(6)弃掉滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，加800μl用无水乙醇稀释过的buffer w2，12000
×
g离心1min；
[0062]
(7)将制备管置回原2ml离心管中，加500μl buffer w2到制备管中，12000
×
g离心1min；
[0063]
(8)弃掉滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，12000
×
g空转1min
[0064]
(9)将制备管置于新的1.5ml的离心管中，在制备管膜中央加80～200μl buffer te(buffer te预热到65℃)，室温静置1min，12000
×
g离心1min，洗脱基因组dna，最后得到血液基因组dna；
[0065]
1.3血液基因组质量检测
[0066]
首先吸取1μl的dna待测样本，使用nanodrop nd-2000微光分光光度计检测所提取dna的浓度，od
260
/od
280
的比值均在1.8～2.0之间。然后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测dna的完整度，最后将纯度和完整度较高的dna检测样本，稀释至20ng/ul，置于-80℃冰箱保存，防止降解以便于后续实验使用。
[0067]
1.4微卫星位点的选择
[0068]
微卫星的染色体位置和引物序列及退火温度见表1。
[0069]
表1 16对微卫星引物位点及退火温度
[0070]
[0071][0072]
注：引物由上海生工合成。
[0073]
表2 pcr反应体系
[0074][0075]
表3微卫星位点pcr扩增反应程序
[0076]
[0077][0078]
1.5str分型测序
[0079]
将荧光pcr产物送至上海生工生物技术有限公司，进行毛细管电泳实验。
[0080]
1.5.1电泳检测
[0081]
每个引物随机挑4个样品进行检测，通过在1％琼脂糖凝胶、150v、100ma、20min电泳观察有无目的基因条带。
[0082]
1.5.2str检测
[0083]
(1)取96孔反应板，使用记号笔标明板名、实验日期。
[0084]
(2)制作电子版str检测表，并自动生成上机表。
[0085]
(3)使用连续加样器，吸取990μl hidi和10μl liz500的混合物，加入到96孔反应板中，每孔10μl。
[0086]
(4)将96孔板置于平板离心机中，1200rmp离心15s。
[0087]
(5)使用12排10μl排枪，对照str检测表，在96孔板对应的孔中加入1μl的样品。
[0088]
(6)将96孔板置于平板离心机中，1200rmp离心15s。
[0089]
(7)使用封板膜密封96孔板，振荡，将96孔板置于平板离心机中，1200rmp离心30s。置于pcr仪。
[0090]
(8)变性程序为98℃，5min，程序结束后立即将96孔板置于冰水混合物上急速冷却。
[0091]
(9)将96孔板置于平板离心机中，1200rmp离心15s。
[0092]
(10)使用3730xl设备检测str样本。
[0093]
1.6统计原理与基因型判定
[0094]
(1)等位基因频率(allelefrequency)是指某一群体在某个微卫星座位上，其中一个等位基因占全部等位基因数的比率。
[0095][0096]
式中：ηi为第i个等位基因纯合的个体数；jn为与i共显的第n个等位基因；n为群体中的个体数。
[0097]
(2)基因杂合度(heterozygosity)是度量群体变异的一个最是最适参数，可以反映群体的一致度。期望杂合度越高，群体的遗传变异越丰富，而且，在一个群体中，观测杂合度越接近期望杂合度，越能说明该群体受外来选择及近交等因素的影响越小。由等位基因频率计算杂合度，群体内平均杂合度(h)计算。
[0098][0099]
式中：pi为某一位点上第i个等位基因频率；n为某一位点上等位基因数。
[0100]
(3)多态信息含量(polymorphism information content，pic)：表示微卫星座位
多态性的高低。
[0101][0102]
式中，n为等位基因数目；pi为第i个等位基因的频率；pj第j个等位基因的频率。
[0103]
(4)有效等位基因数(effective number ofalleles)：用来衡量群体遗传变异程度，有效等位基因数为纯合度的倒数。
[0104][0105]
1.6.1基因型判定方法
[0106]
genemapper4.0软件自动生成独立的图谱文件并读出、峰值的大小、片段长度的大小、峰面积的大小，同时判断纯合子(单峰)或杂合子(双峰)。将genealex程序加载到加载项中，统计等位基因数、多态信息含量、观察杂合度和期望杂合度和计算等位基因数。
[0107]
1.6.2hardy-weinberg平衡
[0108]
在一个大群体中没有经过人为(人工选择，迁移)等因素的干扰，完全遵从随机交配的原则，那么这个群体的每代之间的基因频率和基因型频率变化非常小或者不变，这种群体称之为平衡的孟德尔群体。在实际应用研究中.检验每个群体hardy-weinberg平衡是否成立的方法有g(g-statistic)统计、x2(x
2-statistic)和确切性概率检测(exact probability test)。而连锁不平衡分析指在某一种群中，不同位点上某两个等位基因出现在一起的频率与预期的随机频率之间存在明显差异的现象。
[0109]
1.6.3主坐标分析
[0110]
使用genalex软件根据遗传距离绘制出主坐标分析图，通过主坐标分析图可以分析出物种个体或者群体的遗传差异。
[0111]
1.6.4遗传距离
[0112]
遗传距离通常是说在两个物种种群之间在同一基因座位上等位基因的频率来计算群体遗传差异的指标。可以用来表达品种间的遗传变异。遗传距离的大小与分化时间的长短和群体间生活地理位置的远近有极大的关系。
[0113]
2.结果和分析
[0114]
2.1基因组dna提取
[0115]
本实验采取试剂盒提取法提取延边牛和延黄牛血液基因组dna，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检查提取dna的完整度。结果见图1，本发明提供的延边牛和延黄牛血液基因组dna具有良好的完整性。
[0116]
2.2pcr产物凝胶电泳检测
[0117]
从预实验结果(图2)中可以看出，在检测16个微卫星位中9号位点引物eth185未达到预期的扩增效果，能否扩增出相应的目的条带，所以将其剔除，其他位点均符合预期结果，可以用于后续的研究。
[0118]
2.3荧光pcr产物的str分型
[0119]
基于abi-3730xl型dna测序平台对扩增产物进行扫描，得到扩增分型结果，例如延边牛yb1个体在hel5位点的str分型结果见图3。
[0120]
2.4所选微卫星座位的遗传参数
[0121]
对系谱明确的60头成年延边牛样本和88头延黄牛血液样本按照上述扩增方法进行检测。检测结果见附表4～表8(表格中灰底表格为3个共有等位基因型及基因频率)。
[0122]
表4
[0123]
[0124][0125]
表5
[0126]
[0127][0128]
表6
[0129]
[0130][0131]
表7
[0132]
[0133][0134]
表8
[0135]
[0136]
[0137]
[0138][0139]
15对荧光str位点共检测到179个等位基因见表5，平均每个位点12个，其中cssm66的等位基因数量最多，共有20个。其中有4个位点的等位基因小于10的共有4个位点，eth3位点检测到的基因型最少，为3个。整个群体的有效等位基因数(ne)为4.376，均大于2.0，其中cssm66的位点最多，为8.692；eth3位点上最少，为2.034。基因杂合度(h)，可以反映出群体内遗传变异程度，经过统计，15个微卫星位点平均观测杂合度在0.771，期望杂合度在0.740，观测杂合度和期望杂合度之间差异较小，15个座位均为中高度多态位点，其中仅有eth3位点为中度多态位点，pic值为0.416在(0.25＜0.416＜0.5)，其他均为高度多态位点(pic＞0.5)，hel13位点的多态信息含量最高为0.822。
[0140]
表5 15对str引物的遗传学参数
[0141][0142]
2.5微卫星位点在2个群体中的群体遗传学参数
[0143]
2.5.1等位基因数
[0144]
15对微卫星引物在延边牛和延黄牛品种中检测到的等位基因数目见表6。在延边牛群体中平均检测到9.6个等位基因，延黄牛检测到10.4个等位基因；位点eth3座位上的等位基因数最少为3，位点cssm66座位上最多为16.5。
[0145]
表6 15对微卫星标记在2个群体中的等位基因数
[0146][0147]
2.5.2多态信息含量
[0148]
15对荧光str引物在每一个群体中检测到的pic含量见表6，这15对引物在延边牛和延黄牛群体中均为高度多态性位(0.416＜pic＜0.874)，可以充分的显示出每一个群体的遗传信息。
[0149]
2.5.3杂合度
[0150]
15对荧光引物在各个群体检测到的杂合度见表7。延边牛的群体杂合度0.744，延黄牛的群体杂合度范围为0.727，两个群体均有较为丰富的遗传变异。
[0151]
表7 15个微卫星基因座在2个牛品种中的遗传多样性分析
[0152][0153][0154]
2.5.4f统计量
[0155]
表8为15个微卫星位点在延边牛和延黄牛的f－统计量，15个str座位在2个群体内的固定系数(fst)在0.003-0.022之间变动，其中位点csrm60和位点bm1818最低，位点hel5最高；2个群体的个体固定系数(fit)的范围为-0.808-0.076，最低的位点eth3，但最髙的位点为cssm66；整个群体的近交系数(fis)的范围为-0.82-0.114，其中位点eth225，eth25，hel5，mm12，csrm60，eth 3，inra032，bm1824近交系数均为负值，表现为杂合子过剩，其他位点显示出杂合子缺失的情况。
[0156]
表8关于延边牛和延黄牛15个微卫星座位f-统计量
[0157][0158]
2.6hardy-weinberg平衡
[0159]
本实验中由表9可知，在延边牛和延黄牛两个群体中都出现hardy-weinberg平衡与连锁不平衡的现象，而出现这种现象的原因有可能是因为过度的人工选择，使群体内出现近亲婚配造成的。
[0160]
表9 15个微卫星位点在延边牛和延黄牛两个群体中hardy-weinberg平衡检测结果
[0161][0162][0163]
注：*p＜0.05，**p＜0.01。
[0164]
2.7遗传距离
[0165]
遗传距离是表示物种间亲缘关系远近的重要指标，一般用来描述群体结构变异的程度。它是研究种群遗传多样性的基础，通常是根据基因频率的函数计算遗传距离。本试验中利用genalex软件计算延边牛和延黄牛的遗传距离为0.052，品种之间标准遗传距离小，说明分化时间短，但也存在着差异(见表10)。
[0166]
表10延边牛和延黄牛nei's遗传距离
[0167][0168]
2.8主坐标分析图
[0169]
利用通过genalex软件，计算出遗传距离绘制出主坐标分析图，可以清楚的看出个体间或群体间在遗传结构方面存在的差异，根据主坐标分析(pcoa)对延边牛和延黄牛两个群体分析，显示出两个群体的分化并不明显。
[0170]
2.9利用特有等位基因型进行品种鉴定
[0171]
2.9.1特有等位基因及频率
[0172]
特有等位基因是指在不同的群体中，某一位点上出现的基因型是其他位点所没有的等位基因。
[0173]
两个品种的特有等位基因见表11，本试验在延边牛群体中共检测到22个特有等位基因，延黄牛共检测到32个等位基因，但是普遍基因频率不高，认为利用特有等位基因进行品种鉴别的方法是可行的，但是对样品的数量有一定的要求。
[0174]
表11延边牛和延黄牛特有等位基因
[0175]
[0176][0177]
注：“/”左边为特有基因长度，右边为特有基因步率(％)。
[0178]
2.9.2延边牛和延黄牛品种分子身份证的构建
[0179]
本试验中csrm60和hel5位点为15个位点中特有等位基因频率较高的位点，其他位点中虽然发现特有等位基因但是频率较低，因此利用csrm60和hel5位点在延边牛和延黄牛中检测出来的特有等位基因型进行延边牛和延黄牛品种的鉴别，首先将位点扩增出来的基因型赋予不同的数值(表12)，以此来构建延边牛和延黄牛的分子身份证如表13所示，可以根据延边牛和延黄牛自身特有的分子身份证，将两个品种进行区分。
[0180]
表12 csrm60和hel5引物所在位点的基因型赋值标准
[0181][0182]
表13延边牛和延黄牛品种的分子身份证编码
[0183][0184]
2.9.3利用共有基因型频率进行品种鉴定
[0185]
表14延边牛和延黄牛共有基因型的基因频率
[0186][0187]
为了增加品种鉴别的准确性，本实验选用3对具有共有基因型的微卫星位点的等位基因频率(表14)，构建2种牛的鉴定柱形图，如图5所示，通过eth225、hel5、csrm60位点组合可以区分延边牛和延黄牛，在eth225位点上，延边牛在共有基因型140/140显著高于延黄牛；在csrm60位点上，延边牛在共有基因型91/103显著低于延黄牛；在hel5位点延边牛基因
型频率低于延黄牛。可见，通过统计分析在所发现的延边牛和延黄牛共有等位基因型中，这三个微卫星位点的共有等位基因型之间差异与其他微卫星位点的共有等位基因型相比，共有基因型差异相对明显。因此可以通过这3个位点组合可以区分这两个品种。
[0188]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种用于鉴别延边牛和延黄牛的微卫星标记，其特征在于，包括以下两种以上微卫星标记：eth225、csrm60和hel5；所述eth225的扩增引物包括核苷酸序列如seq id no:1所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:2所示的反向引物；所述csrm60的扩增引物包括核苷酸序列如seq id no:3所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:4所示的反向引物；所述hel5的扩增引物包括核苷酸序列如seq id no:5所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:6所示的反向引物。2.一种用于鉴别延边牛和延黄牛的检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：用于扩增权利要求1所述微卫星标记的引物和pcr反应预混液。3.根据权利要求2所述检测试剂盒，其特征在于，所述pcr反应预混液包括dntp、含镁离子的taqbuffer和taq酶。4.权利要求1所述微卫星标记或权利要求2或3所述检测试剂盒在鉴别延边牛和延黄牛中的应用。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述鉴别延边牛和延黄牛的方法，包括以下步骤：提取样本的基因组dna；将提取的基因组dna为模板，以扩增权利要求1所述微卫星标记的引物进行pcr扩增，得到pcr产物；根据所述pcr产物的基因型，判断样本为延边牛或延黄牛。6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，当微卫星标记为csrm60和hel5时，根据延边牛和延黄牛中检测出来的特有等位基因，参照赋值标准，得到样本的分子身份证，根据延边牛或延黄牛的分子身份证判断样本为延边牛或延黄牛。7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述延边牛的csrm60位点的特有等位基因包括89bp；所述延边牛的hel5位点的特有等位基因包括147bp、155bp、158bp和159bp；所述延黄牛的csrm60位点的特有等位基因包括81bp和105bp；所述延黄牛的hel5位点的特有等位基因包括148bp、149bp和156bp。8.根据权利要求5所述应用，其特征在于，当微卫星标记为eth225、csrm60和hel5时，根据延边牛和延黄牛中检测出来的共有等位基因型的基因频率进行延边牛和延黄牛品种的鉴别。9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，当微卫星标记为eth225时，延边牛和延黄牛中检测出来的共有等位基因型为140/140；当微卫星标记为hel5时，延边牛和延黄牛中检测出来的共有等位基因型为167/167；当微卫星标记为csrm60时，延边牛和延黄牛中检测出来的共有等位基因型为91/103。10.根据权利要求8所述应用，其特征在于，在eth225位点上，延边牛的共有等位基因型频率显著高于延黄牛，在hel5位点，延边牛的共有等位基因型频率低于延黄牛；在csrm60位点，延边牛的共有等位基因型频率低于延黄牛。

技术总结
本发明提供了一种用于鉴别延边牛和延黄牛的微卫星标记及其应用，属于分子标记技术领域。一种用于鉴别延边牛和延黄牛的微卫星标记，包括以下两种以上微卫星标记：ETH225、CSRM60和HEL5；所述ETH225的扩增引物包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；所述CSRM60的扩增引物包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；所述HEL5的扩增引物包括SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。本发明分别测定了15个微卫星位点在延边牛和延黄牛2个群体中的群体遗传学参数，筛选得到3个微卫星位点，可实现延边牛和延黄牛品种的鉴别，且具有准确率高，快速简便的特点。快速简便的特点。快速简便的特点。


技术研发人员：夏广军 徐红艳 武泽文 徐美娜
受保护的技术使用者：延边大学
技术研发日：2023.08.07
技术公布日：2023/10/15