辣椒白粉病抗性连锁InDel标记及其应用

辣椒白粉病抗性连锁indel标记及其应用
技术领域
1.本发明属于植物生物工程技术领域，具体涉及一种用于辣椒白粉病抗性辅助育种的indel标记及其应用。


背景技术：

2.辣椒(capsicum spp.)又名番椒、海椒、辣子、辣角等，是茄科一年或有限多年生草本植物，其栽培面积在我国蔬菜作物中位居首位，是世界范围内最为重要的蔬菜和辛辣香料作物之一。
3.白粉病是辣椒种植中最常见、危害最大的病害之一。目前，生产中白粉病防治方法主要有栽培管理、药剂防治和抗性育种等。由于辣椒白粉病病原菌内外兼生，在侵染辣椒初期以内生菌丝为主，难以在早期发现病害，待叶片出现白粉菌丝时病情已经发展到一定程度，因此造成辣椒白粉病防治变得困难。一般认为，抗性育种是控制这种病害最经济、有效和环境友好的方法。因此，优质、抗病是辣椒新品种选育的关键目标。
4.现有技术存在的问题：indel标记是指由核苷酸水平上碱基的插入或缺失多态性，在植物基因组中有较高的分布频率，具有遗传稳定性高、分布广、多态性强等优点。随着分子标记技术的日益成熟和完善，indel标记在分子标记辅助育种、种质资源分析、基因定位及遗传图谱构建等方面发挥重要作用，但在有关辣椒白粉病抗性的分子标记开发利用方面的研究还未见报道。


技术实现要素：

5.鉴于现有技术的不足，本发明提供了一种与辣椒白粉病抗性连锁的indel标记引物及其应用。为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
6.1、与辣椒白粉病抗性连锁的indel标记capm10，该标记包括299bp的抗病序列，如序列表seq id no：3所示；269bp的感病序列，如序列表seq id no：4所示。该标记可以采用两条长度均为22bp的正向引物capm10-f和反向引物capm10-r进行鉴定；capm10-f如序列表seq id no：1所示，capm10-r如序列表seq id no：2所示。
7.2、与辣椒白粉病抗性连锁的indel标记获取方法，包括如下步骤：
8.(1)选用辣椒白粉病高抗材料c245为母本，高感材料c110为父本(c245和c110均为甘肃农业大学园艺学院蔬菜遗传与分子育种实验室选育的高代自交系，申请人声明自申请日起免费向公众开放获取)，2021年配置杂交组合f1，2022年由f1代植株自交得f2。
9.(2)待试验地白粉病大量自然发病并且一致性较好后对f2群体进行白粉病病情鉴定，最后选取21株白粉病抗病单株和22株感病单株，采集植株幼嫩叶片构建抗池rb和感池sb；
10.(3)分别提取c245、c110、抗池rb和感池sb叶片dna进行文库构建，利用illumina hiseq2500进行基因组重测序。
11.(4)通过预处理软件fastp(version:0.19.5)，对原始测序序列raw reads进行质
量检测，去除含有带接头的、n(非agct)碱基大于等于5的、低质量的reads等，得到clean reads。
12.(5)利用bwa(version:0.7.12)软件将cleanreads比对到参考基因组上，以确定reads在参考基因组(zunla-1)上的位置，比对算法为bwa men，参数为默认参数。比对结果经过samtools(version:1.4)软件转换格式并排序后，利用picard(version:4.1.0.0)软件去除pcr重复reads。通过测序错误率、数据量、比对率、捕获区间内覆盖度等来评估样本数据是否达到标准，符合标准则进行后续分析。
13.(6)基于样本与参考基因组的比对结果，使用samtools软件的mpileup模块默认参数检测样本中的snp和indel位点。
14.(7)利用snpeff软件注释snp和indel的功能，并统计突变类型和单碱基替换类型，并将检测到的基因组变异信息利用circos图进行可视化展示。
15.(8)最后采用snp-index法计算与性状关联的候选区域。
16.snp-index是一个与snp位点测序深度相关的参数，该参数指子代某个位点含有突变亲本来源snp的reads数与测到该位点的总reads数的比值。δsnp-index是两个子代池中在相同位点的index值的差值，算出其在统计学上95％的和99％的置信线，拟合线超出置信线的染色体区域为可能的表型连锁区域。最后，将辣椒白粉病抗性区间定位在5号染色体上，区间大小约为4.55mb(chr05:7200302-11748632)。
17.(9)在候选区域内寻找亲本间纯合并且有差异的indel位点，并基于参考基因组提取该位点上下游500bp共1001bp的基因组序列，利用primer premier 5引物设计工具设计indel标记引物，最终选取63个差异indel成功设计引物。
18.(10)利用63对indel标记引物在亲本间进行多态性扩增检测，扩增条带清晰并且有明显差异的有21对。以indel标记capm10在亲本间及f1的扩增为例，如附图1所示：m：dna marker，a：抗病亲本c245基因型，b：感病亲本c110基因型，h：f1感病杂合基因型。
19.(11)用亲本间多态性明显的21对indel标记在f2群体中进行扩增，最终确定indel分子标记capm10与辣椒白粉病抗性紧密连锁。
20.3、鉴别筛选辣椒抗白粉病育种材料indel标记的应用，包括如下步骤：
21.(1)选取19份辣椒白粉病抗病自然群体单株，和32份辣椒白粉病感病自然群体单株。分别提取每个单株的基因组dna备用。
22.(2)利用capm10标记引物对步骤(1)中提取的51份dna样品进行扩增。pcr扩增体系为10μl，包括5μl 2
×
taq pcr mastermixⅱ，1μl的dna模板，0.5μl capm10-f，0.5μl capm10-r，3μl ddh2o，最后封石蜡油。
23.(3)pcr反应程序为:94℃预变性3min，94℃变性30sec；59℃退火30sec，72℃延伸25sec，35个循环，72℃再延伸5min，4℃保存；
24.(4)pcr扩增产物利用12％(v/v)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)进行分离检测，pcr产物上样1μl，电压250v，电流120ma，1
×
tbe电泳缓冲液电泳80min。12％非变性(v/v)聚丙烯酰胺凝胶包括30％聚丙烯酰胺母液(丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺＝29：1)16ml，10
×
tbe 4ml，ddh2o 20ml，10％过硫酸铵(ap)400μl，temed 40μl；
25.(5)电泳结束后，首先将凝胶置于固定液中(50ml无水乙醇，3ml冰醋酸，447ml蒸馏水)在摇床上固定15min，然后将凝胶转入银染液中(0.1％的硝酸银500ml，1.2ml甲醛)在摇
床上银染10min，之后用500ml蒸馏水对凝胶进行漂洗，接着将凝胶放入显影液(1.5％氢氧化钠500ml，5ml甲醛)中在摇床上缓慢摇动直至条带清晰，最后将凝胶用蒸馏水再次漂洗后观察并拍照。
26.(6)通过条带大小进行抗、感病鉴定，含有299bp的为抗病，含有269bp或杂合条带均为感病。一致性达84.3％，达到了分子标记筛选的目的。
27.4.辣椒抗白粉病indel分子标记capm10在辣椒白粉病抗性鉴定中的应用，所述分子标记capm10包括299bp的抗病序列，如序列表seq id no：3所示；269bp的感病序列，如序列表seq id no：4所示。
28.有益效果：本发明的关键创新点是发掘了与辣椒白粉病抗性相关的indel位点，开发出一个与辣椒白粉病抗性连锁的indel标记。与辣椒白粉病抗性连锁的indel标记capm10位于chr05染色体8073363bp位置，其中indel基因型为a型(aacatagatatagatatagatat agatatag)时辣椒对白粉病表现为抗病，indel基因型为b型(a)或h型(aacataga tatagatatagatatagatatag/a)时辣椒对白粉病表现为感病，该位置的基因型可以作为检测辣椒抗、感白粉病的indel标记。本发明在幼苗期即能判断辣椒对白粉病的抗、感性，检测效率达84.3％，可用于辣椒抗白粉病育种材料的早期筛选，缩短育种年限，加速辣椒抗白粉病育种进程。
附图说明
29.图1indel分子标记引物对capm10在c245、c110和f1中的电泳图。
30.m表示为dna marker，a代表抗病亲本c245基因型，b代表感病亲本c110基因型，h代表f1感病杂合基因型。
31.图2indel标记引物对capm10在51份辣椒自然群体中的电泳图。
32.m表示为dna marker，前19个dna样品表型为抗病，后32个dna样品表型为感病。
33.图3indel标记引物对capm10扩增产物的多重序列比对。
具体实施方式
34.为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
35.实施例1
36.本实施例提供与辣椒白粉病抗性连锁的indel标记引物对capm10，包括两条长度均为22bp的正向引物capm10-f和反向引物capm10-r。
37.capm10-f：acataaattaagattgggaccg；
38.capm10-r：tggtaagcttgtttaacgatga。
39.经过pcr扩增并进行产物序列测定，其中抗病序列为299bp，序列如图3(capm10-r)和序列表seq no.3所示。感病序列为269bp，序列如图3(capm10-s)和序列表seq no.4所示。
40.实施例2
41.本实施例提供与辣椒白粉病抗性连锁的indel标记引物获取方法，包括如下步骤：
42.(1)选用辣椒白粉病高抗材料c245为母本，高感材料c110为父本(c245和c110均为甘肃农业大学园艺学院蔬菜遗传与分子育种实验室选育的高代自交系)，2021年配置杂交组合f1，2022年由f1代植株自交得f2。
43.(2)待试验地白粉病大量自然发病并且一致性较好后对f2群体进行白粉病病情鉴定，最后选取21株白粉病抗病单株和22株感病单株，采集植株幼嫩叶片构建抗池rb和感池sb；
44.(3)分别提取c245、c110、抗池rb和感池sb叶片dna进行文库构建，利用illumina hiseq2500进行基因组重测序。
45.(4)通过预处理软件fastp(version:0.19.5)，对原始测序序列raw reads进行质量检测，去除含有带接头的、n(非agct)碱基大于等于5的、低质量的reads等，得到clean reads。
46.(5)利用bwa(version:0.7.12)软件将clean reads比对到参考基因组上，以确定reads在参考基因组(zunla-1)上的位置，比对算法为bwa men，参数为默认参数。比对结果经过samtools(version:1.4)软件转换格式并排序后，利用picard(version:4.1.0.0)软件去除pcr重复reads。通过测序错误率、数据量、比对率、捕获区间内覆盖度等来评估样本数据是否达到标准，符合标准则进行后续分析。
47.(6)基于样本与参考基因组的比对结果，使用samtools软件的mpileup模块默认参数检测样本中的snp和indel位点。
48.(7)利用snpeff软件注释snp和indel的功能，并统计突变类型和单碱基替换类型，并将检测到的基因组变异信息利用circos图进行可视化展示。
49.(8)最后采用snp-index法计算与性状关联的候选区域。
50.snp-index是一个与snp位点测序深度相关的参数，该参数指子代某个位点含有突变亲本来源snp的reads数与测到该位点的总reads数的比值。δsnp-index是两个子代池中在相同位点的index值的差值，算出其在统计学上95％的和99％的置信线，拟合线超出置信线的染色体区域为可能的表型连锁区域。最后，将辣椒白粉病抗性区间定位在5号染色体上，区间大小约为4.55mb(chr05:7200302-11748632)。
51.(9)在候选区域内寻找亲本间纯合并且有差异的indel位点，并基于参考基因组提取该位点上下游500bp共1001bp的基因组序列，利用primer premier 5引物设计工具设计indel标记引物，最终选取63个差异indel成功设计引物。
52.(10)利用63对indel标记引物在亲本间进行多态性扩增检测，扩增条带清晰并且有明显差异的有21对。以indel标记capm10在亲本间及f1的扩增为例，如附图1所示：m：dna marker，a：抗病亲本c245基因型，b：感病亲本c110基因型，h：f1感病杂合基因型。
53.(11)用亲本间多态性明显的21对indel标记在f2群体中进行扩增，最终确定indel分子标记capm10与辣椒白粉病抗性紧密连锁。
54.实施例3
55.本实施例提供鉴别筛选辣椒抗白粉病育种材料indel标记的应用，包括如下步骤：
56.(1)选取19份辣椒白粉病抗病自然群体单株，和32份辣椒白粉病感病自然群体单株。分别提取每个单株的基因组dna备用。
57.(2)利用capm10标记引物对步骤(1)中提取的51份dna样品进行扩增。pcr扩增体系为10μl，包括5μl 2
×
taq pcr mastermixⅱ，1μl的dna模板，0.5μl capm10-f，0.5μl capm10-r，3μl ddh2o，最后封石蜡油。
58.(3)pcr反应程序为:94℃预变性3min，94℃变性30sec；59℃退火30sec，72℃延伸25sec，35个循环，72℃再延伸5min，4℃保存；
59.(4)pcr扩增产物利用12％(v/v)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)进行分离检测，pcr产物上样1μl，电压250v，电流120ma，1
×
tbe电泳缓冲液电泳80min。12％非变性(v/v)聚丙烯酰胺凝胶包括30％聚丙烯酰胺母液(丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺＝29：1)16ml，10
×
tbe 4ml，ddh2o 20ml，10％过硫酸铵(ap)400μl，temed 40μl；
60.(5)电泳结束后，首先将凝胶置于固定液中(50ml无水乙醇，3ml冰醋酸，447ml蒸馏水)在摇床上固定15min，然后将凝胶转入银染液中(0.1％的硝酸银500ml，1.2ml甲醛)在摇床上银染10min，之后用500ml蒸馏水对凝胶进行漂洗，接着将凝胶放入显影液(1.5％氢氧化钠500ml，5ml甲醛)中在摇床上缓慢摇动直至条带清晰，最后将凝胶用蒸馏水再次漂洗后观察并拍照。
61.(6)通过条带大小并且结合表型(前19个dna样品表型为抗病，后32个dna样品表型为感病)与附图1中的抗、感病条带进行比对(a型为抗病，b型或h型均为感病)，一致性达84.3％，达到了分子标记筛选的目的。
62.以上所述仅是本技术的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本技术的保护范围。

技术特征：
1.一种与辣椒白粉病抗性连锁的indel标记capm10，其特征在于所述标记包括如序列表seq id no：3所示的抗病序列和如序列表seq id no：4所示的感病序列。2.根据权利要求1所述一种与辣椒白粉病抗性连锁的indel标记capm10，其特征在于所述标记可以采用两条长度均为22bp的正向引物capm10-f和反向引物capm10-r进行鉴定；capm10-f如序列表seq id no：1所示，capm10-r如序列表seq id no：2所示。3.如权利要求1所述一种与辣椒白粉病抗性连锁的indel标记capm10的获取方法，包括如下步骤：(1)选用辣椒白粉病高抗材料c245为母本，高感材料c110为父本，2021年配置杂交组合f1，2022年由f1代植株自交得f2；(2)待试验地白粉病大量自然发病并且一致性较好后对f2群体进行白粉病病情鉴定，最后选取21株白粉病抗病单株和22株感病单株，采集植株幼嫩叶片构建抗池rb和感池sb；(3)分别提取c245、c110、抗池rb和感池sb叶片dna进行文库构建，利用illumina hiseq2500进行基因组重测序；(4)通过预处理软件fastp，对原始测序序列raw reads进行质量检测，去除含有带接头的、n碱基大于等于5的、低质量的reads等，得到clean reads；(5)利用bwa软件将clean reads比对到参考基因组上，以确定reads在参考基因组上的位置，比对算法为bwa men，参数为默认参数，比对结果经过samtools软件转换格式并排序后，利用picard软件去除pcr重复reads，通过测序错误率、数据量、比对率、捕获区间内覆盖度等来评估样本数据是否达到标准，符合标准则进行后续分析；(6)基于样本与参考基因组的比对结果，使用samtools软件的mpileup模块默认参数检测样本中的snp和indel位点；(7)利用snpeff软件注释snp和indel的功能，并统计突变类型和单碱基替换类型，并将检测到的基因组变异信息利用circos图进行可视化展示；(8)最后采用snp-index法计算与性状关联的候选区域；(9)在候选区域内寻找亲本间纯合并且有差异的indel位点，并基于参考基因组提取该位点上下游500bp共1001bp的基因组序列，利用primer premier 5引物设计工具设计indel标记引物，最终选取63个差异indel成功设计引物；(10)利用63对indel标记引物在亲本间进行多态性扩增检测，扩增条带清晰并且有明显差异的有21对；(11)用亲本间多态性明显的21对indel标记在f2群体中进行扩增，最终确定indel标记capm10可作为鉴别筛选辣椒抗白粉病育种材料的候选分子标记。4.权利要求1所述的一种与辣椒白粉病抗性连锁的indel标记capm10的应用，包括如下步骤：(1)选取19份辣椒白粉病抗病自然群体单株，和32份辣椒白粉病感病自然群体单株，分别提取每个单株的基因组dna备用；(2)利用capm10标记引物对步骤(1)中提取的51份dna样品进行扩增，pcr扩增体系为10μl，包括5μl 2
×
taq pcr mastermixⅱ，1μl的dna模板，0.5μl capm10-f，0.5μlcapm10-r，3μl ddh2o，最后封石蜡油；(3)pcr反应程序为:94℃预变性3min，94℃变性30sec；59℃退火30sec，72℃延伸
25sec，35个循环，72℃再延伸5min，4℃保存；(4)pcr扩增产物利用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离检测，pcr产物上样1μl，电压250v，电流120ma，1
×
tbe电泳缓冲液电泳80min，12％非变性聚丙烯酰胺凝胶包括30％聚丙烯酰胺母液16ml，10
×
tbe 4ml，ddh2o 20ml，10％过硫酸铵400μl，temed 40μl；(5)电泳结束后，首先将凝胶置于固定液中在摇床上固定15min，然后将凝胶转入银染液中在摇床上银染10min，之后用500ml蒸馏水对凝胶进行漂洗，接着将凝胶放入显影液中在摇床上缓慢摇动直至条带清晰，最后将凝胶用蒸馏水再次漂洗后观察并拍照，(6)通过条带大小进行抗、感病鉴定，含有299bp的为抗病，含有269bp或杂合条带均为感病。5.辣椒抗白粉病indel分子标记capm10在辣椒白粉病抗性鉴定中的应用，其特征在于所述分子标记capm10包括299bp的抗病序列，如序列表seq id no：3所示；269bp的感病序列，如序列表seq id no：4所示。

技术总结
本发明提供了一种用于辣椒白粉病抗性辅助育种的InDel标记引物对CaPm10及其应用。与辣椒白粉病抗性连锁的InDel标记位点位于Chr05染色体8073363bp位置，抗病材料中该位点碱基为AACATAGATATAGATATAGATATAGATATAG，感病材料中该位点发生30bp碱基片段缺失，突变为A。因此，当InDel基因型为A型时(AACATAGATATAGATATAGATATA GATATAG)辣椒对白粉病表现为抗病，InDel基因型为B(A)型或杂合条带H(AACATAG ATATAGATATAGATATAGATATAG/A)型时辣椒对白粉病表现为感病，该位置的基因型可以作为检测辣椒抗、感白粉病的InDel标记。本发明在幼苗期即能判断辣椒对白粉病的抗、感性，可用于辣椒抗白粉病育种材料的早期筛选，缩短育种年限，加速辣椒抗白粉病育种进程。加速辣椒抗白粉病育种进程。加速辣椒抗白粉病育种进程。


技术研发人员：魏兵强 张涛 马艳 李伟
受保护的技术使用者：甘肃农业大学
技术研发日：2023.08.01
技术公布日：2023/10/15