一种高载药量的中空聚多巴胺纳米材料的制备方法和应用

1.本发明属于纳米载体药物领域。


背景技术：

2.癌症是一种严重威胁人类健康的疾病，由于细胞的异常增殖和分化，最终导致肿瘤的形成。目前，癌症化疗是主要的治疗方法之一，化疗药物在目前的癌症治疗中起着至关重要的作用。然而，传统的化疗方法存在一些严重的缺陷，这些缺陷限制了其在临床应用中的效果和安全性。其中最主要的问题是化疗药物的非特异性分布和药物耐受性的发展。在传统的化疗方法中，药物通过血液循环输送到患者的肿瘤部位。然而，由于血液供应的不稳定性和肿瘤内部的复杂结构，化疗药物往往无法有效地积累在肿瘤组织中，导致药物的浪费和不良的治疗效果。此外，化疗药物还会对患者的正常细胞产生毒副作用，给患者的生活质量和治疗效果带来不利影响。
3.为了解决这些问题，纳米技术被引入到药物递送领域。纳米载体作为一种有效的药物递送平台，能够克服传统化疗方法的局限性。纳米载体可以将化疗药物包裹在其内部，并通过靶向机制将药物精确地输送到肿瘤组织。相比于传统的输送方式，纳米载体能够提高药物在肿瘤组织中的积累，并减少对正常细胞的损害。
4.此外，纳米载体还具有可调控的药物释放特性。通过调整纳米载体的结构和组成，可以实现药物的缓释或靶向释放，从而提高药物在肿瘤组织中的长效作用和治疗效果。但现阶段，大多数纳米载体的载药效率低下，生物相容性差，且辅助治疗的功能低下限制了其在临床作为药物载体的应用，寻找并开发高载药量的功能载体是亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明要解决现有纳米载体载药效率低下，生物相容性差，且辅助治疗的功能低的问题，而提供一种高载药量的中空聚多巴胺纳米材料的制备方法和应用。
6.一种高载药量的中空聚多巴胺纳米材料的制备方法，它是按以下步骤进行：
7.一、zif-67的合成：
8.将六水硝酸钴和2-甲基咪唑溶解于甲醇中，然后搅拌生成紫色沉淀物，最后离心分离、洗涤及干燥，得到zif-67粉末；
9.二、中空聚多巴胺纳米材料的合成：
10.①
将zif-67粉末溶解于甲醇中，得到zif-67溶液；
11.②
将盐酸多巴胺溶解于甲醇中，得到盐酸多巴胺溶液；
12.③
将zif-67溶液和盐酸多巴胺溶液混合并水浴超声，然后转移至温度为50℃～60℃的水浴中，搅拌4h～6h，得到黑色混合溶液，将黑色混合溶液离心分离、洗涤及干燥，得到中空聚多巴胺纳米材料；
13.所述的zif-67溶液中zif-67的质量与盐酸多巴胺溶液中盐酸多巴胺的摩尔比为1mg:(0.002～0.006)mmol。
14.高载药量的中空聚多巴胺纳米材料的应用，它用于盐酸小檗碱、阿霉素或吲哚菁绿的载药。
15.本发明的有益效果是：
16.本发明制备的中空聚多巴胺纳米材料具有独特的大π键结构，能够负载多种可通过π-π堆积相互作用的药物，并一定程度上改善这些药物的溶解度。此外，cohpda具有消耗谷胱甘肽(gsh)的能力，能改善肿瘤细胞内高gsh的问题，进而提升产ros的药物在肿瘤中药效。以盐酸小檗碱为例，制备了载盐酸小檗碱的纳米材料，相较于单纯的bbr，cohpda@bbr能显著提高bbr对肿瘤细胞的抑制作用，尤其是在808nm激光的联合治疗下，4t1细胞的存活率仅为3.09
±
2.5％。而等量的bbr作用下，4t1细胞存活率高达97.62
±
11.14％，对4t1细胞的作用影响甚微。体外抗肿瘤的效果评价上也具有同样的效果。
17.cohpda@bbr提高bbr生物利用度的原因在于，首先cohpda作为纳米材料具有提高药物的溶解度的特性，能改善bbr的溶解性差的问题，提高细胞对cohpda@bbr摄取效果；此外，cohpda能消耗gsh，进而上调肿瘤细胞内部氧化应激，从而提高肿瘤细胞对与bbr的敏感度，低水平的gsh也能使bbr在肿瘤细胞内部产生更多的活性氧，诱导肿瘤细胞凋亡；cohpda@bbr在近红外光的辐射可以升高局部温度，起到光热治疗的效果，且能提高药物靶向肿瘤细胞的线粒体和细胞核。基于以上几点原因，cohpda@bbr相比于bbr有更高的肿瘤细胞抑制效果。
18.本发明用于一种高载药量的中空聚多巴胺纳米材料的制备方法和应用。
附图说明
19.图1为实施例一步骤一制备的zif-67粉末的sem测试结果；
20.图2为实施例一步骤二制备的cohpda的sem测试结果；
21.图3为实施例二中cohpda、dox及cohpda@dox(4:1)的紫外可见光谱；
22.图4为实施例二中cohpda、dox及cohpda@dox(4:1)的傅里叶变换红外光谱；
23.图5为实施例二中cohpda@dox(2:1)在不同ph下的药物释放曲线；
24.图6为实施例二中不同比例的cohpda及dox合成的cohpda@dox的载药量及包封率；
25.图7为实施例三中cohpda、icg及cohpda@icg(1:1)的紫外可见光谱；
26.图8为实施例一中cohpda、bbr及cohpda@bbr(4:1)的紫外可见光谱；
27.图9为实施例一中cohpda、bbr及cohpda@bbr(4:1)的傅里叶变换红外光谱；
28.图10为实施例一中不同比例的cohpda及bbr合成的cohpda@bbr的载药量与包封率；
29.图11为实施例一中zif-67、cohpda、bbr、cohpda@bbr(4:1)及cohpda+bbr(1:1)的衍射谱；
30.图12为实施例一中不同浓度cohpda消耗gsh的能力；
31.图13为实施例一中cohpda在808nm激光刺激下消耗gsh的能力；
32.图14为实施例一中cohpda分解h2o2产生o2的能力；
33.图15为实施例一中cohpda的体外光声成像；
34.图16为实施例一中cohpda的体内光声成像；
35.图17为实施例一中cohpda@bbr(4:1)在不同ph下bbr的释放能力；
36.图18为实施例一不同浓度的bbr和cohpda@bbr对4t1细胞的毒性；
37.图19为实施例一cohpda@bbr联合光热治疗对4t1细胞的毒性；
38.图20为实施例一cohpda在4t1细胞内氧化应激的检测；
39.图21为实施例一中cohpda@bbr联合光热治疗对细胞内ros的检测；
40.图22为实施例一中cohpda@bbr联合光热治疗检测其靶向细胞核的能力；
41.图23为实施例一中cohpda@bbr联合光热治疗检测其靶向线粒体的能力；
42.图24为实施例一中不同治疗组14天后肿瘤组织的解剖图；
43.图25为实施例一中不同治疗组14天内肿瘤体积变化图；
44.图26为实施例一中不同治疗组14天内荷瘤小鼠体重的变化情况。
具体实施方式
45.具体实施方式一：本实施方式一种高载药量的中空聚多巴胺纳米材料的制备方法，它是按以下步骤进行：
46.一、zif-67的合成：
47.将六水硝酸钴和2-甲基咪唑溶解于甲醇中，然后搅拌生成紫色沉淀物，最后离心分离、洗涤及干燥，得到zif-67粉末；
48.二、中空聚多巴胺纳米材料的合成：
49.①
将zif-67粉末溶解于甲醇中，得到zif-67溶液；
50.②
将盐酸多巴胺溶解于甲醇中，得到盐酸多巴胺溶液；
51.③
将zif-67溶液和盐酸多巴胺溶液混合并水浴超声，然后转移至温度为50℃～60℃的水浴中，搅拌4h～6h，得到黑色混合溶液，将黑色混合溶液离心分离、洗涤及干燥，得到中空聚多巴胺纳米材料；
52.所述的zif-67溶液中zif-67的质量与盐酸多巴胺溶液中盐酸多巴胺的摩尔比为1mg:(0.002～0.006)mmol。
53.本具体实施方式步骤一制备的zif-67粉末及步骤二制备的中空聚多巴胺纳米材料在4℃保存备用。
54.本具体实施方式首先是制备zif-67金属-有机骨架，然后以zif-67为模板制备含钴中空聚多巴胺(后均称作cohpda)纳米材料。
55.本具体实施方式制备一种具有gsh消耗功能的含钴聚多巴胺纳米材料，由于制备的模板材料为zif-67，所以终产物中含有一定量的钴元素，最终得到的cohpda为菱形正十二面体的结构。
56.本具体实施方式的有益效果是：
57.本具体实施方式制备的中空聚多巴胺纳米材料具有独特的大π键结构，能够负载多种可通过π-π堆积相互作用的药物，并一定程度上改善这些药物的溶解度。此外，cohpda具有消耗谷胱甘肽(gsh)的能力，能改善肿瘤细胞内高gsh的问题，进而提升产ros的药物在肿瘤中药效。以盐酸小檗碱为例，制备了载盐酸小檗碱的纳米材料，相较于单纯的bbr，cohpda@bbr能显著提高bbr对肿瘤细胞的抑制作用，尤其是在808nm激光的联合治疗下，4t1细胞的存活率仅为3.09
±
2.5％。而等量的bbr作用下，4t1细胞存活率高达97.62
±
11.14％，对4t1细胞的作用影响甚微。体外抗肿瘤的效果评价上也具有同样的效果。
58.cohpda@bbr提高bbr生物利用度的原因在于，首先cohpda作为纳米材料具有提高药物的溶解度的特性，能改善bbr的溶解性差的问题，提高细胞对cohpda@bbr摄取效果；此外，cohpda能消耗gsh，进而上调肿瘤细胞内部氧化应激，从而提高肿瘤细胞对与bbr的敏感度，低水平的gsh也能使bbr在肿瘤细胞内部产生更多的活性氧，诱导肿瘤细胞凋亡；cohpda@bbr在近红外光的辐射可以升高局部温度，起到光热治疗的效果，且能提高药物靶向肿瘤细胞的线粒体和细胞核。基于以上几点原因，cohpda@bbr相比于bbr有更高的肿瘤细胞抑制效果。
59.具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的六水硝酸钴与2-甲基咪唑的质量比为1:(2～5)；步骤一中所述的六水硝酸钴的质量与甲醇的体积比为1mg:(0.10～0.20)ml。其它与具体实施方式一相同。
60.具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二之一不同的是：步骤一中在功率为60w～100w的条件下，将六水硝酸钴和2-甲基咪唑超声溶解于甲醇中，然后在转速为400rpm～600rpm的条件下，搅拌4h～12h，生成紫色沉淀物。其它与具体实施方式一或二相同。
61.具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中所述的离心分离、洗涤及干燥具体是按以下步骤进行：在离心速度为4000rpm～10000rpm的条件下离心分离，得到紫色沉淀，将紫色沉淀物用甲醇洗涤多次，最后在温度为50℃～70℃的条件下干燥4h～6h。其它与具体实施方式一至三相同。
62.具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二
①
中所述的zif-67溶液的浓度为0.8mg/ml～1mg/ml；步骤二
②
中所述的盐酸多巴胺溶液的浓度为20mm～25mm。其它与具体实施方式一二至四相同。
63.具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二
③
中所述的将黑色混合溶液离心分离、洗涤及干燥具体是按以下步骤进行：在离心速度为4000rpm～10000rpm的条件下离心分离，得到黑色沉淀物，将黑色沉淀物利用甲醇洗涤多次直至上清液无色，最后在温度为50℃～70℃的条件下干燥6h～12h。其它与具体实施方式一至五相同。
64.具体实施方式七：本实施方式高载药量的中空聚多巴胺纳米材料的应用，它用于盐酸小檗碱、阿霉素或吲哚菁绿的载药。
65.本具体实施方式提供一种高载药量的中空聚多巴胺纳米载体的应用，该纳米载体可有效提高抗癌药物的水溶性，该纳米载体具有高载药效率；该纳米载体还可以介导光热治疗，来实现光声成像和协同治疗的目的。
66.具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式七不同的是：它用于盐酸小檗碱、阿霉素或吲哚菁绿的载药，具体是按以下步骤进行：
67.将中空聚多巴胺纳米材料和药物溶解于pbs溶液中并搅拌，最后离心分离及洗涤，得到载药的中空聚多巴胺纳米材料；
68.所述的药物为盐酸小檗碱、阿霉素或吲哚菁绿。其它与具体实施方式七相同。
69.本具体实施方式若将盐酸小檗碱(后均称作bbr)负载于cohpda上，得到载盐酸小檗碱的中空聚多巴胺纳米材料(后均称作cohpda@bbr)；若将阿霉素(dox)负载于cohpda上，得到载阿霉素的中空聚多巴胺纳米材料，命名cohpda@dox；若将载吲哚菁绿(icg)负载于
cohpda上，得到载吲哚菁绿的中空聚多巴胺纳米材料，命名cohpda@icg。
70.具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式七或八之一不同的是：所述的pbs溶液的浓度为0.01mol/l，ph为2～3或ph为7.4；所述的中空聚多巴胺纳米材料的质量与pbs溶液的体积比为1mg:(1～5)ml。其它与具体实施方式七或八相同。
71.具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式七至九之一不同的是：在温度为25℃～80℃、功率为60w～100w及避光的条件下，将中空聚多巴胺纳米材料和药物加入到pbs溶液中，超声分散0.1h～0.2h，然后在温度为25℃～80℃、转速为400rpm～800rpm及避光条件下，搅拌12h～24h，再在离心速度为8000rpm～11000rpm的条件下离心分离，最后利用pbs溶液洗涤多次以除去未结合牢固的药物。其它与具体实施方式七至九相同。
72.采用以下实施例验证本发明的有益效果：
73.实施例一：
74.一种高载药量的中空聚多巴胺纳米材料的制备方法，它是按以下步骤进行：
75.一、zif-67的合成：
76.在功率为60w的条件下，将996mg六水硝酸钴和2792mg 2-甲基咪唑溶解于200ml甲醇中，然后在转速为400rpm的条件下，搅拌12h，生成紫色沉淀物，最后在离心速度为8000rpm的条件下离心分离，得到紫色沉淀，将紫色沉淀物用甲醇洗涤3次，最后在温度为55℃的条件下干燥5h，得到zif-67粉末；
77.二、中空聚多巴胺纳米材料的合成：
78.①
将60mg zif-67粉末溶解于75ml甲醇中，得到zif-67溶液；
79.②
将56.89mg盐酸多巴胺溶解于15ml甲醇中，得到盐酸多巴胺溶液；
80.③
将zif-67溶液和盐酸多巴胺溶液混合，并在功率为80w的条件下，水浴超声10min，然后转移至温度为55℃的水浴中，搅拌4h，得到黑色混合溶液，在离心速度为8000rpm的条件下，将黑色混合溶液离心分离，得到黑色沉淀物，将黑色沉淀物甲醇洗涤多次直至上清液无色，最后在温度为60℃的条件下干燥10h，得到中空聚多巴胺纳米材料，命名cohpda；
81.三、cohpda@bbr的合成：
82.在温度为80℃、功率为80w及避光的条件下，将中空聚多巴胺纳米材料和盐酸小檗碱加入到pbs溶液中，超声分散0.1h，然后在温度为60℃、转速为600rpm及避光条件下，搅拌24h，再在离心速度为9000rpm的条件下离心分离，最后利用pbs溶液洗涤多次以除去未结合牢固的盐酸小檗碱，得到载盐酸小檗碱的中空聚多巴胺纳米材料，命名cohpda@bbr；所述的中空聚多巴胺纳米材料的质量与pbs溶液的体积比为1mg:1ml；
83.步骤三中所述的pbs溶液的浓度为0.01m，ph为7.4。
84.设制备过程加入中空聚多巴胺纳米材料的质量与盐酸小檗碱的质量比为a:b，则命名cohpda@bbr(a:b)。
85.实施例二：本对比实验与实施例一不同的是：步骤三在温度为37℃、功率为80w及避光的条件下，将中空聚多巴胺纳米材料和阿霉素(dox)加入到pbs溶液中，超声分散0.1h，然后在温度为37℃、转速为600rpm及避光条件下，搅拌24h，再在离心速度为8000rpm的条件下离心分离，最后利用pbs溶液洗涤多次以除去未结合牢固的阿霉素，得到载阿霉素的中空聚多巴胺纳米材料，命名cohpda@dox；所述的中空聚多巴胺纳米材料的质量与pbs溶液的体
积比为1mg:1ml。其它与实施例一相同。
86.设制备过程加入中空聚多巴胺纳米材料的质量与阿霉素的质量比为a:b，则命名cohpda@dox(a:b)。
87.实施例三：本对比实验与实施例一不同的是：步骤三在温度为25℃、功率为80w及避光的条件下，将2mg中空聚多巴胺纳米材料和2mg吲哚菁绿(icg)加入到4ml pbs溶液中，超声分散0.1h，然后在温度为25℃、转速为600rpm及避光条件下，搅拌24h，再在离心速度为10000rpm的条件下离心分离，最后利用pbs溶液洗涤多次以除去未结合牢固的吲哚菁绿，得到载吲哚菁绿的中空聚多巴胺纳米材料，命名cohpda@icg；所述的pbs溶液的浓度为0.01mol/l，ph为3。其它与实施例一相同。
88.设制备过程加入中空聚多巴胺纳米材料的质量与阿霉素的质量比为1:1，则命名cohpda@dox(1:1)。
89.(1)sem表征、紫外可见光谱表征，傅里叶变换红外光谱表征，x射线衍射表征：
90.图1为实施例一步骤一制备的zif-67粉末的sem测试结果；图2为实施例一步骤二制备的cohpda的sem测试结果；由图可知，zif-67呈十二面体结构；cohpda仍呈十二面体结构，在其表面出现了孔洞，证明其为中空结构。
91.图3为实施例二中cohpda、dox及cohpda@dox(4:1)的紫外可见光谱；cohpda@dox的紫外光谱在480nm～510nm附近出现了与dox一致的强吸收峰，表明dox加载成功。
92.图4为实施例二中cohpda、dox及cohpda@dox(4:1)的傅里叶变换红外光谱；如图所示，dox在ftir光谱中的特征吸收峰分别为1211cm-1
、1117cm-1
、995cm-1
，分别为四氢吡喃环的c-h振动、醚键上甲基的c-h振动、酮基的c-c弯曲振动，816cm-1
为苯环的平面外振动。1581cm-1
和1408cm-1
分别为dox芳香环上的c-h振动。这些吸收峰在cohpda@dox的ftir光谱中都可以一一对应，说明dox的加载成功。
93.图5为实施例二中cohpda@dox(2:1)在不同ph下的药物释放曲线；如图所示，在ph为7.4时，24小时后dox的释放量只有14.88
±
0.22％，说明其在生理条件下的稳定性。相比之下，药物在ph为5.0时的释放速度更快，是ph7.4释放的4倍，达到59.66
±
1.51％。上述数据证明了dox从cohpda@dox中的释放是依赖于ph值的。这种现象的机制可能是由于dox的氨基质子化导致分子极性增加，使dox更加亲水，大大影响了dox在纳米复合材料的疏水层上的附着；另一方面，在酸性条件下，cohpda的缓慢分解导致中空结构破坏，可以暴露出内部的dox，进一步提高释放速率。
94.图6为实施例二中不同比例的cohpda及dox合成的cohpda@dox的载药量及包封率；如图所示，随着dox与cohpda的比例不断增加，cohpda@dox的载药量和包封率也不断升高，当dox:cohpda为3.5:1时载药量和包封率高达76.25
±
0.24％和91.74
±
1.24％。
95.图7为实施例三中cohpda、icg及cohpda@icg(1:1)的紫外可见光谱；与cohpda纳米颗粒相比，cohpda@icg纳米颗粒在800nm出现一处强吸收峰，表明icg分子成功被装载到cohpda纳米颗粒上。以上实验现象可解释为：当icg分子吸附到纳米颗粒表面后，相互接触的icg分子通过离域电子的传导致使材料吸收峰发生红移，也证明icg的成功负载。
96.图8为实施例一中cohpda、bbr及cohpda@bbr(4:1)的紫外可见光谱；cohpda@bbr含有bbr在230nm、260nm及340nm的特征吸收峰，证明bbr的负载成功。
97.图9为实施例一中cohpda、bbr及cohpda@bbr(4:1)的傅里叶变换红外光谱；bbr在
1389cm-1
和1505cm-1
处具有苯环的特征峰，在1231cm-1
处具有c-o-c的特征峰，在3338cm-1
附近的宽频带被归因于cohpda中的n-h和o-h拉伸振动，cohpda@bbr可见明显的bbr、cohpda特征峰叠加，进一步从官能团角度说明cohpda@bbr负载bbr成功；
98.图10为实施例一中不同比例的cohpda及bbr合成的cohpda@bbr的载药量与包封率；当bbr与cohpda比例为2.5:1时，cohpda@bbr的载药量为68.07
±
0.04％，包封率为85.29
±
0.15％。即通过图10考察了cohpda载体对于药物的负载能力，但针对部分实验，选用了含高量的cohpda，即在制备过程加入中空聚多巴胺纳米材料的质量大于阿霉素的质量，利用纳米载体去递送药物是为了降低药物的毒副作用，药物是有毒的，载体是无毒的，载体能被动富集在肿瘤部位，而单纯的药物不能，相比于单纯的bbr，cohpda@bbr能更多的富集于肿瘤部位，治疗肯定要使用更多毒性低的药物去治疗。此外，整个实验主要分为两种治疗方式的联合治疗，即化疗和光热治疗，既通过降低化疗药物的量，继而降低了药物的毒副作用，为了提高治疗效果进而增加光热治疗。cohpda是有光热治疗的作用的，但是它的升温效果依赖于cohpda的量，即浓度依赖性，所以cohpda在cohpda@bbr的整个体系中含量高，可实现降低有毒副作用的药物，同时提高无毒副作用的载体光热治疗的作用。
99.图11为实施例一中zif-67、cohpda、bbr、cohpda@bbr(4:1)及cohpda+bbr(1:1)的衍射谱；cohpda曲线中可以发现，zif-67由晶态转换为cohpda无衍射峰的非晶态，物相的转换证明合成的成功；bbr的衍射峰显示出其为晶体状态，在7.098
°
、9.023
°
及9.534
°
显示出高强度的衍射峰；通过bbr结晶度一定的下降，可以证实在物理混合物中bbr和cohpda的存在；而cohpda@bbr又变为非晶的物相，可能是由于cohpda在负载bbr的过程中限制了bbr的晶体生长，因此保持为cohpda的非晶状态。
100.通过上述对cohpda@bbr的结构表征，证明了cohpda的成功合成及bbr的负载成功。
101.(2)实施例一制备的cohpda对谷胱甘肽(gsh)消耗能力的测试：
102.①
不同浓度的cohpda对gsh消耗能力的测试：将1ml浓度为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml和150μg/ml的cohpda的pbs溶液分别与1.0ml gsh的pbs(gsh的浓度为200μm)混合。在37℃下孵育15分钟后，将离心收集的上清液稀释并与二硫代二硝基苯甲酸(dntb)溶液孵育10分钟。最后，用紫外可见分光光度计测412nm处的紫外吸收，以计算gsh的相对消耗量。
103.②
808nm激光照射下cohpda对gsh消耗能力的测试：将1.0ml浓度为50μg/ml的cohpda的pbs溶液与1.0ml gsh的pbs(gsh的浓度为400μm)混合；在37℃下孵育15分钟后为实验组一，用808nm的近红外光(1.8w/cm2)照射15分钟为实验组二；将离心收集实验组一及二的上清液稀释并与dntb溶液孵育10分钟。最后，用紫外可见分光光度计测412nm处的紫外吸收，以计算gsh的相对消耗量。
104.图12为实施例一中不同浓度cohpda消耗gsh的能力；如图所示，随着cohpda浓度的提高，150μg/ml的cohpda常温下使gsh仅剩14.21
±
1.48％；
105.图13为实施例一中cohpda在808nm激光刺激下消耗gsh的能力；50μg/ml的cohpda在室温下使gsh消耗10.27
±
0.86％，而辅以808nm激光照射下，50μg/ml的cohpda在室温下使gsh消耗40.58
±
5.12％。这验证了cohpda消耗gsh及cohpda在808nm光热刺激下消耗gsh的能力。
106.(3)对实施例一制备的cohpda体外有无过氧化氢的条件下进行产氧能力的测试：
将60μl的h2o2溶液(1m)加入到cohpda的pbs溶液中(200μg/ml，20ml)为实验组，以不加入h2o2的cohpda的pbs溶液中(200μg/ml，20ml)为对照组，用便携式溶氧仪每1分钟测量并记录溶氧的浓度。
107.图14为实施例一中cohpda分解h2o2产生o2的能力；在cohpda溶液中加入h2o2后，用便携式溶解氧仪发现溶液中的整体氧含量在增加，而不加入h2o2时，氧含量没有变化。推断氧气产生的主要机制是，co
3+
的氧化还原电位为1.83v，大于过氧化氢的1.77v，而h2o2的还原电位只有0.4v，导致h2o2被co
3+
氧化，进而产生氧气。基于肿瘤微环境也富含h2o2的事实，cohpda有望改善肿瘤部位的缺氧环境。
108.(4)对实施例一制备的cohpda进行体内外光声成像实验：
109.①
体外成像：不同浓度(0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml)的cohpda的pbs溶液用vevo lazr-x小动物活体成像系统扫描cohpda 680-1000nm范围内的光声信号模式，得到相应的信号值。
110.②
体内成像：4t1荷瘤balb/c雌性小鼠，肿瘤体积约为100mm3，用于体内pa成像。a肿瘤注射方法：先用1％异氟醚麻醉小鼠，然后直接向肿瘤内注射100μlcohpda的pbs溶液(2mg/ml)，注射前及注射后30min对肿瘤部位进行成像；b尾静脉注射：尾静脉注射200μl cohpda的pbs溶液(2mg/ml)，固定时间点(0h、0.5h、2h、6h、24h)扫描肿瘤部位。
111.图15为实施例一中cohpda的体外光声成像；cohpda在近红外区域具有优异的吸收，使其具有光声成像的能力。为了验证cohpda的光声成像能力，首先初步研究了cohpda在680～1000nm梯度浓度下的光声信号谱。cohpda在700nm处吸收最强。此外，cohpda的光声信号具有浓度依赖性。由于氧合血红蛋白(hbo2)在700nm吸收较低，因此选择该波长进行进一步的体内成像。
112.图16为实施例一中cohpda的体内光声成像；如图所示，肿瘤注射方法：注射后0.5h肿瘤部位的光声信号显著增强，这揭示了cohpda作为体内光声成像造影剂的可行性。尾静脉注射：注射0.5h后cohpda在肿瘤部位产生清晰的光声信号，2h后信号继续增强，注射24h后肿瘤部位仍有cohpda的光声信号。以上结果证明cohpda是一种优秀的光声显像剂，成像效果明显，cohpda纳米颗粒可通过增强穿透保留效应(epr)到达肿瘤部位，为诊断和给药提供了理论依据。
113.(5)对实施例一中制备的cohpda@bbr(4:1)体外模拟正常生理ph与肿瘤ph进行药物释放实验：为验证cohpda@bbr(4:1)在不同ph下药物释放的差异性，将5mg cohpda@bbr(4:1)分散于3ml不同ph值的pbs(ph＝7.4和ph＝5.0)中，将cohpda@bbr(4:1)置于透析袋中进行透析模拟药物释放。在特定的时间点，取出1ml释放介质，同时补充等体积新鲜释放介质。使用紫外-可见分光光度计分析药物释放量。
114.图17为实施例一中cohpda@bbr(4:1)在不同ph下bbr的释放能力；如图所示，cohpda@bbr释放初期两个ph条件下释放差异并不明显。从2h开始两种ph下的释放开始变得明显，在8h的时候ph7.4的释放基本不释放，最终在20h时ph7.4的cohpda@bbr积累释放量为73.28
±
4.97％。由于在酸性条件下cohpda会有部分降解，cohpda的中空结构遭到破坏，内部的药物会暴露进而释放出来，最终在20h时ph5.0的cohpda@bbr积累释放量为93.83
±
2.93％
115.(6)对实施例一制备的cohpda@bbr体外细胞mtt实验：
116.①
比较bbr及cohpda@bbr对4t1细胞的化疗作用的影响：4t1细胞以每孔8000个细胞的密度在96孔板中使细胞贴壁，然后用含有0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml及80μg/ml bbr的新鲜dmem培养基或含等量bbr的cohpda@bbr的新鲜dmem培养基(即dmem培养基中bbr的浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml及80μg/ml)替换孔板中的dmem。24小时后，用无血清dmem冲洗细胞两次，每孔补充100μl dmem和20μl mtt染料。4h后，用150μl dmso更换培养基，再孵育1min。最后，根据酶标仪检测到的每孔在490nm处的吸收值计算细胞相对存活率。
117.②
测定联合治疗下cohpda@bbr对4t1细胞的化疗作用的影响：4t1细胞以每孔8000个细胞的密度在96孔板中使细胞贴壁，以dmem完全培养基为对照，然后以含bbr的dmem溶液(bbr的浓度为20μg/ml)、含cohpda@bbr的dmem溶液(bbr的浓度为20μg/ml，cohpda的浓度为112μg/ml)及含cohpda的dmem溶液(cohpda的浓度为112μg/ml)为实验组一，以实验组一加808nm激光为实验组二，其中实验组一孵育24h；实验组二孵育4h后，用808nm激光功率密度1.3w/cm2和1.8w/cm2照射7min，激光照射完后，再孵育20h；然后对实验组一、二及对照组洗去细胞未摄取的药物及纳米粒子，并加入20μl的mtt溶液继续孵育4h，4h后吸出所有液体再加入dmso，震摇10min后在酶标仪上检测每孔490nm的吸光度，计算相对细胞活力。
118.图18为实施例一不同浓度的bbr和cohpda@bbr对4t1细胞的毒性；通过比较了不同浓度的bbr与cohpda@bbr孵育24h对4t1细胞的活力抑制效果。如图所示，即使bbr的浓度为80μg/ml时，bbr对4t1细胞的活力基本没有影响，而与含有等量的bbr的cohpda@bbr对比发现，当含有cohpda@bbr的新鲜dmem培养基中bbr的浓度为80μg/ml时，孵育24h后细胞活力仅为24.27
±
8.50％，这与游离的bbr有明显的差异。
119.图19为实施例一cohpda@bbr联合光热治疗对4t1细胞的毒性；随着808nm近红外光的功率密度从1.3w/cm2提高至1.8w/cm2，含有cohpda@bbr的dmem溶液中bbr浓度为20μg/ml时，细胞活力为3.09
±
2.5％，而等量的bbr作用下，4t1细胞存活率高达97.62
±
11.14％，对4t1细胞的作用影响甚微。这些结果验证了，cohpda@bbr提高了单体bbr的抗癌效果，而且在辅助光热治疗后进一步降低了药量并大幅度提高了bbr的化疗效果。
120.(7)dcfh-da检测实施例一中cohpda上调肿瘤细胞氧化应激：4t1细胞以每孔5万个细胞的密度接种6孔板中，孵育过夜。用浓度为100μg/ml的cohpda的dmem分散液孵育6h后为实验组一；用浓度为100μg/ml的cohpda的dmem分散液孵育6h后，用近红外光(1.8w/cm2)照射细胞10min为实验组二；然后用pbs清洗实验组一及二细胞，加入dcfh-da荧光探针，再孵育30min，最后用pbs冲洗几遍，在高内涵细胞分析仪上观察不同处理组细胞内活性氧的水平高低。
121.图20为实施例一cohpda在4t1细胞内氧化应激的检测；如图所示，cohpda孵育后细胞内活性氧水平升高，尤其是808nm激光照射后。这是因为肿瘤细胞中含有大量的gsh和少量的ros，cohpda消耗肿瘤细胞内的gsh，导致肿瘤细胞氧化还原稳态失衡，导致肿瘤细胞氧化应激。
122.(8)dcfh-da检测cohpda@bbr在肿瘤细胞内活性氧：取对数生长期的4t1细胞，以50000个/孔细胞的密度铺于6孔板。待细胞固定于孔板中后，以bbr的无血清dmem溶液(bbr的浓度为10μg/ml)、cohpda@bbr的无血清dmem溶液(bbr的浓度为10μg/ml，cohpda的浓度为90μg/ml)替换原有培养液孵育5h为实验组一；以bbr的无血清dmem溶液(bbr的浓度为10μg/
ml)、cohpda@bbr的无血清dmem溶液(bbr的浓度为10μg/ml，cohpda的浓度为90μg/ml)替换原有培养液孵育5h，然后加808nm的近红外光(1.8w/cm2)照射20min为实验组二；以完全培养基dmem孵育5h为对照组。用pbs洗去实验组一、二及对照组没有摄取进入细胞的材料，用含dcfh-da的dmem孵育30min，再用不含fbs的dmem冲去未进入细胞的dcfh-da，上机拍摄细胞内活性氧的情况。
123.图21为实施例一中cohpda@bbr联合光热治疗对细胞内ros的检测；如图所示，首先，cohpda通过纳米材料能够提高药物溶解度的特性，与游离的bbr相比，cohpda提高了bbr在生理或病理条件下的脂溶性，进一步使bbr易于被细胞摄取。此外，之前的报道表明bbr能通过提升癌细胞内ros的水平从而诱导细胞凋亡，但癌细胞的微环境含有过量的gsh限制了bbr的药效。前述试验也证明cohpda具有消耗gsh的能力，同时光热效应能促进gsh，最终使细胞内ros突破可承受的阈值，cohpda和bbr双重放大细胞内氧化应激，最终提高了盐酸小檗碱的治疗效果。
124.(9)hoechst 33342检测cohpda@bbr靶向肿瘤细胞细胞核的能力：将4t1细胞接种于24孔板中孵育过夜；将培养液更换为含bbr的培养基(bbr的浓度为25μg/ml)孵育4h为对照组；将培养液更换为含cohpda@bbr的培养基(bbr的浓度为25μg/ml，cohpda的浓度为178μg/ml)孵育4h为实验组一；将培养液更换为含cohpda@bbr的培养基(bbr的浓度为25μg/ml，cohpda的浓度为178μg/ml)孵育4h，然后用功率密度为1.8w/cm2的808nm激光照射细胞20分钟为实验组二。用pbs洗涤实验组一、二及对照组3次以去除多余的药物或纳米颗粒，hoechst 33342染色细胞核。用高内涵细胞分析仪观察bbr荧光通道与hoechst 33342的重叠能力。
125.图22为实施例一中cohpda@bbr联合光热治疗检测其靶向细胞核的能力；图中l代表激光照射；以游离的bbr为对照，cohpda@bbr孵育4h，由于药物释放的限制，cohpda@bbr靶向的量较bbr低。而用808nm激光照射cohpda@bbr孵育的细胞10min后发现，细胞核积累的量与bbr的量相当，这是由于温度的上升促进了细胞摄取cohpda@bbr的量，说明cohpda的光热效应能增强cohpda@bbr靶向4t1细胞细胞核的量。
126.(10)mito-tracker red检测cohpda@bbr靶向肿瘤细胞线粒体的能力：将4t1细胞接种于24孔板中孵育过夜；将培养液更换为含bbr的培养基(bbr的浓度为25μg/ml)孵育4h为对照组；将培养液更换为含cohpda@bbr的培养基(bbr的浓度为25μg/ml，cohpda的的浓度为178μg/ml)孵育4h为实验组一；将培养液更换为含bbr的培养基(bbr的浓度为25μg/ml)或含cohpda@bbr的培养基(bbr的浓度为25μg/ml，cohpda的的浓度为178μg/ml)孵育4h后，用功率密度为1.8w/cm2的808nm激光照射细胞20分钟为实验组二。然后用pbs洗涤实验组一、二及对照组3次以去除多余的药物或纳米颗粒，mito-tracker red染色细胞核。用高内涵细胞分析仪观察bbr荧光通道与mito-tracker red的重叠能力。
127.图23为实施例一中cohpda@bbr联合光热治疗检测其靶向线粒体的能力；图中l代表激光照射；以游离的bbr为对照，cohpda@bbr孵育4h，由于药物释放的限制，cohpda@bbr靶向的量较bbr低。而用808nm激光照射cohpda@bbr孵育的细胞10min后发现，线粒体积累的量与bbr的量相当，这是由于温度的上升促进了细胞摄取cohpda@bbr的量，说明cohpda的光热效应不仅能增强cohpda@bbr靶向4t1细胞线粒体的量，也增加了cohpda@bbr靶向4t1细胞细胞核的量。
128.(11)cohpda@bbr体内抗肿瘤效果评估：
129.将荷瘤小鼠随机分为8组每组6只进行抗肿瘤作用评价。各组处理如下：ⅰ组为pbs溶液；ⅱ组为含bbr的pbs溶液(bbr的浓度为20μg/ml)；ⅲ组为含cohpda的pbs溶液(cohpda的浓度为112μg/ml)；ⅳ组为含cohpda的pbs溶液(cohpda的浓度为112μg/ml)(l+)(l+代表经808nm激光照射处理)；
ⅴ
组为含cohpda@bbr的pbs溶液(bbr的浓度20μg/ml，cohpda的浓度为112μg/ml)；ⅵ组为含cohpda@bbr的pbs溶液(bbr的浓度15μg/ml，cohpda的浓度为84μg/ml)(l+)；ⅶ组为含cohpda@bbr的pbs溶液(bbr的浓度20μg/ml，cohpda的浓度为112μg/ml)(l+)；
ⅷ
组为含cohpda@bbr的pbs溶液(bbr的浓度25μg/ml，cohpda的浓度为140μg/ml)(l+)。处理方法如下：将上述不同样品150μl注射瘤内，激光照射组瘤内注射后在肿瘤部位照射808nm激光(0.8w/cm2，10min)。每2天测量肿瘤体积和体重。
130.图24为实施例一中不同治疗组14天后肿瘤组织的解剖图；图25为实施例一中不同治疗组14天内肿瘤体积变化图；图26为实施例一中不同治疗组14天内荷瘤小鼠体重的变化情况。由图24及25所示，经瘤内注射后利用0.8w/cm2的808nm的激光照射荷瘤小鼠的肿瘤部位，一方面cohpda基于纳米材料能提高药物的溶解度的特性，导致bbr的脂溶性相应的提高。此外，不仅仅是因为cohpda在808nm的光热治疗作用导致肿瘤消融，cohpda的光热升温使肿瘤细胞内部的gsh快速消耗，导致肿瘤内部氧化应激的提升，使bbr产生的ros能不经gsh的解毒作用直接作用于肿瘤细胞。并且cohpda@bbr在cohpda的光热治疗作用下能增强肿瘤细胞对cohpda@bbr的摄取，并在光热治疗的诱导下提升bbr靶向肿瘤细胞核和线粒体的强度。当cohpda@bbr中bbr的浓度逐渐升高时，4t1荷瘤小鼠的肿瘤体积也逐渐下降，当cohpda@bbr中bbr的浓度为25μg/ml肿瘤体积最小，甚至其余几组已经完全消融，达到了很好的治疗效果。如图26所示，14天的小鼠体重变化也证明，cohpda@bbr等多种治疗方式并没有引起体重的明显变化，证明其具有一定的生物相容性，也证明了cohpda联合bbr进行肿瘤治疗的优越性及可行性，这一平台的构建为其他天然药物的构建提供了借鉴意义。
131.实验(2)至(11)中pbs溶液的浓度均为0.01mol/l，未进行ph标记的pbs溶液，其ph为7.4。

技术特征：
1.一种高载药量的中空聚多巴胺纳米材料的制备方法，其特征在于它是按以下步骤进行：一、zif-67的合成：将六水硝酸钴和2-甲基咪唑溶解于甲醇中，然后搅拌生成紫色沉淀物，最后离心分离、洗涤及干燥，得到zif-67粉末；二、中空聚多巴胺纳米材料的合成：
①
将zif-67粉末溶解于甲醇中，得到zif-67溶液；
②
将盐酸多巴胺溶解于甲醇中，得到盐酸多巴胺溶液；
③
将zif-67溶液和盐酸多巴胺溶液混合并水浴超声，然后转移至温度为50℃～60℃的水浴中，搅拌4h～6h，得到黑色混合溶液，将黑色混合溶液离心分离、洗涤及干燥，得到中空聚多巴胺纳米材料；所述的zif-67溶液中zif-67的质量与盐酸多巴胺溶液中盐酸多巴胺的摩尔比为1mg:(0.002～0.006)mmol。2.根据权利要求1所述的一种高载药量的中空聚多巴胺纳米材料的制备方法，其特征在于步骤一中所述的六水硝酸钴与2-甲基咪唑的质量比为1:(2～5)；步骤一中所述的六水硝酸钴的质量与甲醇的体积比为1mg:(0.10～0.20)ml。3.根据权利要求1所述的一种高载药量的中空聚多巴胺纳米材料的制备方法，其特征在于步骤一中在功率为60w～100w的条件下，将六水硝酸钴和2-甲基咪唑超声溶解于甲醇中，然后在转速为400rpm～600rpm的条件下，搅拌4h～12h，生成紫色沉淀物。4.根据权利要求1所述的一种高载药量的中空聚多巴胺纳米材料的制备方法，其特征在于步骤一中所述的离心分离、洗涤及干燥具体是按以下步骤进行：在离心速度为4000rpm～10000rpm的条件下离心分离，得到紫色沉淀，将紫色沉淀物用甲醇洗涤多次，最后在温度为50℃～70℃的条件下干燥4h～6h。5.根据权利要求1所述的一种高载药量的中空聚多巴胺纳米材料的制备方法，其特征在于步骤二
①
中所述的zif-67溶液的浓度为0.8mg/ml～1mg/ml；步骤二
②
中所述的盐酸多巴胺溶液的浓度为20mm～25mm。6.根据权利要求1所述的一种高载药量的中空聚多巴胺纳米材料的制备方法，其特征在于步骤二
③
中所述的将黑色混合溶液离心分离、洗涤及干燥具体是按以下步骤进行：在离心速度为4000rpm～10000rpm的条件下离心分离，得到黑色沉淀物，将黑色沉淀物利用甲醇洗涤多次直至上清液无色，最后在温度为50℃～70℃的条件下干燥6h～12h。7.如权利要求1制备的高载药量的中空聚多巴胺纳米材料的应用，其特征在于它用于盐酸小檗碱、阿霉素或吲哚菁绿的载药。8.根据权利要求7所述的高载药量的中空聚多巴胺纳米材料的应用，其特征在于它用于盐酸小檗碱、阿霉素或吲哚菁绿的载药，具体是按以下步骤进行：将中空聚多巴胺纳米材料和药物溶解于pbs溶液中并搅拌，最后离心分离及洗涤，得到载药的中空聚多巴胺纳米材料；所述的药物为盐酸小檗碱、阿霉素或吲哚菁绿。9.根据权利要求8所述的高载药量的中空聚多巴胺纳米材料的应用，其特征在于所述的pbs溶液的浓度为0.01mol/l，ph为2～3或ph为7.4；所述的中空聚多巴胺纳米材料的质量
与pbs溶液的体积比为1mg:(1～5)ml。10.根据权利要求8所述的高载药量的中空聚多巴胺纳米材料的应用，其特征在于在温度为25℃～80℃、功率为60w～100w及避光的条件下，将中空聚多巴胺纳米材料和药物加入到pbs溶液中，超声分散0.1h～0.2h，然后在温度为25℃～80℃、转速为400rpm～800rpm及避光条件下，搅拌12h～24h，再在离心速度为8000rpm～11000rpm的条件下离心分离，最后利用pbs溶液洗涤多次以除去未结合牢固的药物。

技术总结
一种高载药量的中空聚多巴胺纳米材料的制备方法和应用，本发明属于纳米载体药物领域。解决现有纳米载体载药效率低下，生物相容性差，且辅助治疗的功能低的问题。方法：一、ZIF-67的合成；二、中空聚多巴胺纳米材料的合成。应用：它用于盐酸小檗碱、阿霉素或吲哚菁绿的载药。本发明用于高载药量的中空聚多巴胺纳米材料的制备和应用。米材料的制备和应用。米材料的制备和应用。


技术研发人员：李妍妍 吴世龙 张琴 赵婷婷 姜宇 赵祺耀 渠筱萌 周一凡
受保护的技术使用者：东北林业大学
技术研发日：2023.08.01
技术公布日：2023/10/15