血流感染病原体联检并区分的组合物、试剂盒及用途的制作方法

1.本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及血流感染相关病原体的检测，更具体地，涉及咽峡炎链球菌、缓症链球菌和屎肠球菌的检测。


背景技术：

2.咽峡炎链球菌(streptococcus anginosus)是定植在口腔、咽喉、消化道等正常菌群之一，是米勒链球菌群其中之一。咽峡炎链球菌是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的兼性厌氧球菌，在琼脂培养基上形成小菌落，属于草绿色链球菌群。咽峡炎链球菌所致疾病最常见为呼吸道感染、化脓性感染以及血流感染，分别占比34.8％、33.5％、8.5％。既往研究证实，咽峡炎链球菌可产生多种体外毒素，多引起侵袭性化脓性感染，一旦入侵血液后可随血液循环遍及全身，引起全身严重感染性疾病。咽峡炎链球菌群血流感染患者大多与侵袭性操作有关，咽峡炎链球菌血流感染临床特征，多数患者合并一些基础疾病，如消化系统、心血管系统、呼吸系统疾病及肿瘤。多项研究表明，咽峡炎链球菌群血流感染中最常见的基础疾病为肿瘤，推测肿瘤引起的占位性病变破坏人体正常结构引起局部感染，进而引起咽峡炎链球菌群感染。咽峡炎链球菌感染特征不明显，鉴定难度大，临床工作中，若疑为相关细菌感染时应及时送检标本，及时根据药敏结果合理应用抗生素，进行耐药性监测，以提高预后。关于咽峡炎链球菌的鉴定，大多数国家采用自动鉴定仪和api 20strep试剂盒等。国内只有少数大医院采用上述方法，就是用这种方法也不能100％的做出正确鉴定，但仍然是临床实验室的主要鉴定方法。
3.缓症链球菌群包括缓症链球菌(streptococcus mitis，s.mitis)、口腔链球菌、婴儿链球菌、泛口腔链球菌、嵴链球菌等。缓症链球菌属于草绿色链球菌的一种，是人体正常菌群之一，主要分布于口咽部，也可见于皮肤、胃肠道以及女性生殖道。缓症链球菌为革兰氏阳性球菌，呈球形或椭圆形，在血清肉汤中形成短或长链，无芽孢、无动力，兼性厌氧，触酶阴性。缓症链球菌属于条件致病菌，可以引起一系列侵袭性疾病，尤其是在恶性肿瘤、化疗、中性粒细胞缺乏等免疫缺陷的患者中。缓症链球菌可致血流感染、感染性心内膜炎、脑膜炎、肺炎、牙源性感染、鼻窦炎等，也可引起脓肿性病变。缓症链球菌具有与粪肠球菌和屎肠球菌相同的编码庆大霉素耐药的基因结构，这种基因决定簇整合到染色体上，而不是质粒上。缓症链球菌的感染并非少见，其感染诱因和临床类型有多种，但常因培养误定为草绿色链球菌而漏诊。然而缓症链球菌比草绿色链球菌的耐药性发展更快，因此微生物室与临床医生应对该菌感染加强警觉性，提高诊断水平。
4.屎肠球菌(enterococcus faecium)属肠球菌属，是人及动物肠道中正常菌群的一部分。屎肠球菌通常情况下存在于人和动物肠道内，并不会引起宿主疾病的发生。但当宿主免疫力下降或者缺乏营养的情况下，就会导致机体病变，通常引起机体创伤感染和腹膜感染，引发菌血症等。在免疫力低下、过量使用抗生素和多种病原体的混合感染中可导致败血症、心内膜炎、脑炎等，死亡率可达21.0％～27.5％。屎肠球菌作为一种条件致病菌，近年来在美国、欧洲和南美的感染率不断上升。中国细菌耐药监测网显示逐年增多的肠球菌属检
出均以屎肠球菌为主。利用屎肠球菌染色形态和生化性质的初步鉴定病原体方式不仅耗时长且易于和其他菌属混淆，因此采用核酸诊断的方法如dna分子杂交或聚合酶链式反应(pcr)技术可以快速地对屎肠球菌做出诊断，对临床感染早期诊断具有重要指导意义。
5.上述咽峡炎链球菌、缓症链球菌、屎肠球菌均可引起败血症，危及生命安全，因此早期诊断病原体并给予及时有效的抗感染治疗是改善预后的关键，能够大大降低发病率和病死率。然而，通过临床症状和常规的实验室检测很难鉴别确定所感染的细菌种类，而且目前细菌培养条件较苛刻，造成培养阳性率低，且多重混合感染的培养极为困难，这给感染患者及临床医生带来很大困扰。
6.因此，本领域需求一种产品能够简单、快速地检测上述病原体以便针对性的提高治疗策略，并且灵敏度高，特异性好。


技术实现要素：

7.有鉴于此，第一方面，本发明提供一种血流感染病原体联检并区分的组合物，包括：
8.如seq id no:1～3所示的检测咽峡炎链球菌的上游引物、下游引物及探针；
9.如seq id no:4～6所示的检测缓症链球菌的上游引物、下游引物及探针；以及，如seq id no:7～9所示的检测屎肠球菌的上游引物、下游引物及探针。
10.本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光pcr分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实咽峡炎链球菌、缓症链球菌、屎肠球菌的检测和区分以便针对性的提高治疗策略。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/ml，特异性好，检测更为准确。
11.进一步地，所述组合物包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。
12.在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是rnase p。
13.进一步地，本发明组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
14.在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用atto 425、quasar705、fam、hex、rox和cy5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
15.在一些具体的实施方案中，咽峡炎链球菌探针的荧光报告基团为fam；缓症链球菌探针的荧光报告基团为hex；屎肠球菌探针的荧光报告基团为rox。
16.进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。
17.本发明的组合物可以任意组合成检测对应3个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。
18.举例来说，可以包括上述3对引物和探针中的任意3对，可以包括上述3对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述3对引物和探针中的任意1对。
19.在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光pcr。
20.进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。
21.进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如bhq1或bhq2。
22.在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为bhq1。
23.在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。
24.在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。
25.进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。
26.第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备血流感染病原体联检并区分的试剂盒中的用途，其中，所述病原体为咽峡炎链球菌、缓症链球菌、屎肠球菌。
27.第三方面，本发明提供了一种血流感染病原体联检并区分的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。
28.进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
29.在一个具体的实施方案中，阴性质控品是depc h2o、生理盐水、内标基因中的至少一种。阳性质控品是咽峡炎链球菌、缓症链球菌、屎肠球菌的片段质粒或片段dna中的至少一种。
30.进一步地，所述试剂盒还包括dntp、pcr缓冲液以及mg
2+
中的至少一种。
31.更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸提取试剂，以及dna聚合酶中的至少一种。
32.更进一步地，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、dntp、dutp、尿嘧啶糖基化酶(udg)、dna聚合酶、pcr缓冲液以及mg
2+
中的至少一种。
33.进一步地，所述dna聚合酶的浓度为3u/反应～15u/反应，例如dna聚合酶可以是taq酶。
34.在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括taq酶、mg
2+
、dntp(u)s、引物、探针和pcr缓冲液。
35.常见的pcr缓冲液由tris-hcl、mgcl2、kcl、triton x-100等缓冲体系构成。一般单个pcr反应管中总体积为20μl～200μl。
36.在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字pcr扩增体系，即可以直接用于数字pcr仪上进行扩增。
37.第四方面，提供了一种用于非诊断目的的血流感染病原体联检并区分的方法，所述方法包括以下步骤：
38.1)提取或释放待测样本的核酸；
39.2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量pcr；
40.3)获得并分析结果。
41.在本发明中，用于检测的样本可以是血液、血浆等，但不限于此。还可以是肺泡灌洗液、痰液、穿刺组织、脓液、伤口分泌物等等。
42.进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：
43.dna预变性，温度为95℃，时间为1～3min，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
44.在一个具体的实施方案中，提供了一种用于制备血流感染病原体联检并区分的组
合物的用途，所述联检包括以下步骤：
45.1)提取待测样本的核酸；
46.2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量pcr；
47.3)获得并分析结果。
48.进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：
49.dna预变性，温度为95℃，时间为1～3min，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
50.在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染上述病原体并罹患血流感染的信息。例如，该方法可以在检测培养物中(例如血液)需求检测是否有上述病原体。
附图说明
51.图1为本发明组合物检测结果图(分别为咽峡炎链球菌、缓症链球菌、屎肠球菌)；
52.图2为本发明组合物灵敏度结果图(咽峡炎链球菌)；
53.图3为本发明组合物灵敏度结果图(缓症链球菌)；
54.图4为本发明组合物灵敏度结果图(屎肠球菌)；
55.图5为本发明组合物特异性结果图；
56.图6为本发明组合物的单靶点引物和对比例引物检测结果图(咽峡炎链球菌)；
57.图7为本发明组合物的单靶点引物和对比例引物检测结果图(缓症链球菌)；
58.图8为本发明组合物的单靶点引物和对比例引物检测结果图(屎肠球菌)；
59.图9为所选咽峡炎链球菌silb-1和缓症链球菌lta-1/lta-2组合基因扩增检测效果；
60.图10为所选缓症链球菌lta-1和咽峡炎链球菌silb-1/silb-2组合基因扩增检测效果；
61.图11为所选咽峡炎链球菌silb-1和屎肠球菌hyl-1/hyl-2组合基因扩增检测效果。
具体实施方式
62.下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
63.实施例1、本发明所使用的引物及探针
64.本发明所使用的引物及探针如下表1所示。
65.表1
[0066][0067]
其中，咽峡炎链球菌探针的荧光报告基团为fam；缓症链球菌探针的荧光报告基团为hex；屎肠球菌探针的荧光报告基团为rox。
[0068]
实施例2、检测咽峡炎链球菌、缓症链球菌和屎肠球菌的方法
[0069]
荧光pcr扩增反应液：含有pcr缓冲液、taq酶、mg
2+
、dntp、引物、探针等。具体的反应体系如表2所示。
[0070]
表2
[0071]
组分每一个反应中的体积/浓度pcr缓冲液23.5μltaq酶2.5μl(5u/μl)mg
2+
0.3μl(1m)dntp1μl引物探针0.25μl样本dna20μlddh2o补至50μl
[0072]
其扩增反应程序如表3所示。
[0073]
表3
[0074][0075]
结果分析与判断：
[0076]
反应结束后自动保存结果，对检测靶标的扩增曲线分别进行分析。根据分析后图像调节baseline的start值、end值以及threshold值(用户可根据实际情况自行调整，start值可以在3～15、end值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线)，点击analyze进行分析，使各项参数符合下述“质量控制”中的要求，然后到plate窗口下记录
定性结果。
[0077]
质量控制
[0078]
阴性对照：fam、rox、hex三个通道的曲线均无ct值显示；
[0079]
阳性对照：fam、rox、hex三个通道的曲线ct≤36；
[0080]
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
[0081]
阳性判断值
[0082]
通过参考值的研究确定本试剂盒检测目标基因的ct参考值为38。
[0083]
根据上述的检测结果，判断结果如下表4所示：
[0084]
表4
[0085][0086][0087]
实施例3、本发明组合物测试样本的检测结果
[0088]
将实施例1所示的引物和探针，按照实施例2的方法对咽峡炎链球菌、缓症链球菌、屎肠球菌，在荧光定量pcr仪器上进行pcr检测，检测结果如图1所示，从图中可以看出，本发明组合物能够对咽峡炎链球菌、缓症链球菌和屎肠球菌进行良好的检测和区分。
[0089]
实施例4、本发明组合物的灵敏度
[0090]
使用本发明实施例1中的组合物，对各个靶标进行lod(灵敏度)检测，以模拟临床样本，在荧光定量pcr仪器上进行多重pcr检测。结果如图2～图4所示，表明对低至500拷贝/ml的样本各通道仍然能够准确检测出，表明本发明组合物的灵敏度为500拷贝/ml。
[0091]
实施例5、本发明组合物的特异性
[0092]
为了测试本发明实施例1中的组合物的空白特异性，以阴性对照为样本，按照上述操作步骤进行检测。结果如图5显示，各靶标通道均无非特异扩增，试剂盒的空白特异性好。
[0093]
对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针
[0094]
由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。
[0095]
因此，发明人还针对每一个靶标分别进行了扩增效果的比较，结果如图6～图8所示，此外还组成了不同的检测体系1～3(序列未示出)，同样用于检测上述病原体，具体检测结果如图9～图11所示。
[0096]
从图中可以看出，其余的引物和探针在单靶点的检测效果中其差距较小，但是放在联检的系统中，其扩增效果的差距明显比单靶点检测更大，这可能是由于联检系统互相的引物探针影响所致；具体地，如图8所示，针对屎肠球菌分别设计的引物探针对hyl-1和hyl-2，两者的检测效果接近，但是，如图11，将屎肠球菌hyl-1和hyl-2分别与咽峡炎链球菌
silb-1混合进行扩增检测，检测结果hyl-1与silb-1的组合显著优于hyl-2与silb-1。因此，说明本发明的联检系统具有优越性。同样地，其余两个靶标的组合也能体现相似的检测结果。

技术特征：
1.一种血流感染病原体联检并区分的组合物，包括：如seq id no:1～3所示的检测咽峡炎链球菌的上游引物、下游引物及探针；如seq id no:4～6所示的检测缓症链球菌的上游引物、下游引物及探针；以及如seq id no:7～9所示的检测屎肠球菌的上游引物、下游引物及探针。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，咽峡炎链球菌探针的荧光报告基团为fam；缓症链球菌探针的荧光报告基团为hex；屎肠球菌探针的荧光报告基团为rox。5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备血流感染病原体联检并区分的试剂盒中的用途，其中，所述病原体为咽峡炎链球菌、缓症链球菌、屎肠球菌。7.一种血流感染病原体联检并区分的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～5中任一项所述的组合物。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸提取试剂、dna聚合酶、dntp、dutp、udg酶、pcr缓冲液以及mg
2+
中的至少一种。10.一种用于制备血流感染病原体联检并区分的试剂的用途，所述联检包括以下步骤：1)提取待测样本的核酸；2)使用如权利要求1～5中任一项所述的组合物或权利要求7～9中任一项所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量pcr；3)获得并分析结果。

技术总结
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及血流感染相关病原菌的检测，更具体地，涉及咽峡炎链球菌、缓症链球菌和屎肠球菌的检测。本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现咽峡炎链球菌、缓症链球菌、屎肠球菌的检测和区分，以便针对性的提高治疗策略。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。检测更为准确。检测更为准确。


技术研发人员：符小玉 张登峰 钟秋梅 丁峰 吴康 刘佳 戴立忠
受保护的技术使用者：圣湘生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.08.01
技术公布日：2023/10/15