一种原代脂肪细胞的培养方法

1.本发明涉及一种原代脂肪细胞的培养方法。


背景技术：

2.脂肪细胞起源于间充质干细胞，其主要参与人体能量平衡的调节，可以把多余的能量以甘油三酯的形式储存于体内并受底物水平及激素的调节释放游离脂肪酸以适应机体其他器官的能量需求。脂肪细胞也呈现出自分泌、旁分泌和内分泌的功能，为了进步明确脂肪细胞的代谢作用、内分泌功能、在正常及病理状态的生长发育过程，人们开展了各种细胞培养技术，并不断研究改进，建立了脂肪细胞培养模型，为研究相关疾病的发病机制提供了有利的工具。然而原代脂肪细胞提取的方法已较为成熟，由于脂肪细胞是悬浮于培养基上生长，故其培养方式采用的是天花板培养法，但是这种方式存在浪费培养基和无法干预原代细胞等缺点。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是提供一种原代脂肪细胞的培养方法，该方法以封口膜为固相载体，将脂肪细胞悬浮于培养基中生长。
4.为解决上述技术问题，本发明提供了一种原代脂肪细胞的培养方法，包括以下步骤：
5.(1)封口膜制备：将封口膜裁剪为直径为55mm的圆形，经75％的酒精浸泡24h后，在60℃环境下烘干；
6.(2)原代脂肪细胞的提取：取得新鲜脂肪组织，立即用含有4％青链霉素的hanks缓冲液清洗脂肪组织，用剪刀和镊子剔除肉眼可见的红色血管和白色纤维组织，用眼科剪剪碎组织呈稀糊状，将剪碎的脂肪组织转移至50ml第一离心管中，并加入提前无菌过滤后的消化酶缓冲液，所述的消化酶缓冲液的组成为每100ml hanks液中加入3g bsa、0.8g胶原酶和0.48g dispase ii，消化酶缓冲液添加量为脂肪组织的2倍，然后置于37℃恒温水浴箱中反复振荡以充分消化组织，震荡速度为150次/min，震荡1h后试管中无明显脂肪块即为消化成功，然后以2000rpm的转速离心5min，将上层油脂用移液枪弃去，把中间黄色脂肪层转移至新的50ml第二离心管中，加入等体积的无菌hanks液清洗，混匀后放入离心机，以2000rpm的转速离心5min，分层后继续用移液枪弃去上层油脂，将提前准备好的无菌滤网置于培养皿上，用移液枪把黄色脂肪层转移至滤网上，轻轻搅动使脂肪细胞穿过滤网，收集培养皿中滤过的脂肪细胞原液，将脂肪细胞原液转移至新的50ml第三离心管中，以2500rpm离心5min后用移液枪吸净上层油脂，再将中间黄色的脂肪细胞转移至新的第四离心管中；
7.(3)将脂肪细胞滴加到制备后的封口膜上，置于37℃的培养箱中静置30min；
8.(4)向6孔板中加入2ml的脂肪培养基，随后将脂肪细胞静置后的封口膜倒置于6孔板中，所述的脂肪培养基的组成为每500ml dmem/f12培养基中添加55ml胎牛血清和5.5ml青霉素链霉素混合液，所述的青霉素链霉素混合液中青霉素g钠盐的工作浓度为100u/ml和
硫酸链霉素的工作浓度为0.1mg/ml；
9.(5)将6孔板置于37℃、co2浓度5％的培养箱中培养。
10.本发明的优点：本发明所述的一种原代脂肪细胞的培养方法，以封口膜为固相载体，将脂肪细胞悬浮于培养基中生长。节约了脂肪细胞培养基和胎牛血清的用量。易用于脂肪细胞的炎症、凋亡、焦亡和去分化模型的建立。
附图说明
11.图1脂肪细胞染色后的电镜照片200倍。
具体实施方式
12.一种原代脂肪细胞的培养方法，包括以下步骤：
13.(1)封口膜制备：将parafilm封口膜(采购于美国parafilm公司)裁剪为直径为55mm的圆形，经75％的酒精浸泡24h后，在60℃环境下烘干；
14.(2)原代脂肪细胞的提取：取得新鲜脂肪组织，立即用含有4％青链霉素的hanks缓冲液清洗脂肪组织，用剪刀和镊子剔除肉眼可见的红色血管和白色纤维组织，用眼科剪剪碎组织呈稀糊状，将剪碎的脂肪组织转移至50ml第一离心管中，并加入提前无菌过滤后的消化酶缓冲液，所述的消化酶缓冲液的组成为每100ml hanks液中加入3g bsa、0.8g胶原酶和0.48g dispase ii，消化酶缓冲液添加量为脂肪组织的2倍，然后置于37℃恒温水浴箱中反复振荡以充分消化组织，震荡速度为150次/min，震荡1h后试管中无明显脂肪块即为消化成功，然后以2000rpm的转速离心5min，将上层油脂用移液枪弃去，把中间黄色脂肪层转移至新的50ml第二离心管中，加入等体积的无菌hanks液清洗，混匀后放入离心机，以2000rpm的转速离心5min，分层后继续用移液枪弃去上层油脂，将提前准备好的无菌滤网置于培养皿上，用移液枪把黄色脂肪层转移至滤网上，轻轻搅动使脂肪细胞穿过滤网，收集培养皿中滤过的脂肪细胞原液，将脂肪细胞原液转移至新的50ml第三离心管中，以2500rpm离心5min后用移液枪吸净上层油脂，再将中间黄色的脂肪细胞转移至新的第四离心管中；
15.(3)将脂肪细胞滴加到制备后的封口膜上，置于37℃的培养箱中静置30min；
16.(4)向6孔板中加入2ml的脂肪培养基，随后将脂肪细胞静置后的封口膜倒置于6孔板中，所述的脂肪培养基的组成为每500ml dmem/f12培养基中添加55ml胎牛血清和5.5ml青霉素链霉素混合液，所述的青霉素链霉素混合液中青霉素g钠盐的工作浓度为100u/ml和硫酸链霉素的工作浓度为0.1mg/ml；
17.(5)将6孔板置于37℃、co2浓度5％的培养箱中培养。
18.原代脂肪细胞的鉴定：
19.对培养得到的原代脂肪细胞进行染色处理，电镜照片如图1所示：
20.hoschst是对脂肪细胞核进行染色，cell mask deep red是对脂肪细胞膜进行染色，bodipy是对脂肪细胞脂滴进行染色。


技术特征：
1.一种原代脂肪细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)封口膜制备：将封口膜裁剪为直径为55mm的圆形，经75％的酒精浸泡24h后，在60℃环境下烘干；(2)原代脂肪细胞的提取：取得新鲜脂肪组织，立即用含有4％青链霉素的hanks缓冲液清洗脂肪组织，用剪刀和镊子剔除肉眼可见的红色血管和白色纤维组织，用眼科剪剪碎组织呈稀糊状，将剪碎的脂肪组织转移至50ml第一离心管中，并加入提前无菌过滤后的消化酶缓冲液，所述的消化酶缓冲液的组成为每100ml hanks液中加入3g bsa、0.8g胶原酶和0.48g dispase ii，消化酶缓冲液添加量为脂肪组织的2倍，然后置于37℃恒温水浴箱中反复振荡以充分消化组织，震荡速度为150次/min，震荡1h后试管中无明显脂肪块即为消化成功，然后以2000rpm的转速离心5min，将上层油脂用移液枪弃去，把中间黄色脂肪层转移至新的50ml第二离心管中，加入等体积的无菌hanks液清洗，混匀后放入离心机，以2000rpm的转速离心5min，分层后继续用移液枪弃去上层油脂，将提前准备好的无菌滤网置于培养皿上，用移液枪把黄色脂肪层转移至滤网上，轻轻搅动使脂肪细胞穿过滤网，收集培养皿中滤过的脂肪细胞原液，将脂肪细胞原液转移至新的50ml第三离心管中，以2500rpm离心5min后用移液枪吸净上层油脂，再将中间黄色的脂肪细胞转移至新的第四离心管中；(3)将脂肪细胞滴加到制备后的封口膜上，置于37℃的培养箱中静置30min；(4)向6孔板中加入2ml的脂肪培养基，随后将脂肪细胞静置后的封口膜倒置于6孔板中，所述的脂肪培养基的组成为每500ml dmem/f12培养基中添加55ml胎牛血清和5.5ml青霉素链霉素混合液，所述的青霉素链霉素混合液中青霉素g钠盐的工作浓度为100u/ml和硫酸链霉素的工作浓度为0.1mg/ml；(5)将6孔板置于37℃、co2浓度5％的培养箱中培养。

技术总结
一种原代脂肪细胞的培养方法，包括以下步骤：将封口膜裁剪为直径为55mm的圆形，酒精浸泡24h后烘干；新鲜脂肪细胞用含有4％青链霉素的Hanks缓冲液清洗并剪碎组织呈稀糊状，加入消化酶缓冲液消化组织，离心后将上层油脂用移液枪弃去，脂肪层加入无菌Hanks液清洗离心并弃去上层油脂，收集脂肪细胞原液离心后，除净上层油脂；将脂肪细胞滴加到制备后的封口膜上静置30min；向6孔板中加入脂肪培养基，将脂肪细胞静置后的封口膜倒置于6孔板中，将6孔板置于37℃、CO2浓度5％的培养箱中培养。该方法以封口膜为固相载体，将脂肪细胞悬浮于培养基中生长。节约了脂肪细胞培养基和胎牛血清的用量。量。


技术研发人员：李静 耿志军 宋雪 左芦根 许轶博 孙洋 赵天豪 杨晶晶 殷丽霞 张小凤 王炼 王月月
受保护的技术使用者：蚌埠医学院第一附属医院（蚌埠医学院附属肿瘤医院）
技术研发日：2023.08.05
技术公布日：2023/10/15