水稻叶绿体被膜钙通道蛋白编码基因GCSC1及其在提高稻米钙含量中的应用

水稻叶绿体被膜钙通道蛋白编码基因gcsc1及其在提高稻米钙含量中的应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，涉及水稻叶绿体被膜钙通道蛋白编码基因gccs1在提高稻米钙含量中的应用。


背景技术：

2.钙(ca)是生物生长发育所必需的元素之一。钙在维持细胞膜系统结构的完整性中是必需的(sanders et al.,2002；weaver and heaney,2006；ross,2011)；同时，钙是原核生物、真核单细胞生物和真核多细胞生物最普遍采用的信号分子(case et al.,2007；clapham,2007)。很多刺激都可以引起细胞内ca
2+
浓度的变化，细胞通过调控基因表达或磷酸化级联反应从而做出相应的生理响应。在所有人体必需的21种矿质元素中，钙是需求最大的元素(weaver and heaney,2006)。据2011年美国国家科学院医学研究所(institute of medicine)研究，1-3岁的婴幼儿维持正常生命活动每天所需的钙为500mg/d；4-8岁的钙需求量为800mg/d；9-18岁的钙需求量为1100mg/d；19-50岁的钙需求量为800mg/d；51-70岁男性的钙需求量为800mg/d，女性为1000mg/d；71岁以上钙需求量为1100mg/d(ross et al.,2011)。人体中90％的钙沉积在骨骼和牙齿中，维持其结构形态和强度，长期缺钙会导致骨密度降低，引起骨质疏松等疾病(weaver and heaney,2006；ross,2011)。同时，ca
2+
在受精、新陈代谢、凝血、神经冲动传导、肌肉收缩和细胞信号传导等生理活动中起着极其重要的作用。目前许多国家和地区都面临钙摄入量不足引发的健康的问题。
3.人体所需钙的主要来自于日常饮食，其中乳制品是最主要的来源之一。随着现代农业的发展，人类代谢活动所需能量物质主要来自于水稻小麦等几种主要的谷物作物。而谷物作物的籽粒是整个植物体中钙积累量最少的部位(hirschi,2009)。因此，以水稻和小麦等为主食的人群钙摄入不足的现象更为严重。通过传统育种或利用现代生物技术来提高作物可食用部位尤其是主食中矿质元素或维生素含量的手段，即生物强化，是缓解矿质元素摄入不足经济有效的手段(yang et al.,2007；bouis and saltzman,2017；listman et al.,2019)。生物强化的农作物在缓解钙等矿质营养元素摄入不足造成的“隐性饥饿”方面发挥了重要作用。目前在发展中国家已有超过2000多万人种植和食用生物强化农作物(yang et al.,2007；bouis and saltzman,2017；listman et al.,2019)。
4.水稻作为重要粮食作物之一，不仅为世界人口提供近23％的能量，同时也是矿质营养元素的主要来源。稻米中钙的积累同时受到环境和遗传因素的影响。尽管植物中有关钙对生理过程调控方面的作用已经进行了大量的研究，但是植物是如何吸收、转运、同化和积累钙的机理还不是很清楚。定位水稻籽粒矿质营养元素含量的数量性状基因座(quantitative trait locus,qtl)挖掘水稻籽粒矿质元素积累相关基因，提高水稻籽粒中钙等矿质营养元素的含量有助于缓解钙等矿质营养元素缺乏的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是解决现有技术中存在的上述问题，提供水稻叶绿体被膜钙通道蛋白编码基因gcsc1在提高稻米钙含量中的应用。
6.本发明的第一个目的是提供敲除或过量表达水稻钙通道蛋白编码基因gcsc1在提高水稻籽粒钙含量和/或促进钙由水稻衰老组织向新生组织转移和/或促进钙由水稻旗叶向籽粒转移的应用。
7.进一步的，所述水稻钙通道蛋白编码基因gcsc1的基因组核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。
8.进一步的，所述水稻钙通道蛋白编码基因gcsc1的cds序列如seq id no.3或seq id no.4所示。
9.本发明的第二个目的是提供水稻钙通道蛋白编码基因gcsc1的敲除载体在提高水稻籽粒钙含量和/或促进钙由水稻衰老组织向新生组织转移和/或促进钙由水稻旗叶向籽粒转移的应用。
10.进一步的，所述敲除载体为以pylcrispr/cas9pubi-h载体为基础载体，将seq id no.5和seq id no.6所示钙通道蛋白编码基因gcsc1的靶点序列t1和靶点序列t2插入基础载体的bsai-bsai酶切位点之间所得。
11.本发明的第三个目的是提供水稻钙通道蛋白编码基因gcsc1的过量表达载体在提高水稻籽粒钙含量和/或促进钙由水稻衰老组织向新生组织转移和/或促进钙由水稻旗叶向籽粒转移的应用。
12.进一步的，所述过量表达载体为以pun1301-egfp载体为基础载体，将seq id no.3或seq id no.4所示水稻钙通道蛋白编码基因gcsc1的cds序列插入基础载体的kpni-saci酶切位点之间所得。
13.本发明的第四个目的是提供一种提高水稻籽粒钙含量和/或促进钙由水稻衰老组织向新生组织转移和/或促进钙由水稻旗叶向籽粒转移的方法，所述方法为向水稻种导入水稻钙通道蛋白编码基因gcsc1的敲除载体或水稻钙通道蛋白编码基因gcsc1的过量表达载体。
14.进一步的，本发明所述组织为籽粒、叶片、叶鞘中的一种或多种。
15.本发明的有益效果
16.1、本发明通过系统研究，首次克隆了一个新类型水稻叶绿体被膜钙通道蛋白编码基因cgsc1，所述gcsc1是定位在叶绿体被膜上的钙通道蛋白，并提供gcsc1在转运钙元素方面的生物学功能。
17.2、敲除钙通道蛋白编码基因cgsc1后，水稻籽粒钙含量显著提高。
18.3、过量表达钙通道蛋白编码基因cgsc1后，水稻籽粒钙含量显著提高。
19.4、敲除钙通道蛋白编码基因cgsc1后，株高和穗粒数略提高，其他农艺性状无显著变化。
20.5、敲除钙通道蛋白编码基因cgsc1后，低钙条件下，老叶中的钙向新生叶中的转移增加。
21.6、敲除钙通道蛋白编码基因cgsc1后，旗叶中的钙向籽粒中的转移增加。
22.7、构建了钙通道蛋白编码基因cgsc1的敲除材料和过量表达材料。
23.通过本发明提供的钙通道蛋白编码基因cgsc1的应用，有效促进钙从老叶向新生组织或从旗叶向籽粒中的再分配，有效提高水稻籽粒中钙含量。
附图说明
24.图1为在水稻中敲除或过量表达钙通道蛋白编码基因cgsc1基因后，籽粒中钙含量显著升高。wt为野生型，gcsc1-1、gcsc1-2、gcsc1-3为3个独立敲除株系，oe-1、oe-2、oe-3为3个独立过量表达株系。
25.a：aas测定野生型、3个基因敲除突变体和3个过量表达株系籽粒中钙含量，突变体籽粒中钙含量显著提高。
26.b：xrf测定扫描野生型和3个基因敲除突变体籽粒中钙含量，突变体籽粒荧光更强，表明钙含量更高。
27.图2为敲除钙通道蛋白编码基因cgsc1基因后，主要农艺性状变化不大。其中基因敲除突变体的株高和穗粒数略增高，分蘖数、结实率、百粒重和单株产量无显著差异。wt为野生型，gcsc1-1、gcsc1-2为2个独立敲除株系。
28.a：野生型和突变体的株高，突变体株高显著高于野生型。
29.b：野生型和突变体的分蘖数，野生型和突变体无明显差异。
30.c：野生型和突变体的结实率，野生型和突变体无明显差异。
31.d：野生型和突变体的穗粒数，突变体穗粒数显著高于野生型。
32.e：野生型和突变体的百粒重，野生型和突变体无明显差异。
33.f：野生型和突变体的单株产量，野生型和突变体无明显差异。
34.图3为水稻钙通道蛋白gcsc1的亚细胞定位。gcsc1定位于水稻叶绿体被膜上。
35.图4为敲除钙通道蛋白编码基因cgsc1基因后，钙从老叶向新生叶及从旗叶向籽粒中的转移增加。wt为野生型，gcsc1-1、gcsc1-3为2个独立敲除株系。
36.a：正常钙和低钙处理下野生型和基因敲除突变体生长状况，正常钙条件下野生型生长速度快于突变体，低钙条件下基因敲除突变体新生叶缺钙坏死情况较轻，说明突变体老叶中更多的钙转移到新生叶中。180μm为正常钙条件，0.18μm为低钙处理条件。
37.b：统计a中正常钙和低钙条件下新生叶鲜重，正常钙条件下基因敲除突变体新生叶鲜重显著低于野生型，低钙条件下突变体新生叶鲜重显著高于野生型，说明低钙条件下突变体老叶中的钙向新生叶转移的更多，突变体新生叶生长更好。180μm为正常钙条件，0.18μm为低钙处理条件。
38.c：xrf分析a中老叶和新生叶中钙含量，正常钙条件下野生型和突变体老叶和新生叶中荧光强度无显著差异，低钙条件下突变体老叶中荧光强度显著低于野生型且新生叶中荧光强度无显著差异，说明突变体老叶中的钙向新生叶中转移更多。
39.d：aas测定a中老叶和新生叶中钙含量，正常钙条件下野生型和突变体老叶和新生叶中钙含量无显著差异，低钙条件下突变体老叶中钙含量显著低于野生型，说明突变体老叶中的钙向新生叶中转移更多。
40.e：旗叶饲喂
44
ca同位素分析钙从叶片向籽粒中的再分配，突变体籽粒和旗叶鞘中
44
ca同位素相对含量显著高于野生型，说明突变体旗叶中的钙向籽粒转移更多。
具体实施方式
41.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
42.实施例1
43.水稻钙通道蛋白gcsc1敲除突变体和过量表达材料的制备，具体实施过程如下：
44.1、利用pylcrispr/cas9pubi-h基因编辑技术对gcsc1进行敲除。选定gcsc1 cds区的序列ccgagtcttcgcgtccatc(seq id no.5)和序列ccgtggttctcggcgagac(seq id no.6)作为编辑靶位点t1和t2，设计构建敲除载体的引物。靶点接头引物序列如下：
45.t1-f：ggc agatggacgcgaagactcgg(seq id no.7)
46.t1-r：aaac ccgagtcttcgcgtccatc(seq id no.8)
47.t2-f：gcc ggtctcgccgagaaccacgg(seq id no.9)
48.t2-r：aaac ccgtggttctcggcgagac(seq id no.10)
49.靶点接头制备：将接头引物te溶解成100μm母液，各取1μl加入到98μl 0.5x te混合稀释到1μm。约90℃30s，移至室温冷却完成退火。
50.grna载体酶切：取pyl-u3-grna和pyl-u6a～c-grna质粒各0.5-1μg，在20μl反应用5～10u bsai(neb)酶切20min，70℃5min失活酶。冷冻保存公用。
51.grna表达盒连接反应
52.酶切过的pyl-u3(pyl-u6a～c)载体与各所对应接头连接反应：
[0053][0054]
注：由于u6b的3’粘性末端与grna片段5’粘性末端配对度高(3bp配对)，容易产生空载连接，使用较高浓度接头可减少空载连接。
[0055]
扩增gdna表达盒(虽然用第二轮pcr的位置特异引物直接从连接产物也可以扩增出目标产物，但用2轮巢式pcr扩增可以更稳定地得到特异性更好的目标产物)按下述方法进行。
[0056]
第一轮扩增：取2μl连接产物为模板，15μl pcr，使用下表引物(所有grna表达盒共用)u-f/grna-r各0.2μm，适量高保真pcr酶primer star gxl(takara,r051s)。
[0057][0058][0059]
pcr条件如下表所示：
[0060][0061]
取2μl(加te和loading buffer至6-8μl)电泳检查。
[0062]
第二轮pcr扩增：取第一轮pcr产物1μl用h2o稀释20倍，取1μl为模板，各表达盒20-50μl pcr(1个靶点50μl；2-3个靶点各30μl；4个或以上靶点各20μl)。使用的引物如下：
[0063][0064]
注：各种启动子grna表达盒的长度为(括号为bsa i切后)：u3-grna＝564bp(534bp)；u6a-grna＝629bp(599bp)；u6b-grna＝515bp(485bp)；u6c-grna＝924bp(984bp)。
[0065]
pcr条件同第一轮pcr，进行15-17循环。各取2μl(加te和loading buffer至6-8μl)电泳检查产物长度是否符合。根据各样品产物估算的量，把所有产物大致等量混合，用pcr产物纯化kit纯化(除去taq酶以防止下步骤补平bsai酶切末端)。
[0066]
靶标grna表达盒构建。取约20-70ng pcr产物(每个靶点约10-15ng)，加入约40-60ng未切割的pylcrispr/cas9pubi-h质粒(预先稀释成约100ng/μl冷冻保存)，在15μl反应用～10u bsai 37℃酶切15min。(不要失活bsa i)此buffer对bsa i和ligase都有效，加1.5μl 10x dna ligase buffer，和35u t4 dna ligase。用变温循环连接约3h:10℃5min，20℃5min，37℃5min；10-15循环。
[0067]
将验证正确的以pylcrispr/cas9pubi-h为基础载体的gcsc1敲除突变体质粒转化至水稻中。
[0068]
2、gcsc1基因敲除突变体鉴定
[0069]
用ctab法提取gcsc1基因敲除突变体植株的gdna。以gdna为模板，用gcsc1基因特异的引物扩增包含编辑的区域在内的500bp左右的片段，然后测序鉴定。鉴定引物序列如下：
[0070]
crispr-f：atcgaacaagcaaagcggttg(seq id no.11)
[0071]
crispr-r：taattaaggatgagggcctcgaac(seq id no.12)
[0072]
3、gcsc1过量表达材料构建
[0073]
以pun1301-egfp载体为基础载体，扩增seq id no.4所示的gcsc1的cds序列和egfp序列，将两个片段插入基础载体的kpni-saci酶切位点之间，形成gcsc1-egfp融合表达载体。使用引物序列如下：
[0074]
gcsc1-f1：tctagaggatccccgggtaccatggaggcggcggcg(seq id no.13)
[0075]
gcsc1-r1：tgaaccgcctccaccctgttgagatccagaatcagg(seq id no.14)
[0076]
egfp-f2：ggtggaggcggttcaatggtgagcaagggcgag(seq id no.21)
[0077]
egfp-r2：cgatcggggaaattcgagctcttacttgtacagctcgtccatgcc(seq id
[0078]
no.22)
[0079]
将测序正确的质粒转化水稻。
[0080]
本实施例中egfp作用仅为便于后期实验观察，实际使用中无需转入egfp。
[0081]
实施例2
[0082]
1、gcsc1基因敲除突变体和过量表达株系籽粒钙含量测定
[0083]
将野生型及gcsc1突变体和过表达株系于种植于海南陵水，在正常环境条件下生长至成熟。再收取种子消煮测定ca。每种材料9重复。称取0.2g左右的籽粒，脱壳，置于微波消解管中，加入5ml优级纯hno3，置于微波消解仪(mars6)中进行消解。具体消解程序如下：0-120℃，升温10min，保持5min；120℃-150℃，升温5min，保持5min；150℃-180℃，升温5min，保持15min。消解完成后，将消解管打开盖子后置于160℃赶酸板上赶酸，直至剩余一小滴，冷却至室温，用2％ hno3定容至10ml，涡旋混匀后倒入15ml离心管中保存。aas测ca含量(perkin elmer 900t,usa)。
[0084]
结果显示：3个基因敲除突变体和3个过量表达株系籽粒中钙含量相对于野生型显著提高10％-30％(图1a)。
[0085]
2、gcsc1突变体籽粒xrf扫描
[0086]
将2海南陵水的突变体籽粒脱壳后，固定在xrf专用的胶带上，然后置于m4 tornado micro-xrf(bruker,german)光谱仪中进行扫描。突变体材料为3个独立株系，每个株系9个重复。
[0087]
结果显示：3个基因敲除突变体相对于野生型籽粒荧光更强，表明钙含量更高(图1b)。
[0088]
3、gcsc1突变体农艺性状考察
[0089]
将野生型及gcsc1突变体种植于海南陵水，在正常环境条件下生长至成熟。统计野生型和gcsc1突变体的株高、分蘖数、结实率、穗粒数、百粒重和单株产量。
[0090]
结果显示：突变体的株高和穗粒数相对野生型显著提高，分蘖数、结实率、百粒重和单株产量无明显变化(图2)。
[0091]
实施例3
[0092]
利用激光共聚焦观察gcsc1在水稻原生质体中的亚细胞定位。
[0093]
水稻原生质体制备按照如下步骤进行。
[0094]
a.将野生型(zh11)和过表达(gcsc1-gfp)材料种子在37℃条件下浸种萌发3d，露白后转移到96孔板中用去离子h2o培养1周，然后转移到1/2kimura b营养液中正常生长3周；
[0095]
b.取幼苗，将茎和叶鞘切成小段(切的尽量细)，将切好的组织块浸入细胞培养板中的酶解液中；酶解液的配方如下表所示：
[0096][0097]
55℃水浴10min，使溶解完全，然乎置于室温下自然冷却，现配现用。
[0098]
c.将细胞培养板用锡箔纸包裹遮光，置于摇床上，80rpm，28℃酶解4h(注意酶解时间不能过长，否则不仅原生质体数量不会增加，细胞还会因为过度酶解而破碎)；
[0099]
d.加入等体积的w5溶液终止反应，w5溶液配方如下：
[0100][0101]
121℃高温高压灭菌20min，避免染菌，长期使用。
[0102]
e.取原生质体，用双光子激光共聚焦显微镜(olympus fv1000 mpe)观察荧光。其中gfp激发光为488nm，收集500-540nm波段的发射光。叶绿体自发荧光的激发光为488nm，收集650-750nm的荧光波段。
[0103]
所需要配置的母液如下：
[0104][0105]
结果显示：gcsc1定位于水稻叶绿体被膜上(图3)。
[0106]
实施例4
[0107]
1、低钙处理条件下水稻幼苗钙再分配实验
[0108]
将正常条件下培养的野生型(zh11)和gcsc1突变体幼苗分成2部分，一份于1/
2kimura b营养液(180mm ca)继续培养，一部分转移到含有1/100ca的营养液(0.18mm ca)中进行处理。直至缺钙处理的水稻幼苗长出一片新叶，且新叶出现明显的坏死现象。此时，统计野生型和突变体生理表型，并取1/100ca处理时最上面一片成熟叶和处理后新长出来的叶片及其正常条件下相对应叶位的叶片进行xrf(bruker’s m4 tornado micro-xrf)扫描。每个株系3重复。
[0109]
在同样的处理条件下，取成熟叶和新生叶的叶片进行石墨消煮。然后用aas测定叶片中钙的含量。
[0110]
结果显示：观察正常钙和低钙处理下野生型和基因敲除突变体生长状况，正常钙条件下野生型生长速度快于突变体，低钙条件下基因敲除突变体新生叶缺钙坏死情况较轻，说明突变体老叶中更多的钙转移到新生叶中(图4a)。进一步测量正常钙和低钙条件下新生叶鲜重，正常钙条件下基因敲除突变体新生叶鲜重显著低于野生型，低钙条件下突变体新生叶鲜重显著高于野生型，说明低钙条件下突变体老叶中的钙向新生叶转移的更多，突变体新生叶生长更好(图4b)。xrf分析a中老叶和新生叶中钙含量，正常钙条件下野生型和突变体老叶和新生叶中荧光强度无显著差异，低钙条件下突变体老叶中荧光强度显著低于野生型且新生叶中荧光强度无显著差异，说明突变体老叶中的钙向新生叶中转移更多(图4c)。aas测定a中老叶和新生叶中钙含量，正常钙条件下野生型和突变体老叶和新生叶中钙含量无显著差异，低钙条件下突变体老叶中钙含量显著低于野生型，说明突变体老叶中的钙向新生叶中转移更多(图4d)。
[0111]
2、
44
ca稳定同位素分析钙从旗叶向籽粒的再分配
[0112]
将野生型(zh11)和gcsc1突变体盆栽培养至灌浆期，剪断旗叶浸入1mm 44
ca，5mm mes ph 6.4，0.01％tween v/v溶液中直至灌浆结束，期间每天更换一次处理液。收集籽粒、旗叶叶片、旗叶叶鞘测定
44
ca含量。
[0113]
结果显示：突变体籽粒和旗叶鞘中
44
ca同位素相对含量显著高于野生型，说明突变体旗叶中的钙向籽粒转移更多(图4e)。
[0114]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.敲除或过量表达水稻钙通道蛋白编码基因gcsc1在提高水稻籽粒钙含量和/或促进钙由水稻衰老组织向新生组织转移和/或促进钙由水稻旗叶向籽粒转移的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻钙通道蛋白编码基因gcsc1的基因组核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻钙通道蛋白编码基因gcsc1的cds序列如seq id no.3或seq id no.4所示。4.水稻钙通道蛋白编码基因gcsc1的敲除载体在提高水稻籽粒钙含量和/或促进钙由水稻衰老组织向新生组织转移和/或促进钙由水稻旗叶向籽粒转移的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述敲除载体为以pylcrispr/cas9pubi-h载体为基础载体，将seq id no.5和seq id no.6所示钙通道蛋白编码基因gcsc1的靶点序列t1和靶点序列t2插入基础载体的bsai-bsai酶切位点之间所得。6.水稻钙通道蛋白编码基因gcsc1的过量表达载体在提高水稻籽粒钙含量和/或促进钙由水稻衰老组织向新生组织转移和/或促进钙由水稻旗叶向籽粒转移的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述过量表达载体为以pun1301-egfp载体为基础载体，将seq id no.3或seq id no.4所示水稻钙通道蛋白编码基因gcsc1的cds序列插入基础载体的kpni-saci酶切位点之间所得。8.一种提高水稻籽粒钙含量和/或促进钙由水稻衰老组织向新生组织转移和/或促进钙由水稻旗叶向籽粒转移的方法，其特征在于，所述方法为向水稻种导入水稻钙通道蛋白编码基因gcsc1的敲除载体或水稻钙通道蛋白编码基因gcsc1的过量表达载体。9.根据权利要求1至7任意一项所述的应用或权利要求8所述的方法，其特征在于，所述组织为籽粒、叶片、叶鞘中的一种或多种。

技术总结
本发明公开了水稻叶绿体被膜钙通道蛋白编码基因GCSC1的在提高稻米钙含量中的应用。一种钙通道蛋白编码基因GCSC1，序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。该基因可在提高水稻籽粒钙含量，和/或促进钙由水稻衰老组织向新生组织或从旗叶向籽粒转移的应用。本发明通过大量实验发现了水稻中的钙通道蛋白编码基因GCSC1的生物学功能。敲除该基因后，钙的再分配增加，水稻籽粒中钙含量显著提高；同时，过量表达该基因后，水稻籽粒中钙含量显著提高。水稻籽粒中钙含量显著提高。水稻籽粒中钙含量显著提高。


技术研发人员：黄新元 刘桓 赵方杰
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：2023.08.07
技术公布日：2023/10/15