鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的引物与应用

1.本发明涉及分子标记技术，具体涉及鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的引物与应用。


背景技术：

2.黄颡鱼(pelteobagrusfulvidraco)俗称黄姑子、黄骨鱼、黄辣丁等，隶属于鲇形目(siluriformes)、鲿科(bagridae)、黄颡鱼属(pelteobagrus)，广泛分布于我国淡水水体中。因其肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富、无肌间刺等特点，而备受广大消费者的青睐，同时其具有较强的免疫能力，已逐渐成为我国重要经济鱼类。瓦氏黄颡鱼(pelteobagrus vachelli)，俗称江黄颡，为我国特有种，是黄颡鱼属中个体最大的种，最大个体可达1850克。杂交黄颡鱼(p.fulvidraco
♀×
p.vachelli
♂
)是以瓦氏黄颡鱼为父本、黄颡鱼为母本的杂交后代。杂交黄颡鱼具有受精率和存活率高、生长快、抗病力强、肉质好等特点，显现出较强的杂种优势，因而深受水产养殖户和消费者喜爱，已成为当今最为广泛养殖的黄颡鱼品种。但杂交黄颡鱼与其亲本的体型形态极为相似，仅靠形态学特征难以将之区分，尤其是在幼苗时期更难识别鉴定。随着近年来杂交黄颡鱼的养殖产量持续上升，加之生产过程中近交严重，导致当下养殖的黄颡鱼种质退化严重，因而迫切需要一种能快速、准确、可靠的鉴定三种黄颡鱼的dna分子标记，以期为黄颡鱼亲本保种和优良品种的选育提供重要分子工具。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的引物与应用，提供了一种稳定、高效识别黄颡鱼及其瓦氏黄颡鱼杂交种的方法，为黄颡鱼下一步的保种、育种及杂交选育研究奠定坚实基础，并且能够更好在生产实践中去应用。
4.为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：
5.鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的引物，所述引物为针对spoplb基因的dna分子标记，包括正向引物与反向引物，其核苷酸序列如seq id no.1-2所示。
6.另一方面，本发明提供基于上述引物鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的方法，包括：提取待测黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的基因组dna，利用上述引物进行pcr扩增，得到三个不同的pcr产物。以上述三个不同pcr产物扩增的凝胶电泳结果来判断其种类，只扩增出一条条带的为黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼；同时扩增出黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼各自存在的条带的为瓦氏黄颡鱼与黄颡鱼杂交种黄颡鱼。
7.进一步的，所述dna分子标记，在黄颡鱼中只扩增出一条条带，在瓦氏黄颡鱼中只扩增出一条条带，在杂交种黄颡中同时扩增出黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼各自特有条带。
8.另一方面，本发明提出一种试剂盒，所述试剂盒包括上述引物。
9.另一方面，本发明提出上述引物在黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种辅助选择育种中的应用。
10.进一步的，本发明提出上述引物在检测黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种种系鉴别中的应用。
11.另一方面，本发明提出上述试剂盒在黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种辅助选择育种中的应用。
12.进一步的，本发明提出上述试剂盒在检测黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种种系鉴别中的应用。
13.本发明的有益效果：
14.本发明提供了一种稳定、高效识别黄颡鱼及其瓦氏黄颡鱼杂交种的方法。通过引物设计和pcr扩增技术，可以快速、准确地鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和杂交种，对于黄颡鱼的保种、育种以及杂交选育研究提供了重要的分子工具。通过利用spoplb基因的dna分子标记，可以针对不同种类的黄颡鱼进行特异性扩增，从而得到不同的pcr产物。这种方法具有高度的特异性和灵敏性，对于精确鉴别三种黄颡鱼具有重要的意义。
15.本发明的引物设计基于spoplb基因的dna分子标记。spoplb基因在黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和杂交种中具有显著的遗传差异，这主要是由于它们来自不同的亲本。通过选择与spoplb基因相关的核苷酸序列作为引物，可以实现对这些物种进行特异性扩增。这种基于dna分子标记的识别方法在准确鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和杂交种方面具有优势，相较于传统的形态鉴别方法更为可靠和准确。
16.本发明提供了一种试剂盒，包括上述引物。试剂盒的设计遵循了实验操作的方便性和实验结果的稳定性。试剂盒中的引物经过严格筛选和验证，可以保证引物的特异性和扩增效率。同时，试剂盒还包含了其他必要的试剂和缓冲液，可以一站式提供实验所需材料，节省了实验设计和试剂购买的时间和成本。
17.本发明的引物的应用领域广泛。除了在黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼和杂交种的鉴别中应用外，这些引物还可以用于辅助选择育种和种系鉴别。通过分子标记技术，可以对黄颡鱼的遗传多样性进行研究，了解遗传变异和种群结构，为优良品种的选育和种系的鉴别提供重要的参考依据。同时，这些引物还可以应用于数量遗传学研究，如遗传标记辅助选育和亲本选择等，进一步推动黄颡鱼产业的发展。
18.综上所述，上述各点的专业详细完善主要强调了鉴别方法的特异性和准确性，引物设计的基于分子标记的原理，试剂盒的方便和稳定性，以及引物在种质保护和优良品种选育中的广泛应用。这些完善的内容进一步突出了技术方案的专业性和实用性，为黄颡鱼相关研究和养殖提供了重要的支持。
19.当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1为瓦氏黄颡鱼、黄颡鱼及其杂交种的pcr产物凝胶电泳示意图。
具体实施方式
22.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
23.实施例1
24.本实施例所述的鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的引物，所述引物为针对spoplb基因的dna分子标记，包括正向引物与反向引物，其核苷酸序列如seq id no.1-2所示。
25.另一方面，本发明提供鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的方法，包括：提取待测黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的基因组dna，利用上述引物进行pcr扩增，得到三个不同的pcr产物。以上述三个不同pcr产物扩增的凝胶电泳结果来判断其种类，只扩增出一条条带的为黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼；同时扩增出黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼各自存在的条带的为瓦氏黄颡鱼与黄颡鱼杂交种黄颡鱼。
26.在本实施例中，所述dna分子标记，在黄颡鱼中只扩增出一条条带，在瓦氏黄颡鱼中只扩增出一条条带，在杂交种黄颡中同时扩增出黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼各自特有条带。
27.另一方面，本发明提出一种试剂盒，所述试剂盒包括上述引物。
28.另一方面，本发明提出上述引物在黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种辅助选择育种中的应用。
29.在本实施例中，本发明提出上述引物在检测黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种种系鉴别中的应用。
30.另一方面，本发明提出上述试剂盒在黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种辅助选择育种中的应用。
31.在本实施例中，本发明提出上述试剂盒在检测黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种种系鉴别中的应用。
32.实施例2
33.一种快速鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的dna分子标记，所述的dna分子标记来源本课题组前期构建的三种黄颡鱼肌肉转录组数据，以黄颡鱼基因组数据为基础进行转录组注释，并筛选瓦氏黄颡鱼和黄颡鱼转录本(cds区域)中具有显著长度差异的分子标记。随后，对筛选到的差异转录本序列在ncbi(https://www.ncbi.nlm.ni h.gov/)数据库中进行比对鉴定，以初步确定具有核心位点长度差异的基因序列。最终，筛选得到1个可潜在辅助区分黄颡鱼、瓦式黄颡鱼及其杂交种的序列片段，并采用primer 5.0设计了1对引物(见表1)。
34.用于检测所述的dna分子标记的引物对，其上游引物序列为5
’‑
atgggcgaagtgctgaaa-3’；下游引物序列为5
’‑
gctgatg tccacacggtt-3’。
35.一种快速鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的dna分子标记的方法，包括通过对待测黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种进行所述的dna分子标记的检测，对所述黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种进行区分，包括以下步骤：
36.(1)采用tris饱和酚-氯仿法提取不同组织样品的基因组dna。
37.(2)利用本课题组前期构建的三种黄颡鱼肌肉转录组数据，对可辅助区分黄颡鱼、瓦式黄颡鱼及其杂交种的核苷酸序列片段，并采用primer 5.0设计了1对引物(见表1)，用于扩增具有显著差异的分子位点。
38.表1黄颡鱼多分子标记引物序列信息
[0039][0040]
(3)以提取的三种黄颡鱼dna为模板，用设计的特异性引物扩增潜在的差异分子标记片段。
[0041]
(3)将这对引物在黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种中所扩增的pcr产物于1％琼脂糖胶上进行电泳(见图1)，初步鉴定这些分子标记是否能用于三种黄颡鱼的鉴定。检测合格后的pcr产物于-20℃保存用于后续的测序反应。
[0042]
本发明以黄颡鱼基因组和三种黄颡鱼的转录组数据为基础，筛选得到瓦式黄颡鱼与黄颡鱼核苷酸核心片段之间的长度差异，随后设计了特异性引物对相关位点进行pcr扩增并用琼脂糖凝胶电泳检测。最终结果测序发现三种黄颡鱼的扩增片段位于spoplb基因上，并且得到dna分子标记可通过pcr准确区分瓦氏黄颡鱼、黄颡鱼及其杂交种。为黄颡鱼优良亲本的保育和新品种的选育提供重要的应用基础和分子工具。
[0043]
实施例3
[0044]
a)黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的获得；
[0045]
b)黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种鳍条dna提取；
[0046]
c)基于所述引物，对黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种基因组dna进行pcr扩增；
[0047]
d)对pcr扩增产物进行电泳检测及测序，基于测序结果，确定该序列属于什么基因，并进行判断，开发dna分子标记
[0048]
具体操作如下：
[0049]
a)黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的获得：
[0050]
用于本试验的研究对象采自四川省乐山市黄颡鱼养殖场，随机选取体质健壮、规格大小一致的瓦氏黄颡鱼、黄颡鱼、杂交黄颡鱼各5尾，剪取鳍条后保存于无水乙醇，以备后续试验使用。
[0051]
b)黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种dna的提取：
[0052]
(1)剪取鳍条0.2g于离心管中剪碎，加200μl缓冲液ga，振荡至彻底悬浮；随后加入20μl蛋白酶k溶液，颠倒混匀后置于56℃水浴锅消化1-3h(每隔30min颠倒混匀1次)直至组织完全溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。
[0053]
(2)加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0054]
(3)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0055]
(4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管
中)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。
[0056]
(5)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
[0057]
(6)向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇，12,000rpm)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
[0058]
(7)重复操作步骤(6)。
[0059]
(8)将吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液，并将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0060]
(9)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将提取的dna收集到离心管中，置于4℃冰箱保存。
[0061]
c)基于所述引物，对黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种基因组dna进行pcr扩增
[0062]
pcr引物为：
[0063]
正向引物：5
’‑
atgggcgaagtgctgaaa-3’[0064]
反向引物：5
’‑
gctgatgtccacacggtt-3’[0065]
pcr反应体系为20μl，其中模板1μl(50ng/μl)，上下游引物各0.5μl(10μmol/μl)，2
×
es taqmastermix 5μl，加ddh2o补至20μl。pcr反应程序为:94℃预变性3min，94℃变性30s，50℃退火30s,72℃延伸2min)，共34个循环，最后72℃延伸5min。pcr反应在t100 thermal cycler(bio rad,usa)pcr仪上进行。
[0066]
d)对pcr扩增产物进行电泳检测及测序，基于测序结果，确定该序列属于什么基因，并进行判断，开发dna分子标记。
[0067]
扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测合格后的pcr产物于-20℃保存用于后续的测序反应。
[0068]
综上所述，本发明公开的dna分子标记可以进行分子标记辅助育种，可以不受黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的年龄、性别等限制，提供了一种稳定、高效识别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的方法。
[0069]
本发明可以应用到实践中去，可以快速区分市场上、养殖场以及保种繁育单位的黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种，具有广泛的应用前景。
[0070]
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

技术特征：
1.鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的引物，其特征在于，所述引物为针对spoplb基因的dna分子标记，包括正向引物与反向引物，其核苷酸序列如seq id no.1-2所示。2.基于权利要求1所述引物鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的方法，其特征在于：包括：提取待测黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的基因组dna，利用上述引物进行pcr扩增，得到三个不同的pcr产物。以上述三个不同pcr产物扩增的凝胶电泳结果来判断其种类，只扩增出一条条带的为黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼；同时扩增出黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼各自存在的条带的为瓦氏黄颡鱼与黄颡鱼杂交种黄颡鱼。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述dna分子标记，在黄颡鱼中只扩增出一条条带，在瓦氏黄颡鱼中只扩增出一条条带，在杂交种黄颡中同时扩增出黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼各自特有条带。4.鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述引物。5.如权利要求1所述引物在黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种辅助选择育种中的应用。6.如权利要求1所述引物在检测黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种种系鉴别中的应用。7.如权利要求4所述试剂盒在黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种辅助选择育种中的应用。8.如权利要求4所述试剂盒在检测黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种种系鉴别中的应用。

技术总结
本发明涉及分子标记技术，具体涉及鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的引物与应用，所述引物为针对spoplb基因的DNA分子标记，包括正向引物与反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；经测序鉴定表明所述DNA分子标记位于spoplb基因上。本发明公开了检测该分子标记的引物对和检测方法。利用该DNA分子标记，可以有效鉴别黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种。这个分子标记可为黄颡鱼优良亲本的保育和新品种的选育提供重要的应用基础和分子工具。该方法准确可靠，操作简便。操作简便。操作简便。


技术研发人员：文正勇 覃川杰 石琼 魏秀英 曾万弘 吕云云 李燕平
受保护的技术使用者：内江师范学院
技术研发日：2023.08.22
技术公布日：2023/10/15