一种shRNA目的基因干扰质粒、其构建方法及应用与流程

一种shrna目的基因干扰质粒、其构建方法及应用
技术领域
1.本技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种shrna目的基因干扰质粒、其构建方法及应用。


背景技术：

2.基因的功能缺失是研究基因在生命过程中功能与作用的常规方法。利用rnai技术的基因敲低和crispr-cas9技术的基因敲除是功能缺失研究的常用手段。而通过rna干扰在mrna水平上敲低基因，是研究基因功能的常用方法。对于哺乳动物细胞培养中的瞬时敲低，现有技术有两种常用的方法，第一种是小干扰rna(sirna)方法，而第二种是短发夹rna(shrna)方法。
3.第一种sirna方法的优点是可以商业化的获得的rna寡核苷酸，它可以转染到细胞中，快速且有效地敲低基因。然而，当使用转染效率低的细胞类型或需要长时间敲低基因的实验时，sirna方法作用极为有限。
4.第二种shrna方法中，shrna是一种合成的非编码rna，可以利用内源性microrna机制来处理功能性rnai。尽管shrna方法不像sirna方法操作便捷，但shrna可以通过使用逆转录病毒传递和选择稳定基因组整合，避免低转染效率和仅能暂时敲低基因的问题。shrna在细胞中的表达可以通过质粒递送或通过病毒载体实现，通过转染将质粒递送到细胞，实现shrna的表达。然而，该方法不适用于体内，因此效用有限。
5.综上所述，使用现有常规方法构建shrna稳转株，既耗时又昂贵，且会受到“非靶向细胞”与“shrna”之间感染效率不同导致干扰效率不稳定。同时，当基因表达的操作，导致细胞生长/增殖缺陷或不需要的细胞分化时，shrna也有较大的局限性。


技术实现要素：

6.为了解决上述至少一种技术问题，开发一种成本相对低廉，能够灵活和可控的实现shrna的表达的基因敲低工具，本技术提供一种shrna目的基因干扰质粒、其构建方法及应用。
7.一方面，本技术提供一种shrna载体，所述shrna载体含有特异性启动子，所述启动子的序列如seq id no.1所示。
8.通过采用上述技术方案，本技术设计了一种h1启动子，用于驱动shrna表达，在转录shrna时，可以隔离tetr并缓解teto的抑制，以实现通过体外方式达到基因敲低的目的；此外本技术设计的shrna载体，可以通过控制四环素及其类似物的添加，实现精确控制shrna的表达时间和水平的效果，可以根据需要调节shrna的表达。
9.第二方面，本技术提供一种shrna目的基因干扰质粒，所述shrna目的基因干扰质粒包括上述的shrna载体，以及目的基因。
10.可选的，所述目的基因由含干扰序列的一对单链dna oligo，通过退火配对生成；所述含干扰序列的一对单链dna oligo的序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
11.第三方面，本技术提供了上述shrna目的基因干扰质粒的制备方法，包括以下步骤：s1、将shrna载体酶切，得到线性化shrna载体；s2、将目的基因连入步骤s1制得的线性化shrna载体上；s3、将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞并培养，对长出的单克隆菌落测序鉴定，挑选比对正确的克隆，制得shrna目的基因干扰质粒。
12.可选的，所述步骤s3的具体操作步骤如下：s3-1、将连接产物转化至感受态细胞中；s3-2、在含有药物的培养条件下，置于培养箱中诱导培养，分离抗药物干扰的转化体；s3-3、挑取单菌落扩大培养，提取质粒；s3-4、对提取的质粒进行测序鉴定，挑选目的基因插入位点、方向和序列完全正确的质粒，得到shrna目的基因干扰质粒。
13.第四方面，本技术提供了上述的shrna目的基因干扰质粒在制备目的基因干扰病毒产品和目的基因干扰细胞产品领域的应用。
14.第五方面，本技术提供了一种使用上述shrna目的基因干扰质粒的目的基因干扰慢病毒的制备方法，包括以下步骤：s4、选择转染细胞，将处于对数生长期的细胞传代到培养皿中，待细胞长到70％～80％，更换培养基并准备转染；s5、选用慢病毒试剂盒，将试剂盒中的慢病毒、慢病毒试剂和上述shrna目的基因干扰质粒混匀、静置，滴加至步骤s4的含待转染细胞培养皿中，置于co2培养箱中培养，培养过程中滴加促转染试剂，更换新鲜培养基；s6、将步骤s5经过培养的细胞，取细胞上清，经离心、过滤和浓缩，弃下层废液后，得到病毒浓缩液；s7、将步骤s6制得的病毒浓缩液经取样检测鉴定，准确带有目的基因的病毒，即为目的基因干扰慢病毒。
15.可选的，所述步骤s7中，所述rna鉴定采用实时荧光定量pcr检测方法；所述检测采用的目的基因检测引物包括wpre-f和wpre-r，所述wpre-f和wpre-r的序列分别如seq id no.4和seq id no.5所示；所述检测采用的内参基因检测用引物包括gapdh-f和gapdh-r，所述gapdh-f和gapdh-r的序列分别如seq id no.6和seq id no.7所示。
16.第六方面，本技术提供了一种使用上述目的基因干扰慢病毒的目的基因干扰细胞系的制备方法，包括以下步骤：s8、选用哺乳动物细胞，接种于多孔板中；s9、将上述慢病毒稀释成病毒稀释液，与细胞培养基配置成含病毒稀释液的培养基；s10、将步骤s9的含病毒稀释液的培养基加入到步骤s8的多孔板中，感染16h后，将含有慢病毒的培养基全量更换为细胞培养基继续培养；s11、从步骤s10培养的细胞中挑选真核抗性细胞，使用药物药筛，获得稳转株细胞，用含有药筛药物的完全培养基维持细胞；
s12、将步骤s11制得的稳转株细胞经rna提取和鉴定确认，得到目的基因干扰细胞系。
17.可选的，所述步骤s12中，所述rna鉴定采用实时荧光定量pcr检测方法；所述检测采用的目的基因检测引物包括h-nsun2-1-qf和h-nsun2-1-qr，所述h-nsun2-1-qf和h-nsun2-1-qr的序列分别如seq id no.8和seq id no.9所示；所述检测采用的内参基因检测用引物包括h-gapdh-f和h-gapdh-r，所述h-gapdh-f和h-gapdh-r的序列分别如seq id no.10和seq id no.11所示。
18.通过采用上述技术方案，本技术的方法，结合了慢病毒递送和诱导基因敲低的优点，与其它现有的细胞系构建方法相比，能够使用相同的细胞池作为对照(无诱导)和测试样品(加上诱导剂)，从而消除了转染/感染效率或“空/非靶向”和“shrna”稳定池之间的无意克隆选择的担忧；此外，本技术的成本相对于现有的细胞系构建方法更低，且不存在受到“非靶向细胞”与“shrna”之间感染效率不同导致干扰效率不稳定的问题。
19.综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：1.本技术设计了一种h1启动子，用于驱动shrna表达，在转录shrna时，可以隔离tetr并缓解teto的抑制，以实现通过体外方式达到基因敲低的目的；此外本技术设计的shrna载体，可以通过控制四环素及其类似物的添加，实现精确控制shrna的表达时间和水平的效果，可以根据需要调节shrna的表达。
20.2.本技术设计了对应的质粒产品，能够为制备目的基因干扰慢病毒或目的基因干扰细胞系，提供优质的质粒产品。
21.3.本技术制备的慢病毒载体，可用于递送shrna，从而提供高效感染大多数哺乳动物细胞类型的能力，使用本技术的慢病毒载体感染细胞后，shrna能通过聚合酶ii或聚合酶iii在细胞核中转录，整合到转录活性染色质的各个部分，从而传递给后代细胞。
22.4.本技术设计的细胞系的构建的方法，结合了慢病毒递送和诱导基因敲低的优点，与其它现有的细胞系构建方法相比，能够使用相同的细胞池作为对照(无诱导)和测试样品(加上诱导剂)，从而消除了转染/感染效率或“空/非靶向”和“shrna”稳定池之间的无意克隆选择的担忧；此外，本技术的成本相对于现有的细胞系构建方法更低，且不存在受到“非靶向细胞”与“shrna”之间感染效率不同导致干扰效率不稳定的问题。
附图说明
23.图1为本技术实施例1的shrna质粒图谱；图2为本发明实施例3制备的目的基因干扰细胞系，使用多西环素dox诱导后的realtime pcr验证结果图。
具体实施方式
24.以下结合实施例对本技术作进一步详细说明。
25.本技术设计了一种shrna载体，所述shrna载体含有特异性启动子，所述启动子的序列如seq id no.1所示。
26.本技术的载体，可以通过购买市售的shrna载体，将启动子替换为本技术的特异性启动子，即可完成构建。
27.本技术通过设计上述特异性启动子序列，能够驱动shrna表达，在加入四环素或其类似物时转录shrna，以隔离tetr并缓解teto的抑制，通过体外验证手段达到基因敲低的目的。同时，本技术的设计的特异性启动子序列，还整合了载体的酶切位点序列，采用常见的agei与ecori，在基因层面上有较好敲低效果。
28.此外，通过验证，使用本技术的shrna载体，可以精确控制shrna的表达时间和水平。在无四环素及其类似物时，目的基因的表达水平比较低；而在加入四环素及其类似物时，目的基因的表达水平会增高；这样，可以根据实验需要来调节shrna的表达。
29.使用本技术的shrna载体，可以制备shrna目的基因干扰质粒。
30.本技术设计了shrna目的基因干扰质粒的制备方法，，包括以下步骤：s1、将shrna载体酶切，得到线性化shrna载体；s2、将目的基因连入步骤s1制得的线性化shrna载体上；s3、将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞并培养，对长出的单克隆菌落测序鉴定，挑选比对正确的克隆，制得shrna目的基因干扰质粒。
31.本技术的shrna目的基因干扰质粒的制备方法中，载体的酶切选择本技术特异性启动子的序列的酶切位点。
32.为了确保目的基因的准确连接，本技术需要连入的目的基因为双链dna时，可以根据目的基因的双链dna，设计一对单链的dna oligo，然后结合特异性启动子的酶切位点，对单链的dna oligo的序列进行调整，最后通过退火配对合成双链dna oligo。上述设计，可以采用现有的软件进行，目的基因已知的情况下，软件可以生成有限对的单链的dna oligo，通过实验筛选出最优的一对单链dna oligo即可。
33.本技术质粒的克隆制备则完全属于现有技术，可以采用现有的任意质粒克隆制备方法进行。而连接可以采用现有的任何dna连接方法进行，如常见的t4连接酶连接。
34.实施例1本实施例以nsun2作为目的基因，使用本技术的shrna载体，构建了本技术的shrna目的基因干扰质粒。
35.通过本实施例，验证本技术的shrna载体，构建本技术的shrna目的基因干扰质粒的便捷性和准确性。
36.本实施例的含nsun2目的基因的shrna质粒的构建，采用以下步骤：1、制备线性化载体构建本技术的shrna载体，通过限制性内切酶agei和ecori，使载体线性化，得到线性化载体片段，具体酶切体系见下表1。
37.表1酶切体系表组分体积(μl)shrna载体5μg10*buffer5μlecori2μlagei2μlddh2o补足50μl2、制备目的基因
1)单链dna oligo的设计和合成根据目的基因nsun2的序列，以及本技术载体的酶切位点设计，设计一对含有与载体相同酶切位点粘性末端的含干扰序列的单链dna oligo，具体设计出的序列见下表2。
38.表2含干扰序列的单链dna oligo表通过单链dna合成的方式，合成上述序列，备用。
39.2)双链dna oligo的制备用无菌的te buffer稀释单链dna oligo至终浓度为100μm。分别吸取10μl的h-nsun2-t和h-nsun2-b，混合并吹打均匀，放入pcr管内进行退火。详细退火程序见下表3。
40.表3退火程序表温度时间95℃30s72℃2min37℃2min25℃2min退火结束后，将制得的退火产物置于冰上放置几分钟，备用。
41.3、制备连接产物将线性化载体片段和得到的退火产物，于25℃水浴中孵育30min，得到连接产物。具体采用的连接体系见下表4。
42.表4连接体系表
4、质粒制备将连接产物转化至感受态细胞stbl3中，涂含有50mg/l氨苄青霉素的lb培养基平皿，置于37℃培养箱中培养12～16小时，单个菌落即可出现，即可分离抗氨苄青霉素的转化体。
43.从上述菌落中挑取几个单菌落扩大培养，然后使用天根的无内毒素质粒小量制备试剂盒(目录号：gk2007-20)进行质粒小提，得到shrna目的基因干扰质粒。
44.5、鉴定质粒选取提好的质粒，进行双酶切，而后测序验证基因的插入位点、方向和序列是否完全正确。
45.经测序验证，本实施例制备的shrna目的基因干扰质粒，测序鉴定完全正确，即本实施例准确的构建出了带有nsun2目的基因的shrna目的基因干扰质粒。本实施例经测序鉴定后的质粒图谱如图1所示。
46.通过本实施例可以看出，使用本技术设计的shrna载体，仅通过连接目的基因，而后转化至感受态细胞stbl3中，诱导培养，最后提取质粒，即可制备出本技术的含有目的基因的shrna目的基因干扰质粒。制备过程极为便捷，而且制备出的质粒经测序鉴定，序列完全正确。
47.而通过实施例1的后续鉴定结果还可以看出，只要采用本技术设计的shrna载体，正确连接目的基因，即可制备出本技术的shrna目的基因干扰质粒。
48.使用本技术的shrna目的基因干扰质粒，可以制备慢病毒产品，进而制备带有目的基因的细胞产品。
49.实施例2本实施例以实施例1制得的带有nsun2目的基因的shrna目的基因干扰质粒，制备慢病毒产品。
50.通过本实施例，可以验证本技术的shrna目的基因干扰质粒的用途，以及制备慢病毒的便捷性和准确性。
51.本实施例的慢病毒鉴定细胞采用293t贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为dmem(含10％ fbs)。本技术采用lenti-hg mix慢病毒包装试剂盒。
52.本实施例的慢病毒的制备前准备采用以下步骤：转染前一天，将处于对数生长期的细胞以2
×
106每皿的比例传代到10cm培养皿中，当细胞长到70％～80％时准备转染；转染前1～2h，将需要转染的细胞换新鲜的培养基，每皿12ml。
53.1、转染准备将293t贴壁依赖型成上皮样细胞，用生长培养基培养保持。
54.转染前一天，将处于对数生长期的细胞以2
×
106每皿的比例传代到10cm培养皿中，用生长培养基培养，当细胞长到80％时准备转染；转染前1h，将需要转染的细胞，更换新
鲜培养基，新鲜培养基每皿添加12ml。
55.2、转染取无菌的1.5ml的ep管，配置转染试剂加入管中混匀，具体配比见下表5。
56.表5转染试剂配比表组分用量质粒10μgdmem1mllenti-hg mix的病毒液10μlhg transgene reagent60μl将混匀后的转染试剂，室温放置20min后，按照慢病毒包装试剂盒说明书记载的转染用量，均匀滴加到更换过新鲜培养基的含有转染细胞的培养皿中，然后置于co2培养箱中培养。
57.转染10h后，均匀滴加100
×
enhancing buffer(120μl/dish)促进转染。转染18h后，吸掉全部细胞培养液，然后加15ml的新鲜生长培养基继续培养。
58.3、病毒收集换新鲜生长培养基48h后，吸取细胞上清液置于50ml离心管，4℃，4500g离心5min。
59.离心后的上清液，用0.45μm滤膜过滤后，转移到新的50ml离心管中。将收集的滤液分批转移到浓缩装置中，4℃，4500g，离心10min。
60.将离心后的混合液，弃下层的液体于盛有消毒液的废液杯中，取上层液体4℃，4500g，离心20min。
61.取离心后的上层液体，制得转染后的慢病毒浓缩液。
62.4、对制得的慢病毒液进行鉴定检测1)lentivirus滴度测定取细胞胰酶消化处于对数生长期的293t细胞，按照2
×
105每孔的比例，接种至12孔板，37℃培养过夜。第二天感染前，确保细胞长至20～30％％的融合密度。
63.取制得的转染后的慢病毒浓缩液，用不含血清的dmem细胞培养基进行梯度稀释，配置稀释液。
64.稀释液的配置方式如下：1号稀释液采用10μl病毒液+90μl病毒稀释用培养基；2号稀释液采用10μl的1号稀释液+90μl病毒稀释用培养基；以此类推。
65.从12孔板挑选细胞，在选取的细胞所在的孔中，轻轻混匀各管慢病毒稀释液，取90μl加入每孔细胞中，放入37℃的细胞培养箱中过夜培养；已知滴度的对照病毒加入1～4号稀释液，待测样品加入1号和2号稀释液。而后进行滴度检测，所得结果见表6。
66.表6滴度检测结果表慢病毒名称滴度(tu/ml)h-nsun2-shrna32
×
107ez-tet-plko-puro2
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107从表6的检测结果可以看出，本技术制备的慢病毒，滴度与对照病毒处于同一水平。
67.2)realtime pcr检测
检测选用lentivirus滴度测定培养的细胞。
68.lentivirus滴度测定感染细胞后的第五天，观察细胞状态及荧光情况，12孔板中细胞状态良好(无荧光污染)、细胞密度高于80％时，抽提rna准备做realtime pcr。
69.提取rna：12孔板细胞每孔加入500μl的trizol液混匀，室温裂解；5min后，将12孔板内的细胞分别移至12支离心管中。12支离心管中各加入100μl氯仿，盖紧离心管，反复颠倒混匀15s，而后4℃，12000g，离心10min。取上清于新离心管中，每管中各加300μl异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min，而后4℃，12000g，离心10min。弃上清，每管中加入500μl的80％的酒精(depc稀释)轻轻洗涤沉淀，而后4℃，12000g，离心10min。弃上清，室温干燥5～10min后，溶于50～100μl的depc液中，完成rna提取。
70.反转录与检测：取灭菌的无rna酶的eppendorf管，配液进行逆转录，具体配液配比见下表7，逆转录程序见下表8。
71.表7逆转录配液表组分体积rna500ng2
×
+5μlrnase free ddh2oto 10μl表8逆转录程序表温度时间25℃5min42℃30min85℃5min经表8的处理程序，得到逆转录mix。
72.realtime pcr测定：本实施例realtime pcr的检测，采用特定的检测引物和内参引物，具体检测引物序列见下表9，内参引物序列见下表10。
73.表8检测引物表名称引物序列wpre-fcgctatgtggatacgctgctttawpre-rgcaaccaggatttatacaaggagga表10内参引物表名称引物序列gapdh-fgtctcctctgacttcaacagcggapdh-raccaccctgttgctgtagccaa采用上述引物，配置pcr反应体系，具体pcr体系的配比见下表11。而后进行pcr反应，具体pcr反应的条件见下表12。
74.表11 pcr体系组分体积
超纯水7.2μl2
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sybr mix10μl上游引物(10μm)0.4μl下游引物(10μm)0.4μl模板2μl总体系20μl表12 pcr反应条件pcr反应条件经检测，提取的rna中含有目的基因nsun2。
75.通过实施例2的实验，可以看出，使用本技术的shrna载体，正确的连接目的基因，制备出本技术的shrna目的基因干扰质粒，可以通过转染就实现准确将目的基因递送至病毒，进而制得慢病毒产品。
76.通过实施例2的实验，还可以看出，采用本技术的质粒，制备出携带目的基因nsun2的慢病毒，能够通过慢病毒对细胞的感染，准确实现目的基因nsun2向细胞的递送。
77.而上述目的的实现，能够为药筛细胞系的制备、治疗药物的研发、生物制剂的研发等医药方向，提供优异的产品工具。
78.本技术除实施例2外，也可以采用其它品类的慢病毒包装试剂盒制备慢病毒产品，具体制备可以根据试剂盒说明书进行。
79.实施例3本实施例构建的目的基因干扰细胞系为人肝癌细胞hepg2细胞系。
80.本实施例选用的病毒为实施例2制备的慢病毒，对照病毒使用实施例2滴度检测使用的对照病毒。药筛药物选择puromycin。
81.1、人肝癌细胞hepg2细胞系构建感染前一天，将人肝癌细胞hepg2细胞以5
×
104每孔的比例接种于24孔板中培养备用。感染前，将冻存的病毒原液取出后冰浴融化，用500μl生长培养基按moi＝40稀释慢病毒原液和对照病毒原液，配置成慢病毒培养基和对照病毒培养基。
82.将24孔板中的细胞按照慢病毒感染和对照病毒感染分组。吸除24孔板中原有的培养基，向慢病毒感染组和对照病毒感染组的细胞，以每孔添加300μl的添加量，添加慢病毒培养基和对照病毒培养基，对细胞进行病毒感染。
83.感染16h后，将孔板内的慢病毒培养基和对照病毒培养基，全量更换成500μl生长培养基。感染后第三天，再次更换培养基，更换为新鲜的生长培养基。
84.感染后第五天，选择合适的慢病毒感染组细胞进行药筛(puromycin全致死浓度2μg/ml，维持浓度1μg/ml)。药筛两轮(1轮2天，由抗生素预实验决定)，细胞即可稳定。
85.稳定后，使用含有10％ fbs、1％ pen/strep、1μg/ml puromycin的dmem培养基维持细胞，得到稳转株细胞。
86.对照病毒组的细胞，同样选择合适的细胞，使用dmem培养基维持细胞，得到对照组细胞。
87.2、细胞系的realtime pcr检测1)细胞样品总rna提取将稳转株及对照细胞以1
×
106每孔的比例接种于6孔板中，铺板后24h，待细胞长到1.5
×
106每孔，加入1μg/ml多西环素(dox)诱导。诱导72h后收1
×
106的细胞沉淀进行总rna提取。
88.使用cell/tissue total rna kit细胞/组织总rna提取试剂盒(来源于yeasen)对细胞样品进行总rna的提取。
89.将细胞沉淀加入350μl裂解液lb*，用移液器反复吹打混匀后，加到dna清除/rna吸附通用柱上(柱子放在2ml收集管内)，13000rpm的转速，离心1min，收集含有rna的滤液。
90.加入等体积的结合液bd*，立即轻柔吹打混匀转移到新的dna清除/rna吸附通用柱中，13000rpm的转速，离心30s，弃掉滤液。
91.向dna清除/rna吸附通用柱中加入700μl去蛋白液，室温静置30s，13000rpm的转速，离心30s，弃掉滤液，将dna清除/rna吸附通用柱重新放回2ml收集管中。
92.向dna清除/rna吸附通用柱中加入500μl漂洗液w*，13000rpm的转速，离心30s，弃掉滤液，重复清洗两次。
93.将dna清除/rna吸附通用柱放入新的1.5ml的rnase-free离心管中，在膜中央加入50μl的rnase-free h2o，室温放置1min，然后13000rpm的转速，离心1min，收集滤液，即为提取得到的总rna溶液。
94.2)cdna反转录使用ii 1st strand cdna synthesis supermix(来源于yeasen)进行反转录。
95.取灭菌的无rna酶的eppendorf管，配液进行反转录，具体配液配比见下表13，逆转录程序见下表14。
96.表13逆转录配液表表14逆转录程序表温度时间25℃5min42℃30min85℃5min
经表14的处理程序，得到逆转录mix 1。
97.3)realtime pcr测定本实施例realtime pcr的检测，采用特定的检测引物和内参引物，具体检测引物序列见下表15，内参引物序列见下表16。
98.表15检测引物表primer名称引物序列5’to 3’h-nsun2-1-qfgcagtggagacggcactatgh-nsun2-1-qrcaatccgcagctgtaagcca表16内参引物表primer名称引物序列5’to 3’h-gapdh-fgtctcctctgacttcaacagcgh-gapdh-raccaccctgttgctgtagccaa采用上述引物，配置pcr反应体系，具体pcr体系的配比见下表17。而后进行pcr反应，具体pcr反应的条件见下表18。
99.表17 pcr体系表18 pcr反应条件pcr反应条件具体检测结果见下表19和表20，以及图2。
100.表19定量检测结果表
表20表达效果检测表 shrna ncshrna3shrna3 1xaverageδct7.607.769.77δctse0.160.150.05δδct0.000.162.17fold change1(0.9～1.11)0.90.22通过表19和表20的数据，以及图2可以看出，本实施例制得的人肝癌细胞hepg2细胞系，通过感染本技术实施例2制得的慢病毒，药筛稳定后，使用类似物多西环素(dox)诱导，诱导72h后，基因水平有较好的干扰效果。
101.以上均为本技术的较佳实施例，并非依此限制本技术的保护范围，故:凡依本技术的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.一种shrna载体，其特征在于，所述shrna载体含有特异性启动子，所述启动子的序列如seq id no.1所示。2.一种shrna目的基因干扰质粒，其特征在于，所述shrna目的基因干扰质粒包括如权利要求1所述的shrna载体，以及目的基因。3.根据权利要求2所述的shrna目的基因干扰质粒，其特征在于，所述目的基因由含干扰序列的一对单链dna oligo，通过退火配对生成；所述含干扰序列的一对单链dna oligo的序列如seq id no.2和seq id no.3所示。4.一种如权利要求2所述的shrna目的基因干扰质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、将shrna载体酶切，得到线性化shrna载体；s2、将目的基因连入步骤s1制得的线性化shrna载体上；s3、将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞并培养，对长出的单克隆菌落测序鉴定，挑选比对正确的克隆，制得shrna目的基因干扰质粒。5.根据权利要求4所述的shrna目的基因干扰质粒的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中，所述目的基因采用以下步骤制备：首先，合成目的基因的含干扰序列的一对单链dna oligo，序列如seq id no.2和seq id no.3所示；然后，通过退火配对，产生双链dna oligo。6.根据权利要求5所述的shrna目的基因干扰质粒的制备方法，其特征在于，所述步骤s3的具体操作步骤如下：s3-1、将连接产物转化至感受态细胞中；s3-2、在含有药物的培养条件下，置于培养箱中诱导培养，分离抗药物干扰的转化体；s3-3、挑取单菌落扩大培养，提取质粒；s3-4、对提取的质粒进行测序鉴定，挑选目的基因插入位点、方向和序列完全正确的质粒，得到shrna目的基因干扰质粒。7.一种如权利要求2所述的shrna目的基因干扰质粒在制备目的基因干扰病毒产品和目的基因干扰细胞产品领域的应用。8.一种目的基因干扰慢病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s4、选择转染细胞，将处于对数生长期的细胞传代到培养皿中，待细胞长到70%~80%，更换培养基并准备转染；s5、选用慢病毒试剂盒，将试剂盒中的慢病毒、慢病毒试剂和权利要求3所述的shrna目的基因干扰质粒混匀、静置，滴加至步骤s4的含待转染细胞培养皿中，置于co2培养箱中培养，培养过程中滴加促转染试剂，更换新鲜培养基；s6、将步骤s5经过培养的细胞，取细胞上清，经离心、过滤和浓缩，弃下层废液后，得到病毒浓缩液；s7、将步骤s6制得的病毒浓缩液经取样检测鉴定，准确带有目的基因的病毒，即为目的基因干扰慢病毒。9.根据权利要求8所述的目的基因干扰慢病毒的制备方法，其特征在于，所述步骤s7中，所述rna鉴定采用实时荧光定量pcr检测方法；所述检测采用的目的基因检测引物包括wpre-f和wpre-r，所述wpre-f和wpre-r的序列分别如seq id no.4和seq id no.5所示；所述检测采用的内参基因检测用引物包括gapdh-f和gapdh-r，所述gapdh-f和gapdh-r的序列
分别如seq id no.6和seq id no.7所示。10.一种目的基因干扰细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s8、选用哺乳动物细胞，接种于多孔板中；s9、将权利要求9所述的慢病毒稀释成病毒稀释液，与细胞培养基配置成含病毒稀释液的培养基；s10、将步骤s9的含病毒稀释液的培养基加入到步骤s8的多孔板中，感染16h后，将含有慢病毒的培养基全量更换为细胞培养基继续培养；s11、从步骤s10培养的细胞中挑选真核抗性细胞，使用药物药筛，获得稳转株细胞，用含有药筛药物的完全培养基维持细胞；s12、将步骤s11制得的稳转株细胞经rna提取和鉴定确认，得到目的基因干扰细胞系。11.根据权利要求10所述的目的基因干扰细胞系的制备方法，其特征在于，所述步骤s12中，所述rna鉴定采用实时荧光定量pcr检测方法；所述检测采用的目的基因检测引物包括h-nsun2-1-qf和h-nsun2-1-qr，所述h-nsun2-1-qf和h-nsun2-1-qr的序列分别如seq id no.8和seq id no.9所示；所述检测采用的内参基因检测用引物包括h-gapdh-f和h-gapdh-r，所述h-gapdh-f和h-gapdh-r的序列分别如seq id no.10和seq id no.11所示。

技术总结
本申请公开了一种shRNA目的基因干扰质粒、其构建方法及应用。一方面，本申请提供一种shRNA载体，所述shRNA载体含有特异性启动子，所述启动子的序列如SEQ ID NO.1所示。第二方面，本申请还公开了含上述shRNA载体的shRNA目的基因干扰质粒及其制备方法。第三方面，本申请还提供了上述shRNA目的基因干扰质粒在制备目的基因干扰病毒产品和目的基因干扰细胞产品领域的应用。本申请成本相对低廉，能够灵活和可控的实现shRNA的表达。和可控的实现shRNA的表达。和可控的实现shRNA的表达。


技术研发人员：杨露露
受保护的技术使用者：吉满生物科技（上海）有限公司
技术研发日：2023.08.29
技术公布日：2023/10/15