一种构建毛囊类器官的方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种构建毛囊类器官的方法。


背景技术：

2.中国受脱发问题困扰的人数约有2亿，且呈现出年轻化的趋势，中青年已经成为“脱发大军”的主力，脱发的发病率较20年前增长了10倍以上。脱发对容貌造成显著的损害，常给患者带来了一定的心理负担，有强烈的治疗需求。然而，治疗脱发的方法非常有限，迄今为止，获fda批准治疗的仅有米诺地尔和非那雄胺，但是药物治疗效果都不尽如人意，且治疗起效时间长，停药后症状仍反复。因此，诱导毛囊再生的新型药物的开发伴随着巨大的市场需求，其依赖于可进行安全性和功效性检测的临床前研究模型，而常用的小鼠模型与人体生物学存在本质上的差异，导致研究结果的临床转化存在一定的困难，因此亟需开发出接近人类正常皮肤生理环境下含毛囊结构的皮肤模型，广泛投入于药物研发过程中的疗效检测研究和再生医学研究。
3.类器官是指具有多分化潜能的干细胞在体外三维培养条件下，分裂分化形成类似器官的生物结构，具有自我更新和自我组装的能力，可重现对应器官的功能，提供一个高度相似的生理系统。作为新型疾病模型的类器官具有明显优势，与二维培养相比，类器官不仅可以长期传代培养，而且具有稳定的表型和遗传学特征，可进行基因组测序和表达谱分析；与动物模型相比，具有可操作性高、时效性经济性强、伦理风险低的特点。国内外学者已利用类器官技术培养出多种类器官模型广泛用于研究组织和肿瘤的发生发展、药物疗效研究、个体化治疗研究和再生医学研究。因此，类器官技术在培养皮肤模型领域具有较大的潜力，成为用于毛囊结构分化的最佳选择。
4.近十年，运用类器官技术培养皮肤和毛囊类器官模型的研究取得了一定的积累。研究者将新生小鼠表皮和真皮分别消化培养成单细胞，或直接混合移植，或整合成球状细胞团培养后再移植至裸鼠表面，均可见裸鼠皮肤表面的毛发再生，然而研究停滞在鼠类阶段。2020年，lee等通过诱导人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞，于培养3个月后分化出含表皮层、真皮层和毛囊结构的类器官，移植至裸鼠可见5mm左右毛发。运用人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞分别存在着伦理问题和癌变概率，且目前该分化方法周期长、效率低，移植至裸鼠表面的毛囊结构较小。在人体毛发再生调控的过程中，毛囊干细胞起着至关重要的作用，其具有高度自我更新和分化能力，正常激活后不断分裂分化生成毛发，因此毛囊干细胞有望成为毛囊类器官分化的最优种子细胞。
5.中国专利cn201911171516.1公开了一种体外形成早期微毛囊的培养方法及其应用。所述培养方法包括：将真皮祖细胞与表皮干细胞混合，使用培养基悬浮培养，形成真皮-表皮聚集物，收集培养后的毛囊样结构即为培养的毛囊样微器官。该专利的培养细胞为头皮真皮组细胞和包皮表皮干细胞，细胞来源较为复杂，若考虑到自源性毛囊再生应用的转化，该技术不具备普适性。
6.中国专利cn202110982838.5公开一种雄激素性脱发细胞模型的构建方法，包括以
下步骤：取雄激素性脱发患者前额部的毛囊毛球部，分离毛囊毛球部的毛乳头并进行培养处理；取雄激素性脱发患者枕部的隆突区，分离隆突区的外根鞘细胞并进行培养处理；将培养处理后获得的毛乳头细胞进行3d培养，使毛乳头细胞聚集形成毛乳头细胞球；将毛乳头细胞球接种于transwell培养皿的上室，将外根鞘细胞接种于预包被的transwell培养皿的下室，加入二氢睾酮，获得雄激素性脱发的细胞模型。该专利在transwell培养皿的上室和下室分别接种毛乳头细胞球和外根鞘细胞，培养体系较为复杂，操作繁琐。


技术实现要素：

7.本发明的目的就是为了提供一种构建毛囊类器官的方法，根据毛发再生的生理机制，运用毛囊干细胞和毛囊成纤维细胞定向分化毛囊类器官，分化出的毛囊类器官具有与人类正常原代毛囊结构具有相似的细胞特性和结构，并可进行冻存和复苏，该方法耗时短、分化效率高，为将来在药物疗效预测、毛囊调控研究、再生医学研究等方面的应用奠定了基础。
8.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
9.一种构建毛囊类器官的方法，利用人枕部毛囊获得毛囊干细胞和毛囊成纤维细胞，并将毛囊干细胞（hfsc）和毛囊成纤维细胞（hffb）制备成单细胞悬液，倒置培养，再加入类器官培养液后形成毛囊类器官。
10.进一步地，所述毛囊类器官具有类似毛干和毛球的毛囊样结构，而非单纯的3d聚集体。
11.进一步地，所述构建毛囊类器官的方法的具体步骤如下：s1、取患者枕部毛囊，分离毛囊干细胞（hfsc）和毛囊成纤维细胞（hffb），并进行培养处理；s2、将经步骤s1中培养处理后获得的毛囊干细胞（hfsc）制备成hfsc单细胞悬液，接种至96孔板中倒置培养，加入类器官培养液后形成hfsco（hfsc分化构建的毛囊类器官）；s3、将经步骤s1中培养处理后获得的毛囊成纤维细胞（hffb）制备成hffb单细胞悬液，接种至96孔板中倒置培养，加入类器官培养液后形成hfscfbo（hffb分化构建的毛囊类器官）。
12.上述更进一步地，步骤s1中具体步骤如下：步骤s1-1、取患者枕部毛囊并进行冲洗；步骤s1-2、将冲洗后的毛囊转移至分散酶中，孵育一定时间后中止；步骤s1-3、将孵育完成的毛囊分离成毛囊碎片，加入消化酶消化一定时间后中止；步骤s1-4、将消化完成的毛囊碎片加入hfsc或hffb培养液进行重悬，制成hfsc细胞悬液或hffb细胞悬液，接种于培养皿中静置培养；步骤s1-5、当细胞生长超过培养皿面积的80％时，采用消化酶消化获得单个hfsc或hffb悬浮细胞，并以1:3的比例转移到新的培养皿中，进行传代。
13.上述更进一步地，步骤s1-1中，用杜氏磷酸盐缓冲溶液（dpbs）清洗毛囊3次。
14.上述更进一步地，步骤s1-2中，将冲洗后的毛囊转移至hfsc培养液或hffb培养液稀释的分散酶中，放置于培养箱内孵育，孵育完成后加入等体积的hfsc培养液或hffb培养液中止消化。
15.上述更进一步地，所述分散酶为dispase ii，所述dispase ii的浓度为2u/ml。
16.上述更进一步地，培养箱孵育温度为37
°
c，孵育时间为2-4小时，孵育环境为95%的空气和5%的co2。
17.上述更进一步地，所述hfsc培养液由100ml km-d培养基（sciencell#2111）、10-100ul n-2 supplement (100x)、10-100ul b-27 supplement (50x)、1-200ng/ml fgf-2、1-100ng/ml egf和1-100 μg/ml normocin配制而成。
18.上述更进一步地，所述hffb培养液采用fibroblast medium培养液（sciencell #2301）。
19.上述更进一步地，步骤s1-3中，将孵育完成的毛囊分离成1-2mm的毛囊碎片，离心弃上清，加入1ml tryple
™ꢀ
express enzyme消化酶，将毛囊碎片吹散，使其充分接触消化酶，放置于培养箱中消化8~12分钟，加入4ml培养液中止消化；再次加入1ml tryple
™ꢀ
express enzyme，放置于培养箱中消化8~12分钟，加入4ml培养液中止消化；离心弃上清，得到消化完成的毛囊碎片。
20.上述更进一步地，步骤s1-4中，将hfsc细胞悬液接种至提前包被的培养皿中，hffb细胞悬液，接种至普通培养皿中，用“十”字法将细胞悬液在皿底铺平，放置于37
°
c、5%co2条件下的培养箱培养。
21.上述更进一步地，所述提前包被的培养皿的具体方法为：将10cm培养皿提前4小时在37
°
c下包被1-20μg/ml iv型胶原蛋白。
22.上述更进一步地，步骤s1-5中，当细胞生长超过培养皿面积的80％时，采用tryple
™ꢀ
express enzyme消化酶消化获得单个hfsc或hffb悬浮细胞，加入4倍体积的dpbs中止消化，离心弃上清，再加入hfsc培养液或hffb培养液重悬细胞，并以1:3的比例转移到新的培养皿中，对hfsc或hffb进行接种培养。
23.上述更进一步地，步骤s2中具体步骤如下：取代数为p1-p3的hfsc，在其进入对数期增长时，用tryple
™ꢀ
express enzyme将其消化，过滤后制备成hfsc单细胞悬液，用类器官培养液重悬，将hfsc单细胞悬液接种至96孔板中，离心后倒置培养。
24.上述更进一步地，培养箱孵育温度为37
°
c，孵育时间为2-4小时，孵育环境为95%的空气和5%的co2。
25.上述更进一步地，所述类器官培养液为含1%基质胶的类器官培养液。
26.上述更进一步地，步骤s3中具体步骤如下：取代数为p1-p3的hffb，在其进入对数期增长时，用tryple
™ꢀ
express enzyme将其消化，过滤后制备成hffb单细胞悬液，用类器官培养液重悬，将hffb单细胞悬液接种至96孔板中，离心后倒置培养。
27.上述更进一步地，培养箱孵育温度为37
°
c，孵育时间为2-4小时，孵育环境为95%的空气和5%的co2。
28.上述更进一步地，所述类器官培养液为含1%基质胶的类器官培养液。
29.与现有技术相比，本发明的优点如下：1、根据毛发再生的生理机制，本发明运用毛囊干细胞和毛囊成纤维细胞定向分化毛囊类器官，分化出的毛囊类器官具有与人类正常原代毛囊结构具有相似的细胞特性和结
构，并可进行冻存和复苏，该方法耗时短、分化效率高，为将来在药物疗效预测、毛囊调控研究、再生医学研究等方面的应用奠定了基础。
30.2、本发明为首次单独利用人毛囊隆突部位来源的毛囊干细胞作为“种子细胞”进行诱导分化，并联合成毛囊纤维细胞成功构建具有毛囊结构的毛囊类器官模型，通过h&e染色和免疫荧光染色观察到了多层分化的结构以及毛囊相关角蛋白的高表达。
31.3、本发明诱导分化扩增倍数较大，1个毛囊单位约可诱导出数百个毛囊类器官。
32.4、本发明与中国专利cn201911171516.1相比，两者的细胞来源不同，本发明选用头皮毛囊干细胞为主体，其具备组织再生的独特特性，在皮肤、骨骼、心血管和神经等其他组织器官中具有再生医学用途，本发明利用毛囊干细胞、成纤维细胞作为种子细胞，通过改良分化培养液的方法成功诱导分化出毛囊类器官，具有类似毛干和毛球的毛囊样结构，而非单纯的3d聚集体。
33.5、本发明与中国专利cn202110982838.5相比，两者的培养条件完全不同，将毛囊干细胞在低黏附96孔板进行悬浮培养，在培养的5-7天可分化为具有毛干和毛球的毛囊样结构，模型构建较之简便且模型数量大，为潜在的药物筛选精准医学研究模型。
附图说明
34.图1为从枕部毛囊中提取的毛囊干细胞在p0、p1、p2和p3的形态示意图；图2为不同批次hfsc的rt-qpcr检测结果示意图，其中，ekc为对照组细胞，**代表p《0.01；图3为hfsc和ekc的免疫荧光染色表达示意图(bar = 20μm)；图4为从枕部毛囊中提取的成纤维细胞在p0、p1、p2和p3的形态示意图；图5为不同批次hffb的rt-qpcr检测结果示意图，其中，dfb为对照组细胞；图6为hffb和dfb的免疫荧光染色表达示意图(bar = 20μm)；图7为倒置显微镜下hfsco毛囊类器官在不同培养天数下的形态（倍数：100x）；图8为倒置显微镜下hfscfbo毛囊类器官在不同培养天数下的形态（倍数：40x）；图9为hfsco和hfscfbo毛囊类器官的形态学结构与相近生长期的正常毛囊、hfsc分化来源的hfsco毛囊类器官以及hfsc和hffb共同分化来源的hfscfbo毛囊类器官的球部和尾端的h&e染色示意图（倍数：200x）；图10为免疫荧光染色显示hfsco和hfscfbo中的干细胞和增殖细胞相关标志物的表达培养第7天的hfsco和hfscfbo的krt15、cd200、lhx2、p-cadherin、ki-67的荧光表达情况示意图，其中，每组抗体染色的上行为石蜡切片组织的免疫荧光染色，下行为整体组织透化的免疫荧光染色，红色为alexa fluor 647荧光，绿色为alexa fluor 488荧光，黄色为alexa fluor 555荧光，蓝色为hoechst荧光(bar = 20μm)；图11为免疫荧光染色显示hfsco和hfscfbo中的毛囊特征性结构相关标志物的表达培养第7天的hfsco和hfscfbo的asma、sox2、krt5、vimentin、krt6、krt16、krt81、trp1和pmel的荧光表达情况示意图，其中，红色为alexa fluor 647荧光，绿色为alexa fluor 488荧光，黄色为alexa fluor 555荧光，蓝色为代表细胞核的hoechst荧光 (bar = 20μm) 。
具体实施方式
35.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
36.一种构建毛囊类器官的方法，利用人枕部毛囊获得毛囊干细胞和毛囊成纤维细胞，并将毛囊干细胞（hfsc）和毛囊成纤维细胞（hffb）制备成单细胞悬液，倒置培养，再加入类器官培养液后形成毛囊类器官。
37.进一步地，所述构建毛囊类器官的方法的具体步骤如下：s1、取患者枕部毛囊，分离毛囊干细胞（hfsc）和毛囊成纤维细胞（hffb），并进行培养处理；s2、将经步骤s1中培养处理后获得的毛囊干细胞（hfsc）制备成hfsc单细胞悬液，接种至96孔板中倒置培养，加入类器官培养液后形成hfsco（hfsc分化构建的毛囊类器官）；s3、将经步骤s1中培养处理后获得的毛囊成纤维细胞（hffb）制备成hffb单细胞悬液，接种至96孔板中倒置培养，加入类器官培养液后形成hfscfbo（hffb分化构建的毛囊类器官）。
38.上述更进一步地，步骤s1中具体步骤如下：步骤s1-1、取患者枕部毛囊并进行冲洗；步骤s1-2、将冲洗后的毛囊转移至分散酶中，孵育一定时间后中止；步骤s1-3、将孵育完成的毛囊分离成毛囊碎片，加入消化酶消化一定时间后中止；步骤s1-4、将消化完成的毛囊碎片加入hfsc或hffb培养液进行重悬，制成hfsc细胞悬液或hffb细胞悬液，接种于培养皿中静置培养；步骤s1-5、当细胞生长超过培养皿面积的80％时，采用消化酶消化获得单个hfsc或hffb悬浮细胞，并以1:3的比例转移到新的培养皿中，进行传代。
39.上述更进一步地，步骤s1-1中，用杜氏磷酸盐缓冲溶液（dpbs）清洗毛囊3次。
40.上述更进一步地，步骤s1-2中，将冲洗后的毛囊转移至hfsc培养液或hffb培养液稀释的分散酶中，放置于培养箱内孵育，孵育完成后加入等体积的hfsc培养液或hffb培养液中止消化。
41.上述更进一步地，所述分散酶为dispase ii，所述dispase ii的浓度为2u/ml。
42.上述更进一步地，培养箱孵育温度为37
°
c，孵育时间为2-4小时，孵育环境为95%的空气和5%的co2。
43.上述更进一步地，所述hfsc培养液由100ml km-d培养基（sciencell#2111）、10-100ul n-2 supplement (100x)、10-100ul b-27 supplement (50x)、1-200ng/ml fgf-2、1-100ng/ml egf和1-100 μg/ml normocin配制而成。
44.上述更进一步地，所述hffb培养液采用fibroblast medium培养液（sciencell #2301）。
45.上述更进一步地，步骤s1-3中，将孵育完成的毛囊分离成1-2mm的毛囊碎片，离心弃上清，加入1ml tryple
™ꢀ
express enzyme消化酶，将毛囊碎片吹散，使其充分接触消化酶，放置于培养箱中消化8~12分钟，加入4ml培养液中止消化；再次加入1ml tryple
™ꢀ
express enzyme，放置于培养箱中消化8~12分钟，加入4ml培养液中止消化；离心弃上清，得
到消化完成的毛囊碎片。
46.上述更进一步地，步骤s1-4中，将hfsc细胞悬液接种至提前包被的培养皿中，hffb细胞悬液，接种至普通培养皿中，用“十”字法将细胞悬液在皿底铺平，放置于37
°
c、5%co2条件下的培养箱培养。
47.上述更进一步地，所述提前包被的培养皿的具体方法为：将10cm培养皿提前4小时在37
°
c下包被1-20μg/mliv型胶原蛋白。
48.上述更进一步地，步骤s1-5中，当细胞生长超过培养皿面积的80％时，采用tryple
™
expressenzyme消化酶消化获得单个hfsc或hffb悬浮细胞，加入4倍体积的dpbs中止消化，离心弃上清，再加入hfsc培养液或hffb培养液重悬细胞，并以1:3的比例转移到新的培养皿中，对hfsc或hffb进行接种培养。
49.上述更进一步地，步骤s2中具体步骤如下：取代数为p1-p3的hfsc，在其进入对数期增长时，用tryple
™
expressenzyme将其消化，过滤后制备成hfsc单细胞悬液，用类器官培养液重悬，将hfsc单细胞悬液接种至96孔板中，离心后倒置培养。
50.上述更进一步地，培养箱孵育温度为37
°
c，孵育时间为2-4小时，孵育环境为95%的空气和5%的co2。
51.上述更进一步地，所述类器官培养液为含1%基质胶的类器官培养液。
52.上述更进一步地，步骤s3中具体步骤如下：取代数为p1-p3的hffb，在其进入对数期增长时，用tryple
™
expressenzyme将其消化，过滤后制备成hffb单细胞悬液，用类器官培养液重悬，将hffb单细胞悬液接种至96孔板中，离心后倒置培养。
53.上述更进一步地，培养箱孵育温度为37
°
c，孵育时间为2-4小时，孵育环境为95%的空气和5%的co2。
54.上述更进一步地，所述类器官培养液为含1%基质胶的类器官培养液。
55.下面结合具体实施例来对上述各实施方式进行更详细的说明。
实施例
56.一种构建毛囊类器官的方法，包括培养液的配置、人毛囊干细胞的分离培养和传代、毛囊类器官的分化培养、细胞和类器官的冻存与复苏等。
57.1.培养液的配置（1）hairfollicleorganoiddifferentiationmedium(hfodm)：以49%advanceddmed/f12和49%neurobasalmedium为基础，加入1xglutamaxsupplement,0.5x无维生素a的b27supplement，0.5xn2supplement，0.1mm2-mercaptoehanol，10-100ng/mligf-1，10-100umchir99021（2）hfodm1%m：在hfodm的基础上，加入0.1-10%corning
®
matrigel
®
growthfactorreducedbasementmembranematrix。
58.（3）hfsc培养液：100mlkm-d培养基（sciencell#2111）、10-100uln-2supplement(100x)、10-100ulb-27supplement(50x)、1-200ng/mlfgf-2、1-100ng/mlegf和1-100μg/mlnormocin配制而成；
（3）hffb培养液：采用fibroblast medium培养液（sciencell #2301）。hfsc的培养需将10cm培养皿提前4小时37
°
c包被1-20μg/ml iv型胶原蛋白。
59.2. 人原代hfsc和hffb的分离培养、传代、冻存和复苏（1）毛囊准备：离体的枕部毛囊需在低温、湿润的环境中运输，为保持毛囊细胞的活性，需要尽快在生物安全柜内进行分离培养hfsc和hffb。
60.（2）人原代hfsc和hffb的分离培养：在6cm低黏附皿中用ddpbs清洗毛囊3次，用眼科镊将毛囊轻柔转移至使用hfsc培养液或hffb培养液稀释的2u/ml dispase ii中，放置于37
°
c、5%co2条件下的培养箱内孵育2-4小时。加入等体积的培养液中止消化，用手术刀片或眼科剪将毛囊分离成1-2mm的小节段，转移至15ml离心管内，在转速为500 g的离心机中离心5分钟。弃去上清，加入1ml tryple
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express enzyme消化酶，将毛囊碎片吹散，使其充分接触消化酶放置于培养箱消化10分钟。加入4ml培养液中止消化，静置片刻，待毛囊沉到离心管底部，将上清转移至新的离心管中。再次加入1ml tryple
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express enzyme，放置于培养箱消化10分钟。加入4ml培养液中止消化，静置片刻，将上述上清整合，离心机中500 g离心5分钟。弃掉上清，加入hfsc或hffb培养液进行重悬，将悬液经100目滤网过滤至新的离心管中，同时用针筒活塞面轻轻研磨毛囊组织以冲洗下更多的细胞，将细胞悬液在离心机中500 g离心5分钟。弃去上清，用hfsc或hffb培养液重悬细胞沉淀，将hfsc细胞悬液接种至提前包被的皿中，hffb细胞悬液接种至普通10cm培养皿中，用“十”字法将细胞悬液在皿底铺平。放置于37
°
c、5%co2条件下的培养箱培养。接种后的前两天不换液，随后每2天更换一次培养液。用倒置显微镜观察、拍照记录细胞。
61.（3）人原代hfsc和hffb的传代：2周后可对细胞克隆进行传代。当细胞扩增到密度约为80%左右，可进行下一次传代。hfsc的传代也需要接种在iv型胶原包被的皿中。使用tryple
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express enzyme消化获得单个悬浮细胞，加入4倍体积的dpbs中止消化，并将细胞悬液转移至离心管中，500 g离心5分钟。弃上清，用培养液重悬细胞，并用枪头吹打均匀，按照1:3的比例对hfsc或hffb进行接种培养。当细胞扩增数量较大时，可转移至t175培养瓶进行培养。用倒置显微镜观察、拍照记录不同代数的细胞。
62.3. 毛囊类器官的分化培养首先，使用hfsc分化构建毛囊类器官，以下将此体系构建的毛囊类器官称为hfsco (hair follicle stem cells derived organoids)；其次，本发明在此体系的基础上添加了hffb分化构建毛囊类器官，以下将此体系构建的毛囊类器官称为hfscfbo (hair follicle stem cells and hair follicle fibroblasts derived organoids)。
63.（1）hfsc向毛囊类器官的分化1）hfsco的构建：挑选代数为p1-p3的hfsc，在其进入对数期增长时，用tryple
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express enzyme将其消化，并用滤网过滤细胞团块，制备成单细胞悬液。随后，使用细胞计数板对活细胞进行计数，并记录下数据，用于扩增倍数的计算。用含1%基质胶的类器官培养液重悬，并吹打均匀，调整细胞数量，使用多通道移液枪以每孔2000个、体积为100μl的浓度将hfsc接种至低黏附圆形底96孔板中。将96孔板置于室温下110-300g离心5-15分钟，离心后，通过倒置显微镜可观察到3d球状聚集体。放置于37
°
c、5%co2培养箱中孵育。
64.2）hfsco的分化成熟：第2天，往孔内加入100μl类器官培养液。将其转移至37
°
c、5%co2培养箱中水平摇床上，转速为30转/分钟。随后，每2天更换一次培养液。通过倒置显微镜
观察并记录hfsco的形态学改变。
65.（2）hffb参与hfsc向毛囊类器官的分化1）hfscfbo的构建：同hfsc，挑选同一患者来源的代数为p1-p3的hffb，在其进入对数期增长时，用tryple
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express enzyme将其消化，制备成单细胞悬液。含1%基质胶的类器官培养液重悬，并吹打均匀。在hfsco已形成3d球状聚集体后，轻柔地加入与hfsc成比例数量的、体积为100μl的hffb细胞悬液，根据上述条件分别用离心（室温下110g、6分钟离心）和不离心（自然静置）的方式组装二者细胞，形成hfscfbo的3d球状聚集体。放置于37
°
c、5%co2培养箱中孵育。
66.2）hfscfbo的分化成熟：同样地，第2天进行培养液的补充，并将96孔培养板转移至37
°
c、5%co2培养箱中水平摇床上，每2天更换一次培养液。待到第7天，使用预冷的dpbs溶液清洗hfscfbo聚集物，洗掉残余的基质胶。将其转移到低黏附24孔培养板，给予毛囊类器官充足的生长空间，培养液总量为500μl，在37
°
c、5%co2培养箱中水平摇床上继续培养，每2天更换一次培养液。通过倒置显微镜观察并记录hfscfbo的形态学改变。
67.4. 毛囊类器官的冻存与复苏（1）冻存细胞：分化的得到的毛囊类器官能够使用专门的类器官冻存液保存，也可以使用含dmso的血清冻存。
68.（2）复苏细胞：原代培养的人毛囊干细胞可以使用dk-sfm继续培养，也可使用keratinocyte medium-defined (km-d)进行培养。稳定传代的人毛囊干细胞传代通常不需要包被培养皿，但是按照本发明之前提到的方法包被培养皿会增加细胞传代后的存活率。人毛囊干细胞一般可稳定传3-5代。毛囊类器官复苏后先使用hfodm1%m进行培养，5天后可更换培养液为hfodm。培养过程仍需使用低粘附的培养板和摇床。
69.实施例2 人毛囊干细胞的分离、扩增和鉴定利用本发明方法能够利用人枕部毛囊组织获得大量的高质量毛囊干细胞。从倒置显微镜下观察，从枕部毛囊中提取的毛囊干细胞在p0、p1、p2和p3的形态如图1所示，细胞起初形成细胞集落，可贴壁生长，呈多角细胞形态，并且可以稳定增殖、传代、冻存和复苏，不同代数细胞间的形态学未见明显差异。
70.取对数生长期时不同批次、不同代数间的hfsc，通过rt-qpcr进行hfsc相关基因的鉴定，对照组细胞为人原代表皮角质形成细胞(epidermal keratinocytes, ekc)。如图2所示，在hfsc中均检测到hfsc相关基因的表达情况，干性相关基因krt15、lhx2、sox9、lgr5和itga6的基因表达水平高于ekc的基因表达水平，说明本发明提取的原代hfsc具有干细胞特性，可用于毛囊类器官的诱导分化。
71.hfsc和ekc的免疫荧光染色表达示意图如图3所示，标志物为毛囊干细胞相关的特异性标志物(bar = 20μm)，hfsc高表达krt15、krt19、cd200、itga6、cd71、wif1、fst和p63等hfsc相关蛋白。这些蛋白在细胞的表达位置有所不同，在hfsc细胞膜或质膜囊泡内可以观察到细胞膜蛋白cd200；在hfsc细胞膜上或细胞骨架中可以观察到整合素itga6；在hfsc细胞膜上还可以观察到转铁蛋白受体cd71；在hfsc细胞质中可以观察到两种角蛋白krt15和krt19、wnt信号通路调节因子wif1、bmp信号通路调节因子fst；在hfsc细胞核中可以观察到转录因子p63。
72.实施例3 人毛囊成纤维细胞的分离、扩增和鉴定
利用本发明方法能够从人枕部毛囊组织获得大量的高质量毛囊成纤维细胞。从倒置显微镜下观察，从枕部毛囊中提取的成纤维细胞在p0、p1、p2和p3的形态示意图如图4所示，细胞起初形成细胞单克隆，可贴壁生长，伸展为梭形细胞形态，具有细长条形的胞突，胞质丰富，符合活化期成纤维细胞的形态。并且可以稳定增殖、传代、冻存和复苏，不同代数细胞间的形态学未见明显差异。
73.取对数生长期时不同批次、不同代数间的hffb，通过rt-qpcr进行成纤维细胞相关基因的鉴定，对照组细胞为人原代真皮成纤维细胞 (dermal fibroblasts, dfb)，未见明显统计学差异。如图5所示，在hffb中均检测到成纤维相关基因的表达情况，包括col1a1、fn1、fbn1、sox2、alpl、nog、plcg2和lef/tcf。其中，毛乳头成纤维细胞特异性相关基因sox2、alpl、nog、plcg2和lef/tcf的基因表达水平高于dfb的基因表达水平，说明本发明提取的原代hffb具有毛囊来源成纤维细胞的特性，可用于毛囊类器官的诱导分化。
74.为了明确提取得到的原代hfsc相关蛋白标志物的表达及其在细胞的位置，本发明对其进行了免疫荧光染色，标志物为毛囊干细胞相关的特异性标志物(bar = 20μm)，如图6所示，hffb高表达vimentin、asma、s100a4和col1a1成纤维细胞相关蛋白。这些蛋白在细胞的表达位置主要位于细胞质，其中，asma是一种肌动蛋白，与成纤维细胞向平滑肌细胞转化有关，常被用作于毛乳头成纤维细胞的细胞标志物。
75.实施例4 利用获得人毛囊干细胞和成纤维细胞构建人毛囊类器官利用本方法获得的毛囊干细胞可以构建hfsco (hair follicle stem cells derived organoids)；在此体系的基础上添加了hffb构建的毛囊类器官称为hfscfbo (hair follicle stem cells and hair follicle fibroblasts derived organoids)。
76.如图7所见，hfsco可自组装形成一个突出于球体的芽状结构，hfsc向毛囊类器官分化呈囊泡-毛球样两极化结构。随着培养时间的增加，该结构继续增殖、逐渐膨大，形成一个囊泡-毛球样两极化结构，即头端为较为透明的囊泡，尾端为较为实质的类毛球样结构。经过对不同批次hfsc向毛囊类器官分化的观察，在培养的第14天，类器官结构趋于稳定，第30天的结构与其相比，未见进一步增长。
77.如图8所示，hfscfbo在培养的5-7天左右，在倒置显微镜下可以观察到类器官球体的发芽，表现为杆状结构从球体伸出，尾端为类毛球结构。随着培养时间的增加，尾端的毛球样结构不断增长。
78.如图9所示，与正常毛囊相比，hfsco可见同心圆层状排列的细胞层，类似于毛囊横断面最外层的表皮层和毛鳞片，中心层近似于毛干，总体结构较为单薄。hfscfbo与正常毛囊相比，体积大小相近。其球部可观察到hffb形成的球状外层，近似于毛乳头结构；见在hffb的包裹下，hfsc呈偏心性分化，并向外伸出杆状结构；其尾端的杆状结构呈“c”型嗜碱性染色，与正常毛囊中的毛干皮质相类似。
79.如图10所示，培养第7天的hfsco和hfscfbo中均检测到干细胞和增殖相关标志物的阳性表达，包括毛囊干细胞相关标志物角蛋白15 (krt15, keratin15)、cd200，表皮干细胞相关标志物lim同源盒蛋白2 (lhx2, lim homeobox protein 2)，p-钙粘着蛋白(p-cadherin)，毛母质增殖细胞相关标志物ki-67。重要的是，在hfscfbo中的标志物表达具有结构特征性，毛囊干细胞相关标志物krt15和cd200均为隆突区特有的细胞标志物，而lhx2和p-cadherin阳性的表皮干细胞也位于隆突区，这些标志物在hfscfbo中其表达的位置可
以反映毛囊的结构。
80.同时，对培养第7天的hfsco和hfscfbo分别进行了毛囊特征性结构的相关标志物的鉴定。如图11所示，在hfscfbo中，可检测到毛囊特征性结构的相关标志物的表达，包括毛乳头相关标志物sry盒转录因子2 (sox2, sry-box transcription factor 2)、立毛肌相关标志物α平滑肌肌动蛋白 (asma, alpha smooth muscle actin)，真皮鞘相关标志物波形纤维蛋白 (vimentin)，基底层角质形成细胞相关标志物角蛋白5 (krt5, keratin 5)，髓质相关标志物角蛋白6 (krt6, keratin6)、角蛋白16 (krt16, keratin16)，皮质相关标志物角蛋白81 (krt81, keratin 81)，黑素细胞相关标志物酪氨酸酶相关蛋白1 (trp1,tyrosinase related protein 1)、黑素前体蛋白(pmel, pre-melanosome protein)；且相关标志物的表达具有毛囊特有的结构特征性分布情况，例如在突出于球体的芽状结构中呈半球形表达的检测到毛乳头相关标志物sox2，在球体检测到包裹状表达的真皮鞘相关标志物vimentin；而在hfsco中，未检测到真皮鞘相关标志物vimentin和黑素相关标志物trp1的表达。
81.上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种构建毛囊类器官的方法，其特征在于，利用人枕部毛囊获得毛囊干细胞和毛囊成纤维细胞，并将毛囊干细胞和毛囊成纤维细胞制备成单细胞悬液，倒置培养，再加入类器官培养液后形成毛囊类器官。2.根据权利要求1所述的一种构建毛囊类器官的方法，其特征在于，所述构建毛囊类器官的方法的具体步骤如下：s1、取患者枕部毛囊，分离毛囊干细胞和毛囊成纤维细胞，并进行培养处理；s2、将经步骤s1中培养处理后获得的毛囊干细胞制备成hfsc单细胞悬液，接种至96孔板中倒置培养，加入类器官培养液后形成hfsco；s3、将经步骤s1中培养处理后获得的毛囊成纤维细胞制备成hffb单细胞悬液，接种至96孔板中倒置培养，加入类器官培养液后形成hfscfbo。3.根据权利要求2所述的一种构建毛囊类器官的方法，其特征在于，步骤s1中具体步骤如下：步骤s1-1、取患者枕部毛囊并进行冲洗；步骤s1-2、将冲洗后的毛囊转移至分散酶中，孵育一定时间后中止；步骤s1-3、将孵育完成的毛囊分离成毛囊碎片，加入消化酶消化一定时间后中止；步骤s1-4、将消化完成的毛囊碎片加入hfsc或hffb培养液进行重悬，制成hfsc细胞悬液或hffb细胞悬液，接种于培养皿中静置培养；步骤s1-5、当细胞生长超过培养皿面积的80％时，采用消化酶消化获得单个hfsc或hffb悬浮细胞，并以1:3的比例转移到新的培养皿中，进行传代。4.根据权利要求3所述的一种构建毛囊类器官的方法，其特征在于，步骤s1-1中，用杜氏磷酸盐缓冲溶液清洗毛囊3次；步骤s1-2中，将冲洗后的毛囊转移至hfsc培养液或hffb培养液稀释的分散酶中，放置于培养箱内孵育，孵育完成后加入等体积的hfsc培养液或hffb培养液中止消化。5.根据权利要求4所述的一种构建毛囊类器官的方法，其特征在于，所述分散酶为dispase ii，所述dispase ii的浓度为2u/ml；培养箱孵育温度为37
°
c，孵育时间为2-4小时，孵育环境为95%的空气和5%的co2；所述hfsc培养液由100ml km-d培养基、10-100ul n-2 supplement (100x)、10-100ul b-27 supplement (50x)、1-200ng/ml fgf-2、1-100ng/ml egf和1-100 μg/ml normocin配制而成；所述hffb培养液采用fibroblast medium培养液。6.根据权利要求3所述的一种构建毛囊类器官的方法，其特征在于，步骤s1-3中，将孵育完成的毛囊分离成1-2mm的毛囊碎片，离心弃上清，加入1ml tryple
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express enzyme消化酶，将毛囊碎片吹散，使其充分接触消化酶，放置于培养箱中消化8~12分钟，加入4ml培养液中止消化；再次加入1ml tryple
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express enzyme，放置于培养箱中消化8~12分钟，加入4ml培养液中止消化；离心弃上清，得到消化完成的毛囊碎片。7.根据权利要求3所述的一种构建毛囊类器官的方法，其特征在于，步骤s1-4中，将hfsc细胞悬液接种至提前包被的培养皿中，hffb细胞悬液，接种至普通培养皿中，用“十”字法将细胞悬液在皿底铺平，放置于37
°
c、5%co2条件下的培养箱培养；所述提前包被的培养皿的具体方法为：将10cm培养皿提前4小时在37
°
c下包被1-20μg/
ml iv型胶原蛋白。8.根据权利要求3所述的一种构建毛囊类器官的方法，其特征在于，步骤s1-5中，当细胞生长超过培养皿面积的80％时，采用tryple
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express enzyme消化酶消化获得单个hfsc或hffb悬浮细胞，加入4倍体积的dpbs中止消化，离心弃上清，再加入hfsc培养液或hffb培养液重悬细胞，并以1:3的比例转移到新的培养皿中，对hfsc或hffb进行接种培养。9.根据权利要求2所述的一种构建毛囊类器官的方法，其特征在于，步骤s2中具体步骤如下：取代数为p1-p3的hfsc，在其进入对数期增长时，用tryple
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express enzyme将其消化，过滤后制备成hfsc单细胞悬液，用类器官培养液重悬，将hfsc单细胞悬液接种至96孔板中，离心后倒置培养；培养箱孵育温度为37
°
c，孵育时间为2-4小时，孵育环境为95%的空气和5%的co2，所述类器官培养液为含1%基质胶的类器官培养液。10.根据权利要求2所述的一种构建毛囊类器官的方法，其特征在于，步骤s3中具体步骤如下：取代数为p1-p3的hffb，在其进入对数期增长时，用tryple
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express enzyme将其消化，过滤后制备成hffb单细胞悬液，用类器官培养液重悬，将hffb单细胞悬液接种至96孔板中，离心后倒置培养；培养箱孵育温度为37
°
c，孵育时间为2-4小时，孵育环境为95%的空气和5%的co2，所述类器官培养液为含1%基质胶的类器官培养液。

技术总结
本发明涉及一种构建毛囊类器官的方法，利用人枕部毛囊获得毛囊干细胞和毛囊成纤维细胞，并将毛囊干细胞和毛囊成纤维细胞制备成单细胞悬液，倒置培养，再加入类器官培养液后形成毛囊类器官。根据毛发再生的生理机制，运用毛囊干细胞和毛囊成纤维细胞定向分化毛囊类器官，分化出的毛囊类器官具有与人类正常原代毛囊结构具有相似的细胞特性和结构，并可进行冻存和复苏，该方法耗时短、分化效率高，为将来在药物疗效预测、毛囊调控研究、再生医学研究等方面的应用奠定了基础。等方面的应用奠定了基础。等方面的应用奠定了基础。


技术研发人员：吴复跃 何振东 连尉伶 曾炫皓 张琦 徐金华 林尽染 吴文育
受保护的技术使用者：上海睿泰生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.09.05
技术公布日：2023/10/15