一种可控降解的胶原基质膜及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于材料学领域，具体涉及一种可控降解的胶原基质膜及其制备方法和应用。


背景技术：

2.胶原蛋白是细胞外间质蛋白质的主要成分，占人体总蛋白质的25％-30％。胶原蛋白由三条多肽链组成，每一条多肽链都是左手螺旋构型，三条左手螺旋链相互缠绕成右手螺旋结构。该结构可以确保胶原蛋白良好的稳定性。特殊的结构性质使胶原蛋白具备低免疫原性，可以促进细胞增长和组织修复，并且具有比高分子合成材料更高的生物相容性和生物可降解性，被广泛应用于食品、保健品、化妆品、医疗等行业，市场需求也不断增加。
3.目前胶原的来源还主要是来源于动物组织，特别是具有生理机械强度要求的，有完整蛋白结构的胶原更是依赖于动物来源。又由于牛、猪等哺乳动物与人的亲源性高，同时胶原本身的高度保守性，常用富含胶原的牛、猪等动物的皮、腱等提取胶原蛋白，以用于人类的生活及健康的需要。
4.本发明人一直从事胶原的研究，在中国发明专利申请cn201410452847.3中介绍了一种用酸酶法纯化牛跟腱胶原蛋白的方法及其海绵的制备；在中国发明专利申请cn202111067165.7中介绍了一种用酸酶法制备胶原蛋白植入剂的方法；以这两个发明专利申请为代表的酸酶法是当前从动物结缔组织中提取胶原的最常用的方法，其特点是能得到较多的去除胶原两端非螺旋肽分子的单体胶原，其不足之处是所得到的胶原二次组装成型后的生理机械强度低，抗撕拉性差，容易溶胀及较快速的降解。
5.现在市场上的胶原多为通过酸酶法所形成的可溶性胶原制备，所做成的产品如海绵等，无法运用于需要长周期降解的场景。
6.中国发明专利申请cn202211171156.7公开了一种胶原面膜纸的制备方法，该面膜纸可以促进细胞再生，改善肌肤纹理，延缓皮肤衰老，促进皮肤损伤修复；但因其未能明确可溶性胶原与不可溶性胶原的比例关系以及其未进行交联，也未对交联度进行设计，故其降解的稳定性将不能得到保证，也大大限制了其使用。
7.中国发明专利申请cn202111067335.1公开了一种高纯度胶原蛋白的提取工艺，提供了原料的前处理技术与纯化技术。提取工艺包括跟腱预处理步骤和胶原蛋白提取纯化步骤，在实施过程中通过合理控制预处理过程中的试剂，以及各种试剂的浓度，混合方式以及加入顺序，明显提高了预处理过程中跟腱脂肪的去除效率，提高了胶原蛋白的纯度和活性，但是过程相对太复杂，同时成本过高。
8.因此，需要开发一种低成本、能够可控降解的胶原基质膜的制备方法，进一步拓宽胶原的运用场景，同时提升畜牧业副产品价值。


技术实现要素：

9.针对现有技术存在的不足，本发明提供一种可控降解的胶原基质膜及其制备方法
和应用。本发明采用了超微细的胶体研磨机，超声剖片机等工程设备，大大提高了生产效率并降低了成本。通过控制可溶性胶原占比以及选择合适的交联度，形成具有抗撕拉性，降解可控性以及降解的长周期性的并能吸收自身重量15-30倍水分的胶原基质膜，拓宽了现有胶原的运用场景，可以满足其作为纯胶原面膜、缓降解医疗器械、干细胞支架等场景的运用。所选择的方法与设备充分考虑了其作为大型工程化生产的需要，要求生产效高、制造成本低、产品纯度高。
10.为了实现本发明目的，所采用的技术方案如下：
11.一种可控降解的胶原基质膜的制备方法，包括如下步骤：
12.(1)将原料进行处理、研磨得到初级均质液；
13.(2)对初级均质液调节ph、水洗，得到中性沉淀；
14.(3)溶解沉淀，调节蛋白浓度，研磨，得到胶原均质液；
15.(4)向胶原均质液中加入交联剂，交联，得到胶原混合液；
16.(5)将胶原混合液冻干，切割，灭菌，即得。
17.优选地，步骤(1)中所述原料的来源包括牛或猪的皮、跟腱和肌腱；通过机械方法初步去除毛发、肌肉、筯膜和脂肪后，进行水洗后得到；所述原料中含有i型胶原蛋白。
18.优选地，步骤(1)中所述处理包括氧化剂处理、碱处理和酸处理。
19.进一步优选地，所述氧化剂处理包括：将原料加入质量浓度为0.2％-0.5％的过氧化氢浸泡2-5min后，水洗2-4次；优选为质量浓度为0.3％-0.4％的过氧化氢。
20.进一步优选地，所述碱处理包括：氧化剂处理后，用0.05-0.2mol/l的氢氧化钠溶液浸泡经过12-48h，水洗至流出的水清亮。
21.进一步优选地，所述酸处理包括：用0.2-1mol/l的醋酸溶胀12-48h至无组织硬芯，溶胀后的重量是原有重量(湿重)的5倍以上。
22.优选地，步骤(1)中所述研磨的粒径小于50μm。
23.优选地，步骤(2)中所述调节ph的溶液为2-5mol/l的氢氧化钠溶液，对初级均质液调节ph至6-8，优选ph为7。
24.优选地，步骤(3)中所述溶解沉淀所用溶液为1-5mm盐酸溶液；所述盐酸溶液与沉淀的质量比为5-10:1。
25.优选地，步骤(3)中所述调节蛋白浓度所用溶液为水；所述蛋白浓度为10-20mg/ml，优选为12-15mg/ml。
26.优选地，步骤(3)中所述研磨后的颗粒粒径在3-10μm，优选为3-6μm。
27.优选地，步骤(4)中所述交联剂选自戊二醛、京尼平和环氧树酯中的一种或多种；所述环氧树酯为1,4-丁二醇二缩水甘油醚；所述1,4-丁二醇二缩水甘油醚的用量为胶原均质液干重的5-15％。
28.优选地，步骤(4)中所述交联的过程包括：向胶原均质液中加入交联剂，每分钟不超过1ml，9500-10000rpm转速搅拌，优选为10000rpm；然后将混合液以100-300g离心力除气泡10-30min，优选为120g离心30min。
29.优选地，步骤(4)中向胶原均质液中加入交联剂之前或之后，还包括加入多元醇、可溶性蛋白、多聚糖、植物提取物和活性物质中的一种或多种的步骤。
30.优选地，所述多元醇选自丙二醇、甘油、甘露醇和氢化蓖麻油peg40中的一种或多
种；所述多元醇的添加量为胶原均质液质量的0.05-2％。
31.优选地，所述柔润剂选自角鲨烷、ppg-15硬脂醇醚、氢化聚异丁烯、peg-40失水山梨醇全油酸酯和乙基己基甘油中的一种或多种；所述柔润剂的添加量为胶原均质液质量的0.01-2％。
32.优选地，所述多聚糖选自透明质酸、海藻糖和壳聚糖中的一种或多种，所述多聚糖的添加量为胶原均质液质量的0.01-3％。
33.优选地，所述植物提取物选自原花青素、积雪草提取物、甜菜碱、植物多酚、维生素e、果酸、熊果苷和植物黄酮中的一种或多种，所述植物提取物的添加量为胶原均质液质量的0.01-1％。
34.优选地，步骤(5)中所述冻干包括：胶原混合液在-60℃以下冷冻1-3h，然后在-30～-10℃下保持10-30h，真空干燥，最后在不高于110℃下烘焙8-15h。
35.优选为，胶原混合液在-60℃以下冷冻2h，然后在-20℃下保持20h，真空干燥，最后在80℃下烘焙10h。
36.优选地，步骤(5)中所述切割的设备为超声剖片机；所述切割的厚度为0.8-10mm。
37.优选地，步骤(5)中所述灭菌的方式为co60辐照灭菌或电子束射线灭菌；所述辐照灭菌的剂量为15-30kgy。
38.本发明还涉及上述制备方法制得的胶原基质膜，所述胶原基质膜包括可溶性胶原和不可溶性交联产物，所述可溶性胶原的占比为8-21％。
39.优选地，所述胶原基质膜的撕裂强度为8-15n；经过水完全浸润后，其撕裂强度为1-3n，吸水量可达到自身干重的15-30倍。
40.本发明还涉及上述制备方法制得的胶原基质膜或上述胶原基质膜在制备面膜、医疗器械或支架载体中的应用。
41.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
42.1.本发明充分利用胶原的特性，开发出了一种既带有可溶性胶原又带有不溶性胶原的多重胶原材料，通过调节可溶性胶原与不溶性胶原的比例，结合不同的交联度，可以得到一种降解可控，降解周期长的胶原材料；
43.2.本发明得到胶原材料在干态及湿态性都要良好的抗撕裂性，有高吸水性等特点，大大拓宽这种胶原材料的运用场景；
44.3.本发明制备的胶原材料有完整的蛋白结构，其生物活性与生活相容性好；
45.4.本发明制备的胶原材料与其它物质联合使用时，兼容性好，所以可以在基本技术方案的基础上进一步开发美容面膜、组织工程医疗器械、干细胞支架等运用；
46.5.本发明省去了胶原酶解提取过程，同时制备过程中引入工程化生产模式，大大降低了胶原材料的生产成本，可以让胶原材料进入更多的运用领域，大大提升了畜牧副产品的利用价值。
附图说明
47.图1为本发明的工艺流程示意图；
48.图2为实施例1制得胶原基质膜的外观图；
49.图3为实施例1制得胶原基质膜的扫描电镜图；
50.图4为实施例1制得胶原基质膜溶出液的电泳图；
51.图5为实施例1-4与对比例1-3的酶解性能测试结果图。
具体实施方式
52.对本发明实施例中的技术方案作进一步清晰地描述，所描述的实施例只是本发明的一部分，用于解释本发明，但不用于限定本发明，因此本领域其他技术人员在没有创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明的保护范围。
53.市售脱脂棉球，购自江苏米沙瓦医疗用品有限公司，医用棉球，规格50g。
54.实施例1
55.一种胶原基质膜，其中可溶性胶原的占比为13％。
56.上述胶原基质膜的制备方法，制备方法如下：
57.(1)将牛跟腱用不锈钢手术刀剔去外层筋膜和脂肪，用纯化水清洗，-20℃冷冻，备用。
58.(2)将冷冻好的牛跟腱用切片机进行切片，切成2mm切片。
59.(3)将牛跟腱切片用0.3％过氧化氢溶液浸泡5min(牛跟腱切片与过氧化氢溶液的质量比为1:2)，用纯化水冲洗3次。再用0.1mol/l的氢氧化钠溶液浸泡12h(牛跟腱切片与氢氧化钠溶液质量比为1:5)，用纯化水清洗数遍，得到物料。
60.(4)将步骤(3)处理所得的物料，浸泡在0.5mol/l乙酸溶液中溶胀24h(物料与乙酸溶液的质量比1:30)，将混悬液用胶体磨重复匀浆至粒径小于50μm。随后滴加2mol/l氢氧化钠调节溶液ph至7.0，用筛网进行过滤，得到胶原沉淀，然后用纯化水反复清洗。
61.(5)将胶原沉淀按1:5比例用1mm盐酸溶液进行溶解，用双缩脲法测定蛋白浓度，用纯化水调节胶原蛋白浓度为10mg/ml，用胶体磨进行研磨，最终溶液粒径在5μm，得到胶原均质液。
62.(6)往胶原均质液中，缓慢加入交联剂1，4-丁二醇缩水甘油醚，使得1，4-丁二醇缩水甘油醚为溶液干重的5％，用高速分散均质机，10000rpm转速搅拌均匀。
63.(7)将交联后的溶液以离心力120g离心除气泡30min，得到胶原混合液。
64.(8)将胶原混合液注入冷冻模具，2小时内送入-60℃冷冻2小时，然后将冷冻模具放入-20℃，冷冻20小时，进行冷冻干燥。冷冻干燥结束后，用80℃进行烘干10小时，然后用超声剖片机，切成1mm厚度。
65.(9)将所得的样品进行封装辐照灭菌(25kgy)得到胶原基质膜。
66.实施例2
67.一种胶原基质膜，其中可溶性胶原的占比为21％。
68.上述胶原基质膜的制备方法，制备方法如下：
69.(1)将牛跟腱用不锈钢手术刀剔去外层筋膜和脂肪，用纯化水清洗，-20℃冷冻，备用。
70.(2)将冷冻好的牛跟腱用切片机进行切片，切成2mm切片。
71.(3)将牛跟腱切片用0.3％过氧化氢溶液浸泡5min(牛跟腱切片与过氧化氢溶液的质量比为1:2)，用纯化水冲洗3次。再用0.2mol/l氢氧化钠溶液浸泡12h(牛跟腱切片与氢氧化钠溶液质量比为1:5)，用纯化水清洗数遍，得到物料。
72.(4)将步骤(3)处理所得的物料，浸泡在0.5mol/l乙酸中溶胀24h(物料与乙酸溶液的质量比1:30)，将混悬液用胶体磨重复匀浆至粒径小于50μm。随后滴加2mol/l氢氧化钠调节溶液ph至7.0，用筛网进行过滤，得到胶原沉淀，然后用纯化水反复清洗。
73.(5)将胶原沉淀按1:5比例用1mm盐酸溶液进行溶解，用双缩脲法测定蛋白浓度，用纯化水调节胶原蛋白浓度为15mg/ml，用胶体磨进行研磨，最终溶液粒径在5μm，得到胶原均质液。
74.(6)往胶原均质液中，缓慢加入交联剂1，4-丁二醇缩水甘油醚，使得1，4-丁二醇缩水甘油醚为溶液干重的5％，用高速分散均质机，10000rpm转速搅拌均匀。
75.(7)将交联后的溶液以离心力120g离心除气泡30min，得到胶原混合液。
76.(8)将胶原混合液注入冷冻模具，2小时内送入-60℃冷冻2小时，然后将冷冻模具放入-20℃，冷冻20小时，进行冷冻干燥。冷冻干燥结束后，用80℃进行烘干10小时，然后用超声剖片机，切成1mm厚度。
77.(9)将所得的样品进行封装辐照灭菌(25kgy)得到胶原基质膜。
78.实施例3
79.一种胶原基质膜，其中可溶性胶原的占比为8％。
80.上述胶原基质膜的制备方法，制备方法如下：
81.(1)将牛跟腱用不锈钢手术刀剔去外层筋膜和脂肪，用纯化水清洗，-20℃冷冻，备用。
82.(2)将冷冻好的牛跟腱用切片机进行切片，切成2mm切片。
83.(3)将牛跟腱切片用0.3％过氧化氢溶液浸泡5min(牛跟腱切片与过氧化氢溶液的质量比为1:2)，用纯化水冲洗3次。再用0.1mol/l氢氧化钠溶液浸泡12h(牛跟腱切片与氢氧化钠溶液质量比为1:5)，用纯化水清洗数遍，得到物料。
84.(4)将步骤(3)处理所得的物料，浸泡在0.5mol/l乙酸中溶胀24h(物料与乙酸溶液的质量比1:30)，将混悬液用胶体磨重复匀浆至粒径小于50μm。随后滴加2mol/l氢氧化钠调节溶液ph至7.0，用筛网进行过滤，得到胶原沉淀，然后用纯化水反复清洗。
85.(5)将胶原沉淀按1:5比例用1mm盐酸溶液进行溶解，用双缩脲法测定蛋白浓度，用纯化水调节胶原蛋白浓度为10mg/ml，用胶体磨进行研磨，最终溶液粒径在5μm，得到胶原均质液。
86.(6)往胶原均质液中，缓慢加入交联剂1，4-丁二醇缩水甘油醚，使得1，4-丁二醇缩水甘油醚为溶液干重的10％，用高速分散均质机，10000rpm转速搅拌均匀。
87.(7)将混合后的溶液以离心力120g离心除气泡30min。
88.(8)将胶原混合液注入冷冻模具，2小时内送入-60℃冷冻2小时，将冷冻模具放入-20℃，冷冻20小时，进行冷冻干燥。冷冻干燥结束后，用80℃进行烘干15小时，然后用超声剖片机，切成1mm厚度。
89.(9)将所得的样品进行封装辐照灭菌(25kgy)得到胶原基质膜产品。
90.实施例4
91.一种胶原基质膜，其中可溶性胶原的占比为16％。
92.上述胶原基质膜的制备方法，制备方法如下：
93.(1)将牛跟腱用不锈钢手术刀剔去外层筋膜和脂肪，用纯化水清洗，-20℃冷冻，备
用。
94.(2)将冷冻好的牛跟腱用切片机进行切片，切成2mm切片。
95.(3)将牛跟腱切片用0.3％过氧化氢溶液浸泡5min(牛跟腱切片与过氧化氢溶液的质量比为1:2)，用纯化水冲洗3次。再用0.2mol/l氢氧化钠溶液浸泡48h(牛跟腱切片与氢氧化钠溶液质量比为1:5)，用纯化水清洗数遍，得到物料。
96.(4)将步骤(3)处理所得的物料，浸泡在1mol/l乙酸中溶胀24h(物料与乙酸溶液的质量比1:30)，将混悬液用胶体磨重复匀浆至粒径小于50μm。随后滴加2mol/l氢氧化钠调节溶液ph至7.0，用筛网进行过滤，得到胶原沉淀，然后用纯化水反复清洗。
97.(5)将胶原沉淀按1:5比例用1mm盐酸溶液进行溶解，用双缩脲法测定蛋白浓度，用纯化水调节胶原蛋白浓度为10mg/ml，用胶体磨进行研磨，最终溶液粒径在5μm，得到胶原均质液。
98.(6)往胶原均质液中，缓慢加入交联剂1，4-丁二醇缩水甘油醚，使得1，4-丁二醇缩水甘油醚为溶液干重的5％，用高速分散均质机，10000rpm转速搅拌均匀。
99.(7)将混合后的溶液以离心力120g离心除气泡30min。
100.(8)将胶原混合液注入冷冻模具，2小时内送入-60℃冷冻2小时，将冷冻模具放入-20℃，冷冻20小时，进行冷冻干燥。冷冻干燥结束后，用80℃进行烘干15小时，然后用超声剖片机，切成1mm厚度。
101.(9)将所得的样品进行封装辐照灭菌(25kgy)得到胶原基质膜产品。
102.实施例5
103.一种美容冻干面膜的制备方法，制备方法如下：
104.(1)将牛皮用剖层机剖去表皮层和脂肪层，切成20cm
×
20cm块状，用纯化水清洗，-20℃冷冻，备用。
105.(2)将冷冻的牛皮块用切片机进行切片，切成5mm切片。
106.(3)将牛皮切片用0.5％过氧化氢溶液浸泡5min(牛皮切片与过氧化氢溶液的质量比为1:2)，用纯化水冲洗3次。再用0.2mol/l氢氧化钠溶液浸泡24h(牛皮切片与氢氧化钠溶液质量比为1:5)，用纯化水清洗数遍，得到物料。
107.(4)将步骤(3)处理所得的物料，浸泡在0.5mol/l乙酸中溶胀48h(物料与乙酸溶液的质量比1:30)，将混悬液用胶体磨重复匀浆至粒径小于50μm。随后滴加2mol/l氢氧化钠调节溶液ph至7.0，用筛网进行过滤，得到胶原沉淀，然后用纯化水反复清洗。
108.(5)将胶原沉淀按1:7比例用5mm盐酸溶液进行溶解，用纯化水调节胶原蛋白浓度为12mg/ml，往溶胀液中加入透明质酸钠和peg-40氢化蓖麻油，添加量分别为溶液总质量的0.02％和0.5％。
109.(6)胶原混合液用胶体磨进行研磨，最终溶液粒径在5μm，得到胶原均质液。
110.(7)往胶原均质液中，缓慢加入交联剂1，4-丁二醇缩水甘油醚，使得1，4-丁二醇缩水甘油醚为溶液干重的7％，用高速分散均质机搅拌均匀。
111.(8)将交联后的溶液以离心力120g离心除气泡30min。
112.(9)将胶原混合液注入面膜模具，送入-60℃冷冻2h，将冷冻模具放入-20℃，冷冻20h，进行冷冻干燥。根据混合液添加量不同，最终冻干面膜厚度为0.5、1和1.5mm。
113.(10)将冻干面膜在60℃温度下，烘干6h。
114.(11)将所得的样品进行封装辐照灭菌(18kgy)得到冻干面膜产品。
115.实施例6
116.一种止血海绵的制备，制备方法如下：
117.(1)将牛跟腱用不锈钢手术刀剔去外层筋膜和脂肪，用纯化水清洗，-20℃冷冻，备用。
118.(2)将冷冻好的牛跟腱用切片机进行切片，切成2mm切片。
119.(3)将牛跟腱切片用0.3％过氧化氢溶液浸泡5min(牛跟腱切片与过氧化氢溶液的质量比为1:2)，用纯化水冲洗3次。再用0.1mol/l氢氧化钠溶液浸泡12h(牛跟腱切片与氢氧化钠溶液质量比为1:5)，用纯化水清洗数遍，得到物料。
120.(4)将步骤(3)处理所得的物料，浸泡在0.5mol/l乙酸中溶胀24h(物料与乙酸溶液的质量比1:30)，将混悬液用胶体磨重复匀浆至粒径小于50μm。随后滴加2mol/l氢氧化钠调节溶液ph至7.0，用筛网进行过滤，得到胶原沉淀，然后用纯化水反复清洗。
121.(5)将胶原沉淀按1:5比例用5mm盐酸溶液进行溶解，用双缩脲法测定蛋白浓度，用纯化水调节胶原蛋白浓度为20mg/ml，用胶体磨进行研磨，最终溶液粒径在5μm，得到胶原均质液。
122.(6)往胶原混合液中，缓慢加入交联剂1，4-丁二醇缩水甘油醚，使得1，4-丁二醇缩水甘油醚为溶液干重的7％，用高速分散均质机搅拌均匀。
123.(7)用5mm盐酸溶解大分子壳聚糖，配制质量分数为3％的壳聚糖溶液，以胶原均质液和壳聚糖溶液比例为2:1进行搅拌混合。
124.(8)将混合后的溶液以离心力120g离心除气泡30min。
125.(9)将胶原混合液注入冷冻模具，2h内送入-60℃冷冻2h，将冷冻模具放入-20℃，冷冻20h，进行冷冻干燥。冷冻干燥结束后，用80℃进行烘干15h，然后用超声剖片机，切成5mm厚度。
126.(10)将所得的样品进行封装辐照灭菌(25kgy)得到止血海绵产品。
127.对比例1
128.一种牛跟腱胶原基质膜(未交联)的制备方法，所述制备方法如下：
129.(1)将牛跟腱用不锈钢手术刀剔去外层筋膜和脂肪，用纯化水清洗，-20℃冷冻，备用。
130.(2)将冷冻好的牛跟腱用切片机进行切片，切成2mm切片。
131.(3)将牛跟腱切片用0.3％过氧化氢溶液浸泡5min(牛跟腱切片与过氧化氢溶液的质量比为1:2)，用纯化水冲洗3次。再用0.1mol/l氢氧化钠溶液浸泡牛跟腱切片12h(牛跟腱切片与氢氧化钠溶液质量比为1:5)，用纯化水清洗数遍，得到物料。
132.(4)将步骤(3)处理所得的物料，浸泡在0.5mol/l乙酸中溶胀24h(物料与乙酸溶液的质量比1:30)，将混悬液用胶体磨重复匀浆至粒径小于50μm。随后滴加2mol/l氢氧化钠调节溶液ph至7.0，用筛网进行过滤，得到胶原沉淀，然后用纯化水反复清洗。
133.(5)将胶原沉淀按1:5比例用1mm盐酸溶液进行溶解，用双缩脲法测定蛋白浓度，用纯化水调节胶原蛋白浓度为10mg/ml，用胶体磨进行研磨，最终溶液粒径在5μm，得到胶原均质液。
134.(6)将胶原均质液以离心力120g离心除气泡30min。
135.(7)将胶原均质液注入冷冻模具，2h内送入-60℃冷冻2h，然后将冷冻模具放入-20℃，冷冻20h，进行冷冻干燥。冷冻干燥结束后，用80℃进行烘干10h，然后用超声剖片机，切成1mm厚度。
136.(8)将所得的样品进行封装辐照灭菌(25kgy)得到未交联的胶原基质膜。
137.对比例2
138.一种胶原基质膜，制备方法与实施例1一致，不同之处仅在于：步骤(5)中用纯化水调节胶原蛋白浓度为25mg/ml。
139.对比例3
140.一种胶原基质膜，制备方法与实施例1一致，不同之处仅在于：步骤(6)中1,4-丁二醇缩水甘油醚为溶液干重的20％。
141.对比例4
142.一种美容冻干面膜的制备方法，制备方法与实施例5一致，区别仅在于：步骤(7)中1,4-丁二醇缩水甘油醚为溶液干重的20％。
143.测试例1胶原基质膜吸水率测试
144.精确称量干燥的胶原基质膜，精确至0.001g，将胶原基质膜完全浸润在纯化水中，使其充分吸水溶胀，用细线悬挂胶原基质膜，直至没有水滴滴落，称量重量。计算吸收水分与样品重量之比，实验重复三次取平均值。
145.表1胶原基质膜吸水率测试
[0146][0147]
结果显示：交联后的胶原基质膜对比未交联的胶原基质膜吸水率大幅度提高。在一定范围内，基质膜吸水率与胶原蛋白和交联剂浓度呈正相关，但过量的胶原蛋白和交联剂提升效果不明显，反而会增加制造成本和造成交联剂残留。
[0148]
测试例2胶原基质膜外观与微观结构观察
[0149]
实施例1胶原基质膜样品外观形态如图2，胶原基质膜外观白皙，表面柔顺，呈天鹅绒状。取微量干燥的胶原基质膜，粘贴于导电胶上，真空镀金膜后，用扫描电子显微镜做sem观察，图3结果显示样品微观结构排列有序，整体呈多孔状结构，内部呈丝网状结构。
[0150]
测试例3胶原基质膜溶出液sds-page电泳测试
[0151]
取一定量实施例1制得的胶原基质膜，加入5倍的稀盐酸溶液，挤出溶出液，选择7％分离胶与4.5％浓缩胶制备电泳胶进行凝胶电泳，电泳结束后，用考马斯亮蓝进行染色，用脱色液进行脱色，拍照观察记录。
[0152]
结果如图4所示，电泳图显示胶原基质膜溶出液有明显的胶原特征条带α1、α2链以及β链，同时也含有不同分子量的胶原蛋白多肽，正是这些胶原蛋白多肽可以溶出。而结构完整胶原分子，具有三螺旋结构，在基质膜中起到结构固定，缓控降解及3d成型的作用。
[0153]
测试例4胶原基质膜溶出液蛋白分子量分布gpc测试
[0154]
对实施例1-4进行分子量分布测试，取一定量制得胶原基质膜，加入5倍的稀盐酸溶液，挤出溶出液，将溶出液经过0.22μm微孔滤膜后进行凝胶渗透色谱仪进行检测。
[0155]
色谱柱：pl aquagel-oh mixed-h,8μm，7.5x300mm；
[0156]
检测器：示差检测器、双角度激光散射检测器、黏度检测器；
[0157]
流速：1.0ml/min，柱温：45℃；进样量：50μl；
[0158]
流动相：0.1mol/l硝酸钠(0.01％叠氮化钠)，等度洗脱。
[0159]
通过计算样品粘度、出峰时间等利用gpc软件拟合出样品的分子量分布。
[0160]
表2胶原基质膜溶出液蛋白分子量分布表
[0161]
序号分子量上限分子量下限实施例1实施例2实施例3实施例41-98000016.98％11.27％10.72％4.97％29800006500003.25％8.19％15.41％8.91％36500003500004.78％9.27％8.91％11.17％42000001000006.13％15.53％7.15％9.17％510000028563.79％55.74％57.8165.78％
[0162]
从表2可知，胶原膜溶出液蛋白分子量分布广泛，其中10万分子量以下的可溶性胶原肽占主要成分。通过对比可知，通过控制不同酸碱处理浓度、交联前溶液蛋白含量和交联剂浓度，可以有效改变溶出液中蛋白分子量分布，从而影响产品实际性能。
[0163]
测试例5胶原基质膜耐酶降解性能测试
[0164]
胶原酶溶液配置:将胶原酶溶解于ph＝7.4的pbs溶液，配置20u/ml胶原酶溶液，经除菌过滤后，备用。
[0165]
将胶原基质膜裁剪成1cm
×
1cm的正方形片，称重后将胶原膜和胶原酶溶液混合加入至试管中，放入37℃恒温培养箱中。酶解24h后，加入edta溶液，停止胶原酶酶解，取出胶原膜放入37℃烘箱中，烘至恒重，根据重量减少量计算酶解率。
[0166]
图5结果显示胶原基质膜可被胶原酶降解，经环氧化合物交联后的基质膜，抗酶降解性能明显提高。在一定范围内，通过增加交联前胶原溶液浓度或交联剂浓度，可进一步提高抗酶解能力。
[0167]
测试例6胶原蛋白基质膜干燥/润湿状态下抗撕裂强度测试
[0168]
对胶原蛋白基质膜进行抗撕裂强度测试，将胶原蛋白基质膜精准裁剪至10cm
×
1.5cm长条形，两端固定在电子拉力试验机上，进行拉力测试，直至胶原蛋白基质膜断裂。同样将润湿后的胶原蛋白基质膜，进行拉力测试，实验重复三次取平均值。
[0169]
表3胶原蛋白基质膜抗撕裂强度测试表
[0170][0171]
表3结果显示：实施例1与对比例1对比可知，经交联剂交联后，胶原蛋白基质膜在干燥/润湿状态下抗撕裂强度明显提升。胶原蛋白浓度增加会提高干燥状态下基质膜的抗撕裂强度，但胶原蛋白浓度过高会导致增加未交联胶原分子比例，导致抗撕裂强度下降。在
一定范围内，交联剂比例进一步增加，会明显降低基质膜在润湿状态的抗撕裂强度。从实施例4可看出，改变原料酸碱处理方式会调整胶原悬浮液中可溶性胶原与不可溶性胶原比例，从而显著影响基质膜抗撕裂强度。
[0172]
测试例7冻干面膜干燥/润湿状态下抗撕裂强度测试
[0173]
对实施例5和对比例4得到的冻干面膜进行抗撕裂强度测试，将干燥冻干面膜精准裁剪至10cm
×
1.5cm长条形，两端固定在电子拉力试验机上，进行拉力测试，直至面膜断裂。同样将润湿后的面膜，进行拉力测试，实验重复三次取平均值。
[0174]
表4冻干面膜抗撕裂强度测试表
[0175][0176]
表4结果显示：实施例5抗撕裂强度明显优于对比例4，冻干面膜在干燥状态具有良好的抗撕裂强度，且随着厚度的增加而增大。冻干面膜完全润湿后，由于胶原纤维吸水造成间隙增大和影响纤维间的氢键，导致湿态下抗撕裂强度减小，但不影响正常使用。
[0177]
测试例8胶原止血海绵兔耳静脉止血实验
[0178]
将新西兰兔进行麻醉，在右耳耳源静脉周围去毛，距耳尖部8cm处割断耳源静脉，5s后用实施例5制备的止血海绵敷于伤口，对照组压敷脱脂棉球，每隔30s观察伤口的流血情况，记录止血时间和称量前后止血材料重量计算止血量。
[0179]
表5兔耳静脉止血实验记录表
[0180]
组别止血时间(s)止血量(g)实施例6(止血海绵)182.3
±
18.00.1540
±
0.0246市售脱脂棉球232.7
±
10.60.0292
±
0.0134
[0181]
表5结果显示：与脱脂棉球相比，实施例6制备的止血海绵吸水性能较好，敷于伤口能够快速止血。
[0182]
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

技术特征：
1.一种可控降解的胶原基质膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将原料进行处理、研磨得到初级均质液；(2)对初级均质液调节ph、水洗，得到中性沉淀；(3)溶解沉淀，调节蛋白浓度，研磨，得到胶原均质液；(4)向胶原均质液中加入交联剂，交联，得到胶原混合液；(5)将胶原混合液冻干，切割，灭菌，即得。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述原料的来源包括牛或猪的皮、跟腱和肌腱；通过机械方法初步去除毛发、肌肉、筯膜和脂肪后，进行水洗后得到；所述原料中含有i型胶原蛋白。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述处理包括氧化剂处理、碱处理和酸处理。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述氧化剂处理包括：将原料加入质量浓度为0.2％-0.5％的过氧化氢浸泡2-5min后，水洗2-4次。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述碱处理包括：氧化剂处理后，用0.05-0.2mol/l的氢氧化钠溶液浸泡12-48h，水洗至流出的水清亮。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述酸处理包括：碱处理后，用0.2-1mol/l的醋酸溶胀12-48h至无组织硬芯。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述研磨的粒径小于50μm。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述调节ph的溶液为2-5mol/l的氢氧化钠溶液，对初级均质液调节ph至6-8。9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述溶解沉淀所用溶液为1-5mm盐酸溶液；所述盐酸溶液与沉淀的质量比为5-10:1。10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述调节蛋白浓度所用溶液为水；所述蛋白浓度为10-20mg/ml。11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中磨后的颗粒粒径在3-10μm。12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述交联剂选自戊二醛、京尼平和环氧树酯中的一种或多种；所述环氧树酯为1,4-丁二醇二缩水甘油醚；所述1,4-丁二醇二缩水甘油醚的用量为胶原均质液干重的5-15％。13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述交联的过程包括：向胶原均质液中加入交联剂，每分钟不超过1ml，9500-10000rpm转速搅拌，然后将交联后的溶液以100-300g离心力除气泡10-30min。14.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中向胶原均质液中加入交联剂之前或之后，还包括加入多元醇、柔润剂、可溶性蛋白、多聚糖、植物提取物和活性物质中的一种或多种的步骤。15.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述冻干包括：胶原混合液在-60℃以下冷冻1-3h，然后在-30～-10℃下保持10-30h，进行真空干燥，最后在不高于110℃下烘焙8-15h。16.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中切割的设备为超声剖片
机；切割的厚度为0.8-10mm。17.一种权利要求1-16任一项所述的制备方法制得的胶原基质膜，其特征在于，所述胶原基质膜包括可溶性胶原和不可溶性交联产物，所述可溶性胶原，以最终干燥产物重量计，占比为8-21％。18.根据权利要求17所述的胶原基质膜，其特征在于，所述胶原基质膜的撕裂强度为8-15n；经过水完全浸润后，其撕裂强度为1-3n，吸水量可达到自身干重的15-30倍。19.一种权利要求1-16任一项所述的制备方法制得的胶原基质膜或权利要求17-18任一项所述的胶原基质膜在制备面膜、医疗器械或支架载体中的应用。

技术总结
本发明涉及材料学领域，具体涉及一种可控降解的胶原基质膜及其制备方法和应用。制备方法包括如下步骤：(1)将原料进行处理、研磨得到初级均质液；(2)对初级均质液调节pH、水洗，得到中性沉淀；(3)溶解沉淀，调节蛋白浓度，研磨，得到胶原均质液；(4)向胶原均质液中加入交联剂，交联，得到胶原混合液；(5)将胶原混合液冻干，切割，灭菌，即得。通过调节可溶性胶原与不溶性胶原的比例，结合不同的交联度，可以得到一种降解可控，降解周期长的胶原材料；利用该胶原基质膜得到的胶原材料具有良好的抗撕裂性和高吸水性。性和高吸水性。性和高吸水性。


技术研发人员：胡张捷 陆欢欢 王雅娜 张智武
受保护的技术使用者：浙江崇山生物制品有限公司
技术研发日：2023.08.16
技术公布日：2023/10/15