一种吡啶类生物碱及其在抗肿瘤药物制备中的应用的制作方法

1.本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种吡啶类生物碱及其在抗肿瘤药物制备中的应用。


背景技术：

2.近年来，癌症发病处于逐渐上升态势，研发新型高效且作用机制独特的抗肿瘤新药具有重要的经济和社会意义。
3.研究发现，从海洋生物中分离的代谢产物具有化学结构多样性，且具有广泛的药理活性，包括抗菌、抗寄生虫、酶抑制剂、抗氧化、细胞毒活性等。其中，生物碱是一类非常重要的物质，目前国内外被批准上市或进入临床的海洋活性物质或其衍生物中，生物碱类化合物占10.2%，仅次于肽类化合物。海洋放线菌代谢产物丰富，是天然活性物质的优良菌源，海洋高压、高盐、低温的特殊生境使得海洋放线菌形成了复杂而独特的代谢途径，因此可以产出很多结构新颖、活性显著的新型生物碱，具有巨大的研究价值和开发前景。


技术实现要素：

4.本发明提供一种吡啶类生物碱及其在抗肿瘤药物制备中的应用。该吡啶类生物碱对肝癌hepg2细胞具有良好的生长抑制作用，具备开发成新型抗肿瘤药物的潜力。
5.具体技术方案如下：本发明的目的之一是提供一种吡啶类生物碱，其化学结构如下式所示：。
6.上述的吡啶类生物碱分离自海洋放线菌streptomyces sp. kcb-132的次生代谢产物，命名为strepyridin b。药理活性实验发现，化合物strepyridin b对肝癌hepg2细胞具有良好的生长抑制作用（ic
50
值为3.4 μm）。
7.所述的海洋放线菌streptomyces sp. kcb-132从海底沉积物分离获得，于2022年6月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为cgmcc no. 25176，分类命名为链霉菌streptomyces sp.。
8.进一步，所述的吡啶类生物碱的制备方法包括：对海洋放线菌streptomyces sp. kcb-132进行培养，收获发酵产物；并对发酵产物进行纯化。
9.再进一步，培养海洋放线菌streptomyces sp. kcb-132使用的培养基为isp2培养基或纯海水isp2培养基，优选为半海水isp2培养基。
10.具体地，培养方法如下：将海洋放线菌株streptomyces sp. kcb-132划线接种于
固体培养基上培养，直至长出孢子；然后将孢子接种到液体培养基发酵培养，收获发酵产物。
11.其中，在固体培养基上于25~28℃培养3~5天。
12.其中，孢子在液体培养基于25~28℃培养7~10天。
13.再进一步，所述的纯化包括：对发酵产物进行层析纯化。
14.具体地，所述的纯化方法如下：过滤发酵产物，获得发酵液和菌丝体，发酵液经大孔吸附树脂柱吸附、洗脱及减压浓缩；菌丝体经超声破碎、提取、减压浓缩；合并减压浓缩物，利用有机溶剂萃取，减压浓缩得粗提物。粗提物经过硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇洗脱，洗脱液加压浓缩，得浓缩浸膏。浓缩浸膏通过ods凝胶柱层析，甲醇-水梯度洗脱，并通过薄层层析检测处理洗脱组分，然后将洗脱组分通过hplc进一步纯化，得到新化合物strepyridin b（4.31mg，tr=8.20 min）。
15.其中，大孔吸附树脂柱吸附后，使用有机醇洗脱，所述的有机醇优选为甲醇或/和乙醇，最优选为甲醇。
16.其中，所述的大孔吸附树脂柱为弱极性或非极性的大孔吸附树脂柱，优选弱极性大孔吸附树脂柱。
17.其中，菌丝体超声破碎中加入甲醇。
18.其中，菌丝体经超声破碎后，使用有机溶剂提取，所述的有机溶剂优选为三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇中的至少一种，最优选为乙酸乙酯。
19.其中，合并发酵液与菌丝体的减压浓缩物后，萃取用的有机溶剂优选为乙酸乙酯。
20.其中，硅胶柱层析中，二氯甲烷-甲醇（99:1，体积比）洗脱。
21.其中，ods凝胶柱层析中，甲醇-水（10:90~100:0，体积比）梯度洗脱。
22.其中，hplc纯化中，hplc的柱层析填料优选为c-18或c-8，最优选为c-18。
23.本发明的目的之二是提供上述吡啶类生物碱strepyridin b在抗肿瘤药物制备中的应用。
24.进一步，吡啶类生物碱strepyridin b应用于抗肝癌药物的制备，尤其是应用于抑制肝癌hepg2细胞的药物的制备。
25.本发明的有益效果如下：本发明从海洋放线菌streptomyces sp. kcb-132中获得一种新的吡啶类生物碱strepyridin b。药理活性实验发现，化合物strepyridin b对肝癌hepg2细胞具有良好的生长抑制作用（ic
50
值为3.4 μm）。因此，新化合物strepyridin b具有开发成新型抗肿瘤药物的潜力。
附图说明
26.图1为化合物strepyridin b的化学结构式；图2为化合物strepyridin b的1h nmr谱图；图3为化合物strepyridin b的
13
c nmr谱图；图4为化合物strepyridin b的1h-1
h cosy谱图；图5为化合物strepyridin b的hsqc谱图；图6为化合物strepyridin b的hmbc谱图；
图7为化合物strepyridinb的高分辨质谱图。
具体实施方式
27.以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获取。
28.使用半海水isp2培养基培养海洋放线菌streptomycessp.kcb-132，将海洋放线菌streptomycessp.kcb-132划线接种于固体培养基上，于28℃培养3天，直至长出孢子，然后将孢子接种到液体培养基，在28℃条件下，摇床培养7天，收获发酵物。
29.过滤发酵物获得发酵液和菌丝体，发酵液经弱极性大孔吸附树脂柱吸附，然后用甲醇洗脱，再减压浓缩；向菌丝体加入甲醇超声破碎，然后用乙酸乙酯提取、减压浓缩；合并减压浓缩物，利用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得粗提物。粗提物经过硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇（99:1，体积比）洗脱，洗脱液加压浓缩，得浓缩浸膏。浓缩浸膏通过ods凝胶柱层析，甲醇-水（10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、100:0，体积比）梯度洗脱，并根据薄层层析检测分为10个洗脱组分，分别编号为洗脱组分1~10。洗脱组分4通过制备型hplc系统（ymc-packods-a，c18，250mm
×
4.6mm，5μm，uv=210nm），甲醇-水（40:60，体积比）进一步纯化，得新化合物strepyridinb（4.31mg，tr=8.20min）。
30.（1）仪器与材料autopolvi(serial#91058)旋光仪，watersacquityuplciclass-vionimsqt高分辨率质谱仪，appliedphotophysics9798qb光谱仪，waters2489紫外/可见光液相色谱仪，brukeravanceiiitm600核磁共振仪。
31.（2）化学结构确定strepyridinb：淡黄色油状，[α]
d20
+85.2(甲醇,c0.11)；uv(乙腈)：λmax(logε)230(3.5),260(3.2),277(3.3),286(3.3),306(3.0),318(3.2)nm；1d和2d-nmr(600mhz,dmso-d6)数据见表1及图2~图6；hresimsm/z：[m－h]
－
212.09264，见图7。
[0032]
表1化合物strepyridinb的1hnmr及
13
cnmr数据
[0033][0034]
依据以上化合物的理化参数、波谱数据（图2~7），确定新化合物strepyridin b的结构如下式所示：。
[0035]
实施例3 吡啶类生物碱strepyridin b的抗肿瘤活性检测化合物strepyridin b的抗肿瘤活性试验方法如下：将肝癌hepg2细胞置于96孔板，每孔加入100 μl dmem培养基，细胞浓度约为5000个细胞/孔，37℃，5%co2恒温箱内培养过夜。化合物strepyridin b设置3个浓度，每浓度设3个平行孔，培养72小时后，每孔加入20 μl mtt溶液（5 mg/ml），37℃，5% co2条件下继续培养4小时，弃去上清液，然后每孔加入150 μl二甲基亚砜以溶解fomazan晶体，轻度振荡5分钟后，酶标仪下检测570 nm处的吸光度，以放线菌素d为对照，用graph pad prism 5软件计算化合物strepyridin b的ic
50
值，计算得ic
50
值为3.4 μm。
[0036]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和
原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种吡啶类生物碱，其特征在于，其化学结构如下式所示：。2.根据权利要求1所述的吡啶类生物碱，其特征在于，其分离自海洋放线菌streptomyces sp. kcb-132的次生代谢产物。3.根据权利要求2所述的吡啶类生物碱，其特征在于，所述的海洋放线菌streptomyces sp. kcb-132于2022年6月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为cgmcc no. 25176，分类命名为链霉菌streptomyces sp.。4.根据权利要求2所述的吡啶类生物碱，其特征在于，其制备方法包括：对海洋放线菌streptomyces sp. kcb-132进行培养，收获发酵产物；并对发酵产物进行纯化。5.根据权利要求4所述的吡啶类生物碱，其特征在于，培养海洋放线菌streptomyces sp. kcb-132使用的培养基为半海水isp2培养基或纯海水isp2培养基。6.根据权利要求4所述的吡啶类生物碱，其特征在于，所述的纯化包括：对发酵产物进行层析纯化。7.一种如权利要求1~6任一项所述的吡啶类生物碱在抗肿瘤药物制备中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，应用于抗肝癌药物的制备。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，应用于抑制肝癌hepg2细胞的药物的制备。

技术总结
本发明属于生物制药技术领域，公开了一种吡啶类生物碱。所述吡啶类生物碱分离自海洋放线菌Streptomyces sp.KCB-132的次生代谢产物，命名为strepyridin B。药理活性实验发现，化合物strepyridin B对肝癌HepG2细胞具有良好的生长抑制作用。本发明还公开了上述吡啶类生物碱strepyridin B在抗肿瘤药物制备中的应用，尤其是应用于抗肝癌药物的制备。尤其是应用于抗肝癌药物的制备。尤其是应用于抗肝癌药物的制备。


技术研发人员：宫世周 张淑敏 谢则平 曲承蕾 申胜标 王培 曹玉莹 刘硕
受保护的技术使用者：烟台蓝创生物技术有限公司
技术研发日：2023.09.07
技术公布日：2023/10/15