基于内生真菌来源的吡喃酮类化合物及其制备方法和应用

1.本发明属于天然产物应用领域，涉及一种吡喃酮类化合物及其制备方法和应用，具体涉及一种基于蓝花黄芩内生真菌来源的吡喃酮类化合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.唇形科(lamiacea)黄芩属(scutellaria)植物，大约有360种，大多数生长于亚洲，在欧洲、北美洲和东亚地区也有分布。其在《中国植物志》中记载有102种，50个变种，多为药用植物，具有清热燥湿、泻火解毒等功效。其中黄芩(s.baicalensis)和半枝莲(s.barbata)入选了2020年版《中国药典》。现代药理研究表明，黄芩属植物具有抗氧化、抗肿瘤、保肝，抗炎、抗惊厥、抗菌、抗病毒等作用。
3.蓝花黄芩(scutellariaformosana)，主要分布于海南南部、广东东部和南部、江西、福建南部以及云南南部等地区。蓝花黄芩多生长于海拔450-550米林下荫处，其生长环境较为特殊，使其异常珍稀、难以寻觅，造成蓝花黄芩的产量屈指可数。受到蓝花黄芩产量的限制，采集蓝花黄芩植物进行药物开发显然难以实现产业化，也不利于珍稀的天然药用植物的保护。因此，急需开发药用蓝花黄芩的替代资源。
4.蓝花黄芩内生真菌是共生于宿主蓝花黄芩中的内生微生物，其参与宿主次级代谢产物的生物合成，并在长期适应自然环境的过程中会代谢出丰富的、结构特殊的代谢产物。更重要的是蓝花黄芩内生真菌可以通过发酵工程技术进行大规模生产，无需破坏蓝花黄芩稀少的植物资源而易于实现产业化。因此，开展蓝花黄芩内生微生物次级代谢产物及其药理活性的研究具有理论研究价值和重要的实际意义。
5.本发明的目的是提供一种基于蓝花黄芩内生真菌来源的吡喃酮类化合物，具有抗菌和抗炎活性，可以进一步开发成抗炎药物，具有开发成抗炎药物的前景，尤其是在抑制一氧化氮生成方面的抗炎药物中的应用。
6.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
7.一种吡喃酮类化合物，所述吡喃酮类化合物为化合物1、化合物2、化合物3和/或化合物4，其化学结构分别如下：
[0008][0009]
本发明的另一目的是提供所述基于蓝花黄芩内生真菌来源的吡喃酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0010]
s1：制备ascomycota sp.fae17菌株的发酵物；
[0011]
s2：将步骤s1得到的发酵物用等体积的乙酸乙酯萃取，减压浓缩萃取液得到乙酸乙酯萃取浸膏；
[0012]
s3：将步骤s2得到的乙酸乙酯萃取浸膏进行柱色谱分离纯化，得到化合物1、化合物2、化合物3和化合物4。
[0013]
进一步的，所述步骤s1包括以下步骤：将所述ascomycota sp.fae17菌株转接到pda培养基上培养，再转接到装有马铃薯葡萄糖液体养基的三角瓶中，摇荡培养，得到种子菌液，将种子菌液转接到高温灭菌的大米培养基锥形瓶中静置发酵得到发酵物。
[0014]
进一步的，所述步骤s3包括以下步骤：
[0015]
(1)将乙酸乙酯萃取浸膏经硅胶柱色谱粗分离，分别按体积比为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、3:7、2:8、1:9、0:1进行石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱和体积比为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、1:1进行乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集体积比为9:1、8:2、7:3的乙酸乙酯-甲醇洗脱物；
[0016]
(2)合并体积比为9:1、8:2、7:3的乙酸乙酯-甲醇洗脱物后进行反相硅胶柱层析，用体积比为1:9、2:8、3:7、4:6、6:4、8:2、10:0的甲醇-水梯度洗脱，收集体积为1:9的甲醇-水洗脱物；
[0017]
(3)将所得甲醇-水洗脱物进行正相硅胶柱层析，用体积比为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、3:7进行乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，分别收集体积比为9:1和8:2的乙酸乙酯-甲醇洗脱物进行浓缩；
[0018]
(4)取浓缩后的体积比为9:1的乙酸乙酯-甲醇洗脱物用半制备型高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水，体积比8:92，得到化合物1、化合物3和化合物4；
[0019]
(5)取浓缩后的体积比为8:2的乙酸乙酯-甲醇洗脱物进行反相硅胶柱层析，用体积比为1:9、2:8、3:7、4:6、6:4、8:2、10:0的甲醇-水梯度洗脱，收集体积为3:7的甲醇-水洗脱物；
[0020]
(6)取浓缩后的体积比为3:7的乙酸乙酯-甲醇洗脱物用半制备型高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水，体积比13:87，得到化合物2。
[0021]
本发明的再一目的是提供所述吡喃酮类化合物(化合物1、化合物2、化合物3和/或化合物4)在抗炎方面的应用，尤其是在制备抗炎药物中的应用，更具体的是在抑制一氧化氮生成方面的抗炎药物中的应用。
[0022]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0023]
本发明以蓝花黄芩内生真菌的发酵物原料制备乙酸乙酯萃取浸膏，然后分离鉴定了四个化学结构新颖的吡喃酮类化合物，分别为化合物1、化合物2、化合物3和化合物4。多种体外活性评价结果表明：化合物1、化合物2、化合物3和化合物4具有抗菌和抗炎活性，可以进一步开发成抗炎药物，具有开发成抗炎药物的前景，尤其是在抑制一氧化氮生成方面的抗炎药物中的应用。
附图说明
[0024]
图1为本发明化合物1、化合物2、化合物3和化合物4的1h-1h cosy、hmbc相关图。
[0025]
图2为本发明化合物1、化合物2、化合物3和化合物4的noesy相关图。
[0026]
图3为本发明化合物1的ecd图。
[0027]
图4为本发明化合物2的ecd图。
[0028]
图5是本发明化合物1、化合物2、化合物3和化合物4的抗炎活性实验结果。
具体实施方式
[0029]
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件。
[0030]
实施例一、吡喃酮类化合物的制备方法
[0031]
本发明所述蓝花黄芩内生真菌ascomycota sp.fae17采集自海南省昌江黎族自治县霸王岭国家级自然保护区珍稀药用植物蓝花黄芩的花部位。蓝花黄芩内生真菌菌种经测序公司(青岛鹏翔生物科技有限公司)进行鉴定，将得到的碱基序列在genbank数据库中进行相似性对比，再运用blast程序搜索同源性序列进行对比，序列相似度为99％，确定fae-17菌株为子囊属真菌(ascomycotasp.)。
[0032]
将ascomycota sp.fae17菌株从4℃冰箱中取出于室温下活化，转接到pda培养基上，放在28℃恒温培养箱中培养，2-3天后观察其生长情况，再将该菌转接至装有马铃薯葡萄糖液体养基的三角瓶中，放置在室温摇床中摇荡培养2-3天，观察种子菌液的生长情况；将种子菌液在超净台中转接到高温灭菌的大米培养基锥形瓶中，接种150瓶，室温静置培养5周，得到发酵物；大米固体培养基为：大米90g/瓶，水120ml/瓶，容量为1000ml的锥形瓶，共接种150瓶。
[0033]
将发酵物用等体积的乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液后减压浓缩得到乙酸乙酯萃取浸膏160.0g。
[0034]
将乙酸乙酯萃取浸膏经硅胶柱色谱粗分离，分别按体积比9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、3:7、2:8、1:9、0:1进行石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱和体积比9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、1:1进行乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集体积比为9:1、8:2、7:3的乙酸乙酯-甲醇洗脱物；
[0035]
合并体积比为9:1、8:2、7:3的乙酸乙酯-甲醇洗脱物后进行反相硅胶柱层析，用体
积比为1:9、2:8、3:7、4:6、6:4、8:2、10:0的甲醇-水梯度洗脱，收集体积为1:9的甲醇-水洗脱物。
[0036]
取体积为1:9的甲醇-水洗脱物进行正相硅胶柱层析，用体积比为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、3:7进行乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，分别收集体积比为9:1和8:2的乙酸乙酯-甲醇洗脱物进行浓缩；
[0037]
取浓缩后的体积比为9:1的乙酸乙酯-甲醇洗脱物用半制备型高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水，体积比8:92，得到化合物1(20.1mg)、化合物3(1.2mg)和化合物4(1.7mg)；
[0038]
取浓缩后的体积比为8:2的乙酸乙酯-甲醇洗脱物进行反相硅胶柱层析，用体积比为1:9、2:8、3:7、4:6、6:4、8:2、10:0的甲醇-水梯度洗脱，收集体积为3:7的甲醇-水洗脱物。
[0039]
取浓缩后的体积比为3:7的乙酸乙酯-甲醇洗脱物用半制备型高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水，体积比13:87，得到化合物2(4.6mg)。
[0040]
结构确证：通过旋光光谱、紫外(uv)光谱、红外(ir)光谱、核磁共振(nmr)谱和质谱(ms)等多种现代波谱技术及量子化学ecd计算方法综合解析，所得1hnmr和
13
c nmr(400/100mhz,dmso-d6)数据如表1、表2所示，确定了化合物1、化合物2、化合物3和化合物4的化学结构：
[0041]
化合物1：淡黄色油状物；uv(meoh)λ
max
[logε/(l
·
mol-1
·
cm-1
)]:249(2.30)nm；ir(kbr)ν
max
:1710cm-1
,1622cm-1
；hr-esi-ms m/z 251.0877[m+na]
+
(calcd for c
11h16
o5na,251.0890)。碳氢二维相关信号如图1(1h-1h cosy、hmbc图)所示。相对构型如图2所示，通过化合物1中h-5与h-10相关确定了化合物1的相对构型，通过cd测试和ecd计算确定其绝对构型。对比化合物1的cd测试谱图和ecd计算谱图(图3)，发现cotton效应十分吻合，即化合物1的绝对构型为5r,8r并命名为ascomycopyronea。
[0042]
化合物2：黄色油状物；uv(ch3oh)λ
max
[logε/(l
·
mol-1
·
cm-1
)]:249(2.66),300(0.43)nm；ir(kbr)ν
max
:1710cm-1
,1621cm-1
；hr-esi-ms m/z 391.1349[m+na]
+
(calcd for c
18h24
o8na,391.1349)。碳氢二维相关信号如图1(1h-1h cosy、hmbc图)所示。相对构型如图2所示，通过化合物2中h-5(δh2.49)与h-10(δh 0.93)相关，h-5
′
(δh 2.86/4.38)与h-10
′
(δh 15.7)相关推测该化合物2存在4种相对构型，对其进行结构dp4+计算，结果显示5r,8r,5r,8r-20构型完全吻合，再进一步通过ecd计算谱图(图4)确定了化合物2的绝对构型并命名为ascomycopyrone b。
[0043]
化合物3：无色油状物；uv(meoh)λ
max
[logε/(l
·
mol-1
·
cm-1
)]:241(2.45)nm；ir(kbr)ν
max
:3446cm-1
,1622cm-1
；hr-esi-ms m/z 337.1608[m+na]
+
(calcd for c
16h26
o6na,337.1622)。碳氢二维相关信号如图1(1h-1h cosy、hmbc图)所示。相对构型如图2所示，通过化合物3中h-5(δh 2.44)与h-10(δh 0.89)相关，h-6
′
(δh 0.97)与h-2
′
(δh 4.58)、h-4
′
(δh 1.59)相关,h-3
′
(δh 1.80)与h-7
′
(δh 3.54)相关确定了化合物3的相对构型并命名为ascomycopyrone c。
[0044]
化合物4：无色油状物；uv(meoh)λ
max
[logε/
(l
·
mol-1
·
cm-1
)]:248(2.29)nm；ir(kbr)ν
max
:3453cm-1
,1620cm-1
；hr-esi-ms m/z 337.1604[m+na]
+
(calcd for c
16h26
o6na,337.1622)。碳氢二维相关信号如图1(1h-1h cosy、hmbc图)所示。相对构型如图2所示，通过化合物4中h-5(δh 2.44)与h-10(δh 0.91)相关，h-3
′
(δh 1.57)与h-6
′
(δh 1.34),h-8
′
(δh 0.99)与h-6
′
(δh 1.34)相关确定了化合物4的相对构型并命名为ascomycopyrone d。
[0045]
表1化合物1和化合物2的1hnmr和
13
cnmr(400/100mhz,dmso-d6)数据
[0046][0047]
表2化合物3和化合物4的1h nmr和
13
c nmr(400/100mhz,dmso-d6)数据
[0048]
[0049][0050]
实施例二、吡喃酮类化合物的制备方法
[0051]
将ascomycota sp.fae17菌株从4℃冰箱中取出于室温下活化，转接到马铃薯葡萄糖固体培养基上，放在28℃恒温培养箱中培养，2-3天后观察其生长情况，再将该菌转接至装有马铃薯葡萄糖液体养基的三角瓶中，放置在室温摇床中摇荡培养2-3天，观察种子菌液的生长情况；将种子菌液在超净台中转接到高温灭菌的大米培养基锥形瓶中，接种300瓶，室温静置培养5周，得到发酵物；其中，大米固体培养基为：大米90g/瓶，水120ml/瓶，容量为1000ml的锥形瓶，共接种300瓶。
[0052]
将得到的发酵物用等体积的乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液后减压浓缩得到乙酸乙酯萃取浸膏310.0g。
[0053]
将乙酸乙酯萃取浸膏经硅胶柱色谱粗分离，分别按体积比9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、3:7、2:8、1:9、0:1进行石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱和体积比9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、1:1进行乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集体积比为9:1、8:2、7:3的乙酸乙酯-甲醇洗脱物；
[0054]
合并体积比为9:1、8:2、7:3的乙酸乙酯-甲醇洗脱物后进行反相硅胶柱层析，用体积比为1:9、2:8、3:7、4:6、6:4、8:2、10:0的甲醇-水梯度洗脱，收集体积为1:9的甲醇-水洗脱物。
[0055]
取体积为1:9的甲醇-水洗脱物进行正相硅胶柱层析，用体积比为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、3:7进行乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，分别收集体积比为9:1和8:2的乙酸乙酯-甲醇洗脱物进行浓缩；
[0056]
取浓缩后的体积比为9:1的乙酸乙酯-甲醇洗脱物用半制备型高效液相色谱分离，
流动相为乙腈-水，体积比8:92，得到化合物1(40.6mg)、3(2.3mg)、4(3.5mg)(结构确证数据与实施例一相同)；
[0057]
取浓缩后的体积比为8:2的乙酸乙酯-甲醇洗脱物进行反相硅胶柱层析，用体积比为1:9、2:8、3:7、4:6、6:4、8:2、10:0的甲醇-水梯度洗脱，收集体积为3:7的甲醇-水洗脱物。
[0058]
取浓缩后的体积比为3:7的乙酸乙酯-甲醇洗脱物用半制备型高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水，体积比13:87，得到化合物2(9.5mg)(结构确证数据与实施例一相同)。
[0059]
本发明实施例一所得的吡喃酮类化合物的抗炎活性研究：
[0060]
实验方法：
[0061]
(1)采用mtt比色法对小鼠巨噬细胞raw 264.7进行细胞毒活性筛选，取对数生长期的raw细胞10μl放入计数板中计数，使每孔细胞数约为5000-10000。96孔板外围一圈中加入100μlpbs溶液，在剩余的每个孔中接种100μl细胞液，并孵育24小时，使细胞贴壁生长。将制备好的样品溶液从高浓度到低浓度依次加入，每孔终浓度分别为100μmol/l、10μmol/l、1μmol/l，空白组加入pbs溶液，然后放入恒温二氧化碳培养箱中48小时后，取出培养细胞，每孔加入10μl预先室温解冻的mtt，放入培养箱中4小时后取出96孔板，倒去上清液，并将多余的液体在纸巾上吸干，每孔加入150μl dmso，避光摇晃溶解甲臜紫色晶体，取下板盖，用酶标仪测定在490、570、630nm处的吸光值。密度值(od)，在570nm波长处处理数据，根据公式1-(od sample/od control)
×
100％计算细胞抑制率。
[0062]
(2)取对数期生长期细胞，制成细胞悬液并计数，以2x 105细胞/孔接种于96孔板，置于5％co2，37℃培养箱培养24h。次日每孔更换加入对raw细胞无毒性的单体化合物(终浓度6.25～50μm)和地塞米松以及等体积的dmso预处理1h，之后除空白对照组外再加入lps(2μg/ml)刺激，继续培养24h。培养终点收取细胞上清液。
[0063]
用griess法检测no释放量:测定no含量前，先将griessreagent i和ⅱ恢复至室温，用无血清的dmem培养基稀释标准品，其浓度分别是:0、1、2、5、10、20、40、60、和100μm。取标准品和待测样品上清各50μl，加到新96孔板，标准品组、空白组、lp组、样品组、阳性药组中每个样品分别设三个复孔。避光向每孔加入50μl griessreagent i，轻拍96孔板使之充分混合，反应5min后再加入griessreagent ii轻轻振荡使孔内液体充分混合均匀，用酶标仪在540nm处测吸光值。代入亚硝酸盐标注曲线计算no含量并计算化合物对lps活化的raw264.7细胞产生no的抑制率，结果见图5。
[0064]
no生成抑制率％＝(lps组-样品组)/(lps组空白组)
×
100％。
[0065]
抗炎活性测试结果显示，在50μm时化合物1、化合物2、化合物3和化合物4对lps诱导的raw 264.7细胞所产生的no均有不同程度的抑制作用，有一定的抗炎活性作用。
[0066]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种吡喃酮类化合物，其特征在于，所述吡喃酮类化合物为化合物1、化合物2、化合物3和/或化合物4，其化学结构分别如下：3 r1＝β-h，r2＝β-ch3，r3＝β-ch(ch3)-β-oh4 r1＝α-ch3，r2＝β-ch2oh，r3＝α-ch
3。
2.如权利要求1所述的吡喃酮类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：制备ascomycota sp.fae17菌株的发酵物；s2：将步骤s1得到的发酵物用等体积的乙酸乙酯萃取，减压浓缩萃取液得到乙酸乙酯萃取浸膏；s3：将步骤s2得到的乙酸乙酯萃取浸膏进行柱色谱分离纯化，得到化合物1、化合物2、化合物3和化合物4。3.如权利要求2所述的吡喃酮类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤s1包括以下步骤：将所述ascomycota sp.fae17菌株转接到pda培养基上培养，再转接到装有马铃薯葡萄糖液体养基的三角瓶中，摇荡培养，得到种子菌液，将种子菌液转接到高温灭菌的大米培养基锥形瓶中静置发酵得到发酵物。4.如权利要求2所述的吡喃酮类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤s3包括以下步骤：(1)将乙酸乙酯萃取浸膏经硅胶柱色谱粗分离，分别按体积比为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、3:7、2:8、1:9、0:1进行石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱和体积比为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、1:1进行乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集体积比为9:1、8:2、7:3的乙酸乙酯-甲醇洗脱物；(2)合并体积比为9:1、8:2、7:3的乙酸乙酯-甲醇洗脱物后进行反相硅胶柱层析，用体积比为1:9、2:8、3:7、4:6、6:4、8:2、10:0的甲醇-水梯度洗脱，收集体积为1:9的甲醇-水洗脱物；(3)将所得甲醇-水洗脱物进行正相硅胶柱层析，用体积比为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、3:7进行乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，分别收集体积比为9:1和8:2的乙酸乙酯-甲醇洗脱物进行浓缩；(4)取浓缩后的体积比为9:1的乙酸乙酯-甲醇洗脱物用半制备型高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水，体积比8:92，得到化合物1、化合物3和化合物4；(5)取浓缩后的体积比为8:2的乙酸乙酯-甲醇洗脱物进行反相硅胶柱层析，用体积比为1:9、2:8、3:7、4:6、6:4、8:2、10:0的甲醇-水梯度洗脱，收集体积为3:7的甲醇-水洗脱物；
(6)取浓缩后的体积比为3:7的乙酸乙酯-甲醇洗脱物用半制备型高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水，体积比13:87，得到化合物2。5.如权利要求1所述的吡喃酮类化合物在抗炎方面的应用。6.如权利要求5所述的吡喃酮类化合物在制备抗炎药物中的应用。7.如权利要求6所述的吡喃酮类化合物在抑制一氧化氮生成方面的抗炎药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于内生真菌来源的吡喃酮类化合物及其制备方法和应用，所述吡喃酮类化合物来源于蓝花黄芩内生真菌Ascomycotasp.FAE17菌株，经菌株发酵物制备、发酵物经乙酸乙酯萃取后减压浓缩萃取液得到乙酸乙酯萃取浸膏，经柱色谱分离纯化得到吡喃酮类化合物，分别为化合物1、化合物2、化合物3和/或化合物4。所述吡喃酮类化合物经多种体外活性评价结果表明：上述吡喃酮类化合物具有抗菌和抗炎活性，可以进一步开发成抗炎药物，具有开发成抗炎药物的前景，尤其是在抑制一氧化氮生成方面的抗炎药物中的应用。氮生成方面的抗炎药物中的应用。氮生成方面的抗炎药物中的应用。


技术研发人员：陈文豪 杨健妮 韩长日 惠阳 陈光英 宋小平 陈朝霞
受保护的技术使用者：海南师范大学
技术研发日：2023.07.12
技术公布日：2023/10/8