一种高发酵度酵母的快速筛选方法、试剂盒及其应用与流程

1.本发明属于酵母筛选领域，尤其涉及一种高发酵度酵母的快速筛选方法、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.高发酵度啤酒的生产方法主要分为两类，一类是先通过调整糖化工艺、外添加酶等进行糖化，得到高可发酵性糖含量的麦汁，再通过酵母发酵得到高发酵度啤酒，这种方法比较常见；第二类是糖化工艺不改变，仅采用高发酵度的酵母进行发酵，得到高发酵度啤酒。
3.目前，对于高发酵度酵母的筛选通常有两种方法，一是通过酵母生理生化检测糖利用能力；二是通过发酵试验。这两种筛选方法都存在接种培养或发酵过程，耗时较长，一般需要3-14天，无法实现高发酵度酵母的快速筛选。
4.基于传统筛选方法存在的上述问题，亟需开发一种操作简便、高效、耗时短且不需要进行生理生化检测及发酵试验即可进行高发酵度酵母快速筛选的方法。


技术实现要素：

5.本发明针对传统高发酵度酵母的筛选方法存在需要经过接种培养、生理生化检测或发酵过程，导致耗时较长的技术问题，提出一种操作简便、准确性高、耗时短且无需进行生理生化检测及发酵试验的即可实现高发酵度酵母快速筛选的方法。
6.为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
7.一种高发酵度酵母的快速筛选方法，以sta1基因作为检测对象，通过检测待检酵母中是否含有sta1基因筛选出高发酵度酵母。
8.在一实施方式中，所述检测对象还包括sta1基因的启动子。
9.在一实施方式中，包括引物设计步骤：
10.以所述sta1基因作为模板设计得到多对引物，记为引物对a和引物对b；
11.以所述sta1基因的启动子作为模板设计得到一对引物，记为引物对c；
12.其中，所述引物对a包括sd-5a和sd-6b，所述sd-5a和sd-6b的序列分别如seq id no.1-2所示；所述引物对b包括sdia-f和sdia-r，所述sdia-f和sdia-r的序列分别如seq id no.3-4所示；所述引物对c包括sta1 uas fw和sta1 uas rv，所述sta1 uas fw和sta1 uas rv的序列分别如seq id no.5-6所示。
13.在一实施方式中，所述引物对a、引物对b以及引物对c的pcr扩增产物分别为868bp、79bp和599bp。
14.在一实施方式中，在所述引物设计步骤之后，还包括引物筛选步骤以及验证步骤：
15.其中，引物筛选步骤为：
16.提取几株酵母的基因组dna备用；
17.分别以所述引物对a、引物对b和引物对c作为引物，以酵母的基因组dna作为反应
模板进行pcr扩增反应，分别得到引物对a的pcr扩增产物、引物对b的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物；
18.将所述引物对a的pcr扩增产物、引物对b的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结合电泳条带差异度与整齐度，初步确定以所述引物对a作为检测sta1基因的引物对，以引物对c作为检测sta1基因启动子的引物对；
19.所述验证步骤为：
20.将所述引物筛选步骤用到的几株酵母进行发酵试验，分别制备得到冷贮酒，检测并记录其实际发酵度；
21.通过对比几株酵母的实际发酵度和这几株酵母中的sta1基因及启动子检测结果，以验证准确性。
22.在一实施方式中，在所述引物筛选步骤以及验证步骤之后，还包括高发酵度酵母筛选步骤：
23.提取待检酵母的基因组dna备用；
24.分别以所述引物对a和引物对c作为引物，以所述待检酵母的基因组dna作为反应模板分别进行pcr扩增反应，得到引物对a的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物；
25.对所述引物对a的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，根据条带结果筛选出高发酵度酵母。
26.在一实施方式中，所述高发酵度酵母的筛选标准为：
27.当所述引物对a的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物的电泳结果中均出现条带，且引物对a和引物对c的条带分别为868bp和599bp时，表明所述待检酵母为高发酵度酵母；
28.当所述引物对a的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物的电泳结果中均未出现条带；或
29.当所述引物对a的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物的电泳结果中仅出现一个条带；或
30.当所述引物对a的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物的电泳结果中均出现条带，但引物对a的条带并非868bp或者引物对c的条带并非599bp时，均表明所述待检酵母并非高发酵度酵母。
31.在一实施方式中，所述pcr扩增反应体系为：
32.taqmix 25微升、引物对a/引物对b/引物对c 2微升/每条引物、酵母基因组dna 1微升以及ddh2o 20微升，共计50微升；
33.所述pcr扩增反应程序为：
34.s1、95℃预变性，3min；
35.s2、95℃变性30s，50-60℃退火，30s，72℃延伸1min，30个循环；
36.s3、72℃延伸10min；
37.其中，所述引物对a、引物对b以及引物对c的退火温度分别为50℃、60℃和55℃。
38.本发明还提供一种用于快速筛选高发酵度酵母的试剂盒，包含上述任一实施方式所述的引物对a和引物对c以及taqmix。
39.在一实施方式中，所述试剂盒用于高发酵度酵母快速筛选与鉴定。
40.与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
41.1、本发明提供一种高发酵度酵母的快速筛选方法，该方法以sta1基因及其启动子作为检测对象，通过检测待检酵母中是否含有sta1基因及其启动子从而筛选出高发酵度酵母，该方法无需进行生理生化检测以及发酵试验就能够实现高发酵度酵母的快速筛选，5小时内即可完成筛选过程；
42.2、本发明提供一种高发酵度酵母的快速筛选方法，通过筛选优化出适用于检测sta1基因的引物，同时结合pcr产物电泳结果建立一套完整地高发酵度酵母的评价标准，能进一步提高检测的准确性；
43.3、本发明提供一种高发酵度酵母的快速筛选方法，利用该方法可不通过生理生化检测及发酵试验，仅通过关键基因检测对酵母进行快速分类，筛选出可使用常规糖化工艺，仅通过发酵直接生产高发酵度啤酒的酵母；
44.4、本发明还提供一种用于快速筛选高发酵度酵母的试剂盒，利用该试剂盒能够实现高发酵度酵母的快速、准确筛选。
附图说明
45.图1为本发明实施例所提供的基于引物对a的pcr扩增产物电泳结果；
46.图2为本发明实施例所提供的基于引物对b的pcr扩增产物电泳结果；
47.图3为本发明实施例所提供的基于引物对c的pcr扩增产物电泳结果。
48.以上各图中：
49.最右侧加样孔为marker，从上到下条带信息分别为5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。
具体实施方式
50.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
51.本发明实施例提供了一种高发酵度酵母的快速筛选方法，以sta1基因作为检测对象，通过检测待检酵母中是否含有sta1基因筛选出高发酵度酵母。
52.在一具体实施方式中，检测对象还包括sta1基因的启动子。
53.上述实施方式中，提供一种高发酵度酵母的快速筛选方法，只需要对sta1基因(胞外葡糖淀粉酶编码基因，与酵母麦芽四糖及以上糖的利用能力相关)及启动子进行检测，就能够快速、准确的筛选出高发酵度酵母。该方法无需像传统高发酵度酵母筛选方法那样需要经过接种培养、生理生化检测或发酵过程，一般需要耗时3-14天才能够筛选出高发酵度酵母。
54.进一步的，上述高发酵度酵母的快速筛选方法具体包括以下步骤：
55.s1、引物设计步骤：
56.以sta1基因作为模板设计得到多对引物，记为引物对a和引物对b；
57.以sta1基因的启动子作为模板设计得到一对引物，记为引物对c；
58.其中，引物对a包括sd-5a和sd-6b，sd-5a和sd-6b的序列分别如seq id no.1-2所示；所述引物对b包括sdia-f和sdia-r，所述sdia-f和sdia-r的序列分别如seq id no.3-4所示；所述引物对c包括sta1 uas fw和sta1 uas rv，所述sta1 uas fw和sta1 uas rv的序列分别如seq id no.5-6所示；
59.在上述s1步骤中，引物对a、引物对b以及引物对c的pcr扩增产物分别为868bp、79bp和599bp。
60.s2、引物筛选步骤：
61.提取几株酵母的基因组dna备用；
62.分别以所述引物对a、引物对b和引物对c作为引物，以酵母的基因组dna作为反应模板进行pcr扩增反应，分别得到引物对a的pcr扩增产物、引物对b的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物；
63.将所述引物对a的pcr扩增产物、引物对b的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结合电泳条带差异度与整齐度，初步确定以所述引物对a作为检测sta1基因的引物对，以引物对c作为检测sta1基因启动子的引物对；
64.s3、验证步骤：
65.将引物筛选步骤用到的几株酵母进行发酵试验，分别制备得到冷贮酒，检测并记录其实际发酵度；
66.通过对比几株酵母的实际发酵度和这几株酵母中的sta1基因及启动子检测结果，以验证准确性；
67.s4、高发酵度酵母筛选步骤：
68.提取待检酵母的基因组dna备用；
69.分别以所述引物对a和引物对c作为引物，以所述待检酵母的基因组dna作为反应模板分别进行pcr扩增反应，得到引物对a的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物；
70.对所述引物对a的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，根据条带结果筛选出高发酵度酵母。
71.在上述s4步骤中，基于不同酵母的电泳结果进行高发酵度酵母的筛选，其中，高发酵度酵母的筛选标准为：
72.当所述引物对a的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物的电泳结果中均出现条带，且引物对a和引物对c的条带分别为868bp和599bp时，表明所述待检酵母为高发酵度酵母；
73.当所述引物对a的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物的电泳结果中均未出现条带；或
74.当所述引物对a的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物的电泳结果中仅出现一个条带；或
75.当所述引物对a的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物的电泳结果中均出现条带，但引物对a的条带并非868bp或者引物对c的条带并非599bp时，均表明所述待检酵母并非高发酵度酵母。
76.在一具体实施方式中，所述pcr扩增反应体系为：
77.taqmix 25微升、引物对a/引物对b/引物对c 2微升/每条引物、酵母基因组dna 1
微升以及ddh2o 20微升，共计50微升；
78.所述pcr扩增反应程序为：
79.s1、95℃预变性，3min；
80.s2、95℃变性30s，50-60℃退火，30s，72℃延伸1min，30个循环；
81.s3、72℃延伸10min；
82.其中，所述引物对a、引物对b以及引物对c的退火温度分别为50℃、60℃和55℃。
83.本发明提供一种用于快速筛选高发酵度酵母的试剂盒，包含上述任一实施方式所述的引物对a和引物对c以及taqmix。
84.在一具体实施方式中，所述试剂盒用于高发酵度酵母快速筛选与鉴定。
85.为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的一种高发酵度酵母的快速筛选方法、试剂盒及其应用，下面将结合具体实施例进行描述。
86.实施例1
87.本实施例提供一种用于快速筛选高发酵度酵母的引物筛选方法，具体为：
88.(1)以sta1基因(genbank id：x02649.1)作为模板设计得到多对引物，记为引物对a和引物对b，以sta1基因的启动子作为模板设计得到一对引物，记为引物对c，引物序列如见下表：
89.表1引物序列信息
[0090][0091]
(2)选取9株酵母(分别编号11#、12#、13#、14#、15#、16#、17#、18#、19#)，分别提取这9株酵母的基因组dna；
[0092]
(3)分别以引物对a、引物对b和引物c作为引物，以上述9株酵母的基因组dna作为反应模板进行pcr扩增反应，分别得到引物对a的pcr扩增产物、引物对b的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物；
[0093]
(4)将引物对a的pcr扩增产物、引物对b的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，结合电泳条带差异度与整齐度，以及酵母的实际发酵度，最终选择引物对a作为检测sta1基因的引物对，其中引物对a、引物对b和引物对c的电泳结果分别如图1-3所示；
[0094]
结果分析：通过分析图1所示的电泳结果可知，利用引物对a(sd-5a和sd-6b)进行pcr扩增反应所得的扩增产物在上述9株酵母中的电泳结果为：15#、17#和19#酵母中出现
868bp的条带，11#、12#、13#、14#、16#、18#酵母中未见任何条带。
[0095]
通过分析图2所示的电泳结果可知，利用引物对b(sdia-f和sdia-r)进行pcr扩增反应所得的扩增产物在上述9株酵母中有以下三种情况出现：11#酵母中不存在条带；15#、17#、19#酵母存在79bp的条带；12#、13#、14#、16#、18#酵母存在约1300bp的条带，可见，利用引物对b进行pcr扩增的条带位置存在差异，不利于进行快速、有效判断。
[0096]
通过分析图3所示的电泳结果可知，利用引物对c(sta1 uas fw和sta1uas rv)进行pcr扩增反应所得的扩增产物在上述9株酵母中的电泳结果为：15#、17#和19#酵母中出现599bp的条带，11#、12#、13#、14#、16#、18#酵母中未见任何条带。
[0097]
综合上述结果，一方面，本发明初步选择引物对a作为检测酵母中sta1基因的引物对，选择引物对c作为检测酵母中sta1基因启动子的引物对；另一方面，从sta1基因及sta1启动子的检测情况来看，15#、17#、19#酵母中存在sta1基因及其启动子。可以初步确定使用15#、17#、19#酵母可生产高发酵度啤酒。
[0098]
实施例2
[0099]
本实施例提供一种验证试验，目的是为了验证通过sta1基因及其启动子筛选高发酵度酵母的可行性，具体为：
[0100]
基于实施例1所得检测结果，本实施例将实施例1所示的9株酵母(分别编号11#、12#、13#、14#、15#、16#、17#、18#、19#)进行发酵试验，发酵条件如下：
[0101]
利用13
°
p麦汁进行发酵，其中麦汁极限发酵度为71.5％，满罐酵母数2.0*107个/ml，12℃发酵14天，分别得到利用上述9株酵母发酵所得的冷贮酒，再对冷贮酒进行发酵度检测，测定结果如下：
[0102]
表2冷贮酒发酵度测定结果
[0103]
冷贮酒编号对应的酵母菌株编号发酵度/％111#66.36212#68.77313#70.60414#70.11515#73.87616#70.65717#74.52818#70.12919#76.30
[0104]
基于上表所示的发酵度测定结果可知：与其他几株酵母相比，在原麦汁浓度13
°
p时，利用15#、17#、19#酵母发酵所得的冷贮酒发酵度更高，分别为73.87％、74.52％和76.30％，基于上述发酵试验能够证明通过检测酵母的sta1基因及其启动子，如果酵母存在sta1基因及其启动子可以判断该酵母为高发酵度酵母。

技术特征：
1.一种高发酵度酵母的快速筛选方法，其特征在于，以sta1基因作为检测对象，通过检测待检酵母中是否含有sta1基因筛选出高发酵度酵母。2.根据权利要求1所述的高发酵度酵母的快速筛选方法，其特征在于，所述检测对象还包括sta1基因的启动子。3.根据权利要求2所述的高发酵度酵母的快速筛选方法，其特征在于，包括引物设计步骤：以所述sta1基因作为模板设计得到多对引物，记为引物对a和引物对b；以所述sta1基因的启动子作为模板设计得到一对引物，记为引物对c；其中，所述引物对a包括sd-5a和sd-6b，所述sd-5a和sd-6b的序列分别如seq id no.1-2所示；所述引物对b包括sdia-f和sdia-r，所述sdia-f和sdia-r的序列分别如seq id no.3-4所示；所述引物对c包括sta1 uas fw和sta1 uas rv，所述sta1 uas fw和sta1 uas rv的序列分别如seq id no.5-6所示。4.根据权利要求3所述的高发酵度酵母的快速筛选方法，所述引物对a、引物对b以及引物对c的pcr扩增产物分别为868bp、79bp和599bp。5.根据权利要求3所述的高发酵度酵母的快速筛选方法，其特征在于，在所述引物设计步骤之后，还包括引物筛选步骤以及验证步骤：其中，引物筛选步骤为：提取几株酵母的基因组dna备用；分别以所述引物对a、引物对b和引物对c作为引物，以酵母的基因组dna作为反应模板进行pcr扩增反应，分别得到引物对a的pcr扩增产物、引物对b的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物；将所述引物对a的pcr扩增产物、引物对b的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结合电泳条带差异度与整齐度，初步确定以所述引物对a作为检测sta1基因的引物对，以引物对c作为检测sta1基因启动子的引物对；所述验证步骤为：将所述引物筛选步骤用到的几株酵母进行发酵试验，分别制备得到冷贮酒，检测并记录其实际发酵度；通过对比几株酵母的实际发酵度和这几株酵母中的sta1基因及启动子检测结果，以验证准确性。6.根据权利要求5所述的高发酵度酵母的快速筛选方法，其特征在于，在所述引物筛选步骤以及验证步骤之后，还包括高发酵度酵母筛选步骤：提取待检酵母的基因组dna备用；分别以所述引物对a和引物对c作为引物，以所述待检酵母的基因组dna作为反应模板分别进行pcr扩增反应，得到引物对a的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物；对所述引物对a的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，根据条带结果筛选出高发酵度酵母。7.根据权利要求6所述的高发酵度酵母的快速筛选方法，其特征在于，所述高发酵度酵母的筛选标准为：当所述引物对a的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物的电泳结果中均出现条带，且
引物对a和引物对c的条带分别为868bp和599bp时，表明所述待检酵母为高发酵度酵母；当所述引物对a的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物的电泳结果中均未出现条带；或当所述引物对a的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物的电泳结果中仅出现一个条带；或当所述引物对a的pcr扩增产物和引物对c的pcr扩增产物的电泳结果中均出现条带，但引物对a的条带并非868bp或者引物对c的条带并非599bp时，均表明所述待检酵母并非高发酵度酵母。8.根据权利要求5或7所述的高发酵度酵母的快速筛选方法，其特征在于，所述pcr扩增反应体系为：taqmix 25微升、引物对a/引物对b/引物对c 2微升/每条引物、酵母基因组dna 1微升以及ddh2o 20微升，共计50微升；所述pcr扩增反应程序为：s1、95℃预变性，3min；s2、95℃变性30s，50-60℃退火，30s，72℃延伸1min，30个循环；s3、72℃延伸10min；其中，所述引物对a、引物对b以及引物对c的退火温度分别为50℃、60℃和55℃。9.一种用于快速筛选高发酵度酵母的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求2所述的引物对a和引物对c以及taqmix。10.根据权利要求9所述的用于快速筛选高发酵度酵母的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于高发酵度酵母快速筛选与鉴定。

技术总结
本发明提出一种高发酵度酵母的快速筛选方法、试剂盒及其应用，属于酵母筛选领域，能够解决传统高发酵度酵母的筛选方法存在需要经过接种培养、生理生化检测及发酵过程，操作过程繁琐，筛选过程耗时较长的技术问题。其中，本发明所提供的高发酵度酵母的快速筛选方法，以STA1基因及启动子作为检测对象，通过优化用于检测STA1基因及启动子的引物序列、检测待检酵母中是否含有STA1基因及启动子以及建立完整的高发酵度酵母的筛选标准，最终实现高发酵度酵母的高效、准确筛选。本发明能够应用于高发酵度酵母快速筛选方面。酵度酵母快速筛选方面。酵度酵母快速筛选方面。


技术研发人员：尹花 万秀娟 贺扬 赵玉祥 邢磊 胡淑敏 陈嵘 侯晓平 吴杰
受保护的技术使用者：青岛啤酒股份有限公司
技术研发日：2023.07.14
技术公布日：2023/10/8