一种维氏气单胞菌的检测方法与流程

1.本发明涉及细菌检测技术领域，更具体地说，它涉及一种维氏气单胞菌的检测方法。


背景技术：

2.维氏气单胞菌隶属弧菌科(vibrionaceae)气单胞菌属(aeromonas)，维氏气单胞菌(aeromonas veronii)又被称为维罗纳气单胞菌、维隆气单胞菌、凡隆气单胞菌，是一种革兰氏阴性杆状细菌，属无芽孢兼性厌氧型。该菌散在分布，普遍存在于淡水、污水、土壤乃至海水中。细胞两端钝圆，大小约为0.3-0.7μm
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1.2-2.5μm，具鞭毛，能运动。该菌在世界各地均有分布，是人和动物的重要致病菌，由于具有致病潜能的气单胞菌经常在牛奶、自来水和食物中被发现，因此对气单胞菌的检测鉴定具有重要的意义。然而，关于鱼中维氏气单胞菌感染检测的报告相对较少。
3.气单胞菌分子检测的方法主要包括酶联免疫吸附试验(elisa)、免疫荧光技术、常规pcr检测、多重pcr检测、荧光定量pcr检测等。免疫学技术和荧光定量pcr尽管检测灵敏度高，但是由于操作复杂和相对昂贵，实际中较少应用。多重pcr可以同时对多个目的基因片段进行扩增，提高了鉴定结果的准确性，经常被用于病原菌的检测。但都存在操作复杂或者是特异性不强等缺点。
4.维氏气单胞菌(aeromonas veronii)传统检测方法需经细菌分离纯化、革兰氏染色、形态学观察、生理生化指标测定等一系列实验，耗时长且效率低。随着分子生物学技术的发展，新的细菌快速检测方法已广泛应用到病原微生物的鉴定，包括rflp、elisa快速检测法、lamp检测方法、rapd方法、taq man探针法等。但上述方法均存在操作复杂、实验条件要求严苛、易出现假阳性等问题，在实际应用中难以推广。
5.因此，现亟需建立一种灵敏、可靠、特异的方法来快速检测维氏气单胞菌。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种基于cas12a的维氏气单胞菌的检测方法，能够灵敏、可靠、特异地检测维氏气单胞菌，且价格低廉，操作简便，不易出现假阳性。
7.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
8.一种用于维氏气单胞菌检测crrna，该crrna的碱基序列为uacaggauuccagacauguc。
9.一种维氏气单胞菌的检测方法，包括以下3个步骤：
10.s1.提取目标细菌dna；
11.s2.pcr扩增得到目标双链dna；
12.s3.维氏气单胞菌的检测。
13.本发明进一步设置为：所述s1中采用dna试剂盒提取目标细菌的dna。
14.本发明进一步设置为：所述s2中pcr扩增得到目标双链dna具体操作如下：
15.(1)pcr扩增体系：由2.5μl的10
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buffer，2μl的dntp，0.5μl的正向引物，0.5μl的反向引物，0.15μl的rtaq dna聚合酶，1μl的dna模板和18.35μl的双蒸水构成；
16.(2)pcr扩增程序：第一步，在95℃下保持10min；第二步，在94℃下保持30s；第三步，在60℃下保持30s；第四步，在72℃下保持30s；第五步，重复第二、三、四步35次；第六步，在72℃下保持10min；第七步，维持在4℃；最后得到目标双链dna，即dsdna；
17.(3)pcr扩增引物序列：
18.正向引物:gcacctgtgttctgattcccga，
19.反向引物:tttggaggctgtgtccttgaga。
20.本发明进一步设置为：所述s3中维氏气单胞菌的检测具体操作如下：
21.将cas12a基因编辑蛋白0.5μl，cas12a reaction buffer 2.5μl，crrna 2.5μl和荧光报道子fq 2.5μl混合均匀，振荡离心后取8μl加入酶标孔板中，再加入dsdna 2.5μl，最后加入无酶水14.5μl混匀，配制结束后使用多孔酶标仪检测。
22.本发明进一步设置为：所述检测方法最低能够检测到浓度为1.09
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100copies/μl的维氏气单胞菌。
23.综上所述，本发明具有以下有益效果：相较于现有技术而言，本发明能达到的检测限更低，灵敏度更高，可应用于进行快速检测，且检测过程中特异性更强。该方法中的crrna和特异性引物、cas12a之间特异性结合，从而保证了检测结果的准确性，为维氏气单胞菌检测方法的开发奠定了基础；为检测其他微生物以及相关危害病原菌提供了新途径。
附图说明
24.图1是本发明检测方法的工作流程示意图；
25.图2是普通pcr测定维氏气单胞菌的实验结果；
26.图3是荧光定量pcr测定维氏气单胞菌的实验结果；
27.图4是本发明方法测定维氏气单胞菌的实验结果；
28.图5是本发明测定维氏气单胞菌的荧光对比图。
具体实施方式
29.以下结合附图1-5对本发明作进一步详细说明。
30.实施例：一种维氏气单胞菌的检测方法，如图1-5所示，本方法用目标细菌的dna进行pcr扩增，用扩增产物建立cas12a的反应体系，在该反应体系中采用碱基序列为：uacaggauuccagacauguc的crrna检测维氏气单胞菌。
31.从保藏的维氏气单胞菌平皿中挑取菌落形态和长势较好的单菌落接种于装有lb液体培养基的3ml试管中，在30℃恒温振荡摇床中摇菌4-6小时，随时观察试管中的菌液变化，待菌液浑浊时取出；
32.在无菌操作台上，用灭菌接种环蘸取少量菌液，采用“z”字划线或“井”字划线法将菌液接种于lb固体培养基上，用封口膜封口，在30℃恒温培养箱中培养16-24小时，直至长出菌落形态较好，大小适中的单菌落时取出观察并得到纯种的菌株。
33.长出单菌落后，挑取长势较好的单菌落接种于lb液体培养基中，200r/min振荡培养至菌液浑浊取出。在无菌操作台上，用无菌枪头吸取1ml菌液至1.5ml ep管中，根据天根
细菌试剂盒上的操作步骤提取维氏气单胞菌dna，使用nanodrop2000测定dna的浓度和纯度。使用天根细菌试剂盒提取dna，能够更加快速的得到目标dna，并记录数据和保存峰值图，提取到的dna放置于4℃冰箱保存备用。用nanodrop2000测定其浓度后，根据dna浓度和维氏气单胞菌基因组大小换算得到所提取的维氏气单胞菌dna溶液浓度s0为1.09
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107copies/μl,然后按10倍梯度稀释，得到s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7，另外设置阴性对照组nt，s1浓度为1.09
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106copies/μl、s2浓度为1.09
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105copies/μl、s3浓度为1.09
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104copies/μl、s4浓度为1.09
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103copies/μl、s5浓度为1.09
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102copies/μl、s6浓度为1.09
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101copies/μl、s7浓度为1.09
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100copies/μl。
34.配制25μl pcr扩增体系，逐一加入至s0、s1、s2、s3、s4、s5、s6、s7和阴性对照组中，再通过pcr扩增仪扩增，得到目标双链dna，即dsdna，得到的双链dna放置于-20℃冰箱备用。
35.pcr扩增体系如表1所示：
36.表1pcr扩增体系
[0037][0038]
pcr扩增程序如表2所示：
[0039]
表2pcr扩增程序
[0040][0041]
pcr扩增引物序列：
[0042]
正向引物:gcacctgtgttctgattcccga
[0043]
反向引物:tttggaggctgtgtccttgaga。
[0044]
维氏气单胞菌的检测具体操作如下：
[0045]
配制cas12a反应体系，取cas12a基因编辑蛋白0.5μl，cas12areactionbuffer 2.5μl，crrna2.5μl和荧光报道子fq 2.5μl混合均匀，振荡离心后取8μl加入酶标孔板中，共设置9组。再分别向每组加入s0、s1、s2、s3、s4、s5、s6、s7中的dsdna2.5μl和阴性对照组nt中的液体2.5μl，最后每组中均加入无酶水14.5μl混匀，配制结束后使用多孔酶标仪检测。图2为普通pcr测定维氏气单胞菌的实验结果，由图2可知，该方法在s5时只有微弱条带，说明其检
测限大概s5(1.09
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102copies/μl)；图3为荧光定量pcr测定维氏气单胞菌，相对于普通pcr而言，精确度和灵敏度有所提高，检测限能达到s6(1.09
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101copies/μl)；图4为本方法测定维氏气单胞菌的实验结果，由图4可知，本发明所提供的方法在s7(1.09
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100copies/μl)时其荧光值大于阴性对照组，同样图5也可以看出其荧光亮度也比阴性对照组明显，说明本方法的检测限更低，能够达到1.09
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100copies/μl，灵敏度更高，可应用于极低浓度维氏气单胞菌感染的样本检测。
[0046]
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

技术特征：
1.一种用于维氏气单胞菌检测crrna，其特征是：所述crrna的碱基序列为uacaggauuccagacauguc。2.一种维氏气单胞菌的检测方法，其特征是：包括以下步骤：s1.提取目标细菌dna；s2.pcr扩增得到目标双链dna；s3.维氏气单胞菌的检测。3.根据权利要求2所述的一种维氏气单胞菌的检测方法，其特征是：所述s1中采用dna试剂盒提取目标细菌的dna。4.根据权利要求2所述的一种维氏气单胞菌的检测方法，其特征是：所述s2中pcr扩增得到目标双链dna具体操作如下：(1)pcr扩增体系：由2.5μl的10
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buffer，2μl的dntp，0.5μl的正向引物，0.5μl的反向引物，0.15μl的rtaqdna聚合酶，1μl的dna模板和18.35μl的双蒸水构成；(2)pcr扩增程序：第一步，在95℃下保持10min；第二步，在94℃下保持30s；第三步，在60℃下保持30s；第四步，在72℃下保持30s；第五步，重复第二、三、四步35次；第六步，在72℃下保持10min；第七步，维持在4℃；最后得到目标双链dna，即dsdna；(3)pcr扩增引物序列：正向引物:gcacctgtgttctgattcccga，反向引物:tttggaggctgtgtccttgaga。5.根据权利要求2所述的一种维氏气单胞菌的检测方法，其特征是：所述s3中维氏气单胞菌的检测具体操作如下：将cas12a基因编辑蛋白0.5μl，cas12areactionbuffer2.5μl，crrna2.5μl和荧光报道子fq2.5μl混合均匀，振荡离心后取8μl加入酶标孔板中，再加入dsdna2.5μl，最后加入无酶水14.5μl混匀，配制结束后使用多孔酶标仪检测或手持式紫外灯照射观察。6.根据权利要求2所述的一种维氏气单胞菌的检测方法，其特征是：所述检测方法最低能够检测到浓度为1.09
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100copies/μl的维氏气单胞菌。

技术总结
本发明公开了一种维氏气单胞菌的检测方法，涉及细菌检测技术领域，其技术方案要点是：采用的碱基序列为UACAGGAUUCCAGACAUGUC的crRNA检测维氏气单胞菌，先使用DNA试剂盒提取目标细菌的DNA，再进行PCR扩增得到目标双链DNA，再配置Cas12a体系，最后使用酶标仪或手持式紫外灯进行测定，快速检测出维氏气单胞菌。该方法能够灵敏、可靠、特异地检测维氏气单胞菌，且价格低廉，操作简便，不易出现假阳性。不易出现假阳性。不易出现假阳性。


技术研发人员：段彦辉 陈艳
受保护的技术使用者：国科大杭州高等研究院
技术研发日：2023.07.24
技术公布日：2023/10/15