一种尿液中双酚类物质测定的方法与流程

1.本发明属于检测技术领域，具体涉及一种尿液中双酚类物质测定的方法。


背景技术：

2.双酚类化合物(bps)是一类结构相似(具有两个羟苯基)的物质，主要包括双酚a(bpa)、双酚f(bpf)、双酚s(bps)、双酚p(bpp)、双酚af(bpaf)、双酚ap(bpap)等，由于在生产和生活中的广泛使用，bps已成为一种典型环境污染物，在空气、水、土壤、化妆品、食品等中广泛被检出，并可通过呼吸道、消化道和皮肤等多种途径进入人体内产生多种健康危害效应，如干扰生物体的正常生理代谢功能，影响生殖和发育功能。研究也表明一些双酚类化合物也具有神经毒性、心血管毒性和细胞与基因毒性。因此，包括我国在内的多个国家对双酚a、双酚b、双酚s、双酚f的使用都进行了限制。虽然法规限制了这几种典型的双酚类化合物在日常用品中的使用，但因其具有的难以在环境中降解、易在生物体内富集的特点，仍然可以通过食物链在种群间进行传递，对人体健康带来潜在的风险。同时，其他正在使用的、未受广泛关注的双酚类物质的安全性尚无有效的科学评估。因此，开展双酚类物质对人体的安全性问题研究已成为公共卫生领域关注的焦点。
3.双酚类物质进入人体后，流经血液、肝脏和肾脏，尿液是主要的排泄途径之一。尿液作为一种无创可得的生物样本，在生物标志物研究中备受瞩目和广泛使用。然而，目前国内外尚无人体尿液中双酚类物质检测的标准方法，文献报道的检测方法主要有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-串联质谱法、酶联免疫吸附测定法、生物传感器法等，但由于bps含有酚羟基，属于中等极性，沸点较高，适合液相色谱分析，但液相色谱法灵敏度较低，仅依靠保留时间定性，容易出现假阳性；采用气相色谱-质谱法分析需要进行衍生化操作，费事费力。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提供了一种尿液中双酚类物质测定的方法。
5.本发明的技术方案如下：
6.本发明提供了一种尿液中双酚类物质测定的方法，包括如下步骤：
7.s1、系列标准工作溶液的配制：分别精确称取8种双酚类物质标准品及2种内标物质标准品溶解并定容，配制成含有内标物质的系列标准工作溶液；
8.s2、待测样品溶液的配制：待测的尿液样品加入2种内标物质，经酶解、离心取上清液、净化、浓缩、复溶后，过尼龙滤膜，得到待测样品溶液；
9.s3、hplc-ms/ms检测：将步骤s1的含有内标物质的系列标准工作溶液依次注入液相色谱质谱联用仪中分析，以双酚类物质的峰面积除以对应的内标物质的峰面积为纵坐标，双酚类物质的质量浓度为横坐标绘制标准工作曲线，在相同检测条件下，检测步骤s2的待测样品溶液，结果代入标准工作曲线，即可求得待测尿液样品中双酚类物质的含量；
10.所述8种双酚类物质为：双酚a、双酚f、双酚s、双酚p、双酚af、双酚ap、双酚z、四溴
双酚a-双(2,3-二溴丙基醚)；
11.所述2种内标物质为：四溴双酚a-d
10
、双酚a-d
16
；
12.双酚s、双酚f、双酚a、双酚af对应的内标物质为双酚a-d
16
，双酚ap、双酚z、双酚p、四溴双酚a-双(2,3-二溴丙基醚)对应的内标物质为四溴双酚a-d
10
。
13.在本发明的一个具体实施方式中，步骤s1中溶解、稀释以及步骤s2中复溶均用甲醇。
14.在本发明的一个具体实施方式中，步骤s1中，系列标准工作溶液中2种内标物质的浓度均为2.5ng/ml；系列标准工作溶液中8种双酚类物质的浓度均为0.25ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml。
15.在本发明的一个具体实施方式中，步骤s2中，待测的尿液样品加入2种内标物质后，2种内标物质在待测的尿液样品中的浓度均为5ng/ml。
16.在本发明的一个具体实施方式中，步骤s2中，酶解的步骤为：加入与待测的尿液样品等体积的ph值为5.0的乙酸铵缓冲液，再加入β-葡萄糖甘酸酶/芳基硫酸酯酶，混匀后于37℃水浴中水解12h；在酶解之后还包括在避光冷却至室温。
17.在本发明的一个具体实施方式中，步骤s2中，净化的具体步骤为：上清液过已预先活化的hlb小柱，依次用水、30％乙腈淋洗，弃去淋洗液，抽干小柱，再用甲醇洗脱，收集洗脱液；洗脱过程中，甲醇的体积与初始的待测的尿液样品的体积比为5:1-6:1。
18.在本发明的一个具体实施方式中，步骤s2中，浓缩及复溶的具体步骤为：30℃水浴中氮吹至10μl，残渣用甲醇复溶，得到待测样品溶液；待测样品溶液与初始的待测的尿液样品的体积比为2:1。
19.在本发明的一个具体实施方式中，步骤s3中，液相色谱质谱联用仪的液相色谱的条件为：
20.色谱柱：rrhd sb-c
18
柱，2.1mm
×
100mm，1.8μm；
21.流动相：a为水，b为甲醇，梯度洗脱程序参见表；
22.流量：0.2ml/min；
23.柱温：40℃；
24.进样量：2μl；
25.梯度洗脱程序：
26.时间/mina/％b/％0851510010015010015.018515228515。
27.在本发明的一个具体实施方式中，步骤s3中，液相色谱质谱联用仪的质谱条件为：
28.离子源：电喷雾离子源；
29.扫描方式：负离子模式；
30.检测方式：多反应监测；
31.干燥气(n2)温度：350℃；
32.雾化气(n2)压力：30psi；
33.干燥气流速：5.0l/min；
34.毛细管电压：2250v；
35.鞘气温度：350℃；
36.鞘气流量：12l/min；
37.喷嘴电压：2000v
38.定性离子对、定量离子对、碰撞能量、碎裂电压参见表：
39.。
40.在本发明的一个具体实施方式中，所述方法的线性范围为0.25ng/ml～10ng/ml，加标回收率的范围为80.7％～119％，rsd范围为0.9％～6.3％，检出限为0.007ng/ml～0.3ng/ml，定量限为0.02ng/ml～1.0ng/ml。
41.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
42.1.本方法通过开展优选固相萃取小柱等前处理条件和色谱质谱条件研究，并依据具有较强基质效应物质的保留时间，结合加入内标四溴双酚a-d
10
和双酚a-d16，有效解决了人体尿液样本质谱离子化时的基质效应问题，建立了仅用2种同位素内标就能实现尿液中8种双酚类物质同时准确定量测定的方法，更具有操作简单、适用性强、使用同位素内标数量少、检测成本低等优点，可为相关主管部门制订人体尿液中双酚类物质的检测标准方法以及开展具有可比性的双酚类物质在人体内的暴露研究提供技术参考。
43.2.采用本方法测定双酚类物质具有良好的灵敏度，能够很好满足尿液中8种双酚
类物质的痕量甚至超痕量测定的需要，线性范围为0.25ng/ml～10ng/ml，回收率范围为80.7％～119％，rsd范围为0.9％～6.3％，检出限为0.007ng/ml～0.3ng/ml，定量限为0.02ng/ml～1.0ng/ml。
附图说明
44.图1为本发明实施例7中的agilent rrhd sb-c
18
柱tic图；
45.图2为本发明实施例7中的agilent eclipse plus c
18
柱tic图；
46.图3为本发明实施例7中的ace excel super c
18
柱tic图；
47.图4为本发明实施例7中的agilent proshell ec-c
18
柱tic图；
48.图5为本发明实施例7中的agilent eclipse pah柱tic图；
49.图6为本发明实施例7中的agilent sb-phenyl柱tic图；
50.图7为本发明实施例7中的agilent extend c18柱tic图；
51.图8为本发明实施例7中的agilent sb-aq柱tic图；
52.图9为本发明实施例7中的hss t3柱tic图；
53.图10为本发明实施例7中流动相梯度条件1的tic图；
54.图11为本发明实施例7中流动相梯度条件2tic图；
55.图12为本发明实施例7中流动相梯度条件3tic图；
56.图13为本发明实施例7中流动相梯度条件4tic图；
57.图14为本发明实施例7中流动相梯度条件5tic图；
58.图15为本发明实施例8中bps的mrm图；
59.图16为实施例8中bpf的mrm图；
60.图17为实施例8中bpa-d
16
的mrm图；
61.图18为实施例8中bpa的mrm图；
62.图19为实施例8中bpaf的mrm图；
63.图20为实施例8中bpap的mrm图；
64.图21为实施例8中bpz的mrm图；
65.图22为实施例8中bpp的mrm图；
66.图23为实施例8中tbbpa-d
10
的mrm图；
67.图24为实施例8中tbbpa的mrm图。
具体实施方式
68.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
69.8种双酚类化合物和2种内标物质的名称及对应的英文简写如下：
70.双酚a：bpa；双酚f：bpf；双酚s：bps；双酚p：bpp；双酚af：bpaf；双酚ap：bpap；双酚z：bpz；四溴双酚a-双(2,3-二溴丙基醚)：tbbpa；四溴双酚a-d10：tbbpa-d10；双酚a-d16：bpa-d16。
71.以下实施例中，8种双酚类化合物和2种内标物质的名称均用英文简写表示。
72.通用的材料与方法
73.(1)试剂材料
74.双酚a标准品：纯度≥99.0％；分子式：c
15h16
o2；cas号：80-05-7。
75.双酚s标准品：纯度≥99.4％；分子式：c
12h10
o4s；cas号：80-09-1。
76.双酚f标准品：纯度≥99.8％；分子式：c
13h12
o2；cas号：620-92-8。
77.双酚z标准品：纯度≥99.8％；分子式：c
18h20
o2；cas号：843-55-0。
78.双酚p标准品：纯度≥96.8％；分子式：c
24h26
o2；cas号：2167-51-3。
79.双酚af标准品：纯度≥99.5％；分子式：c
15h10
f6o2；cas号：1478-61-1)；
80.双酚ap标准品：纯度≥99.7％；分子式：c
20h18
o2；cas号：1571-75-1。
81.四溴双酚a标准品：纯度≥99.4％；分子式：c
15h12
br4o2；cas号：79-94-7。
82.氘代双酚a标准品：纯度≥97.9％；分子式：c
15d16
o2；cas号：96210-87-6。
83.氘代四溴双酚a标准品：纯度≥99％；分子式：c
15
h2d
10
o2。
84.hlb固相萃取小柱(规格：60mg，3ml)；乙酸铵(c2h7no2；hplc级)；冰乙酸(c2h4o2；色谱纯)；β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶(cnw；酶活力：aqueous solution＞100000units/ml；sulfatase activity＜20000units/ml；cas号：9001-45-0)；甲醇(ch3oh；色谱纯)；乙腈(c2h3n；色谱纯)；0.22μm尼龙滤膜；实验用水均为一级水，具体要求参见gb/t6682。
85.(2)仪器设备
86.液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源(esi源)。
87.分析天平：感量0.1g、0.01mg和0.0001g。
88.酸度计：精度为0.01个ph单位，ph值测定范围为0～14。
89.涡旋混匀器。
90.恒温水浴锅。
91.(3)色谱柱
92.agilent rrhd sb-c18(2.1mm
×
100mm,1.8μm)、agilent eclipse plus c18(2.1mm
×
100mm,1.8μm)、ace excel super c18(2.1mm
×
100mm,1.7μm)、agilent proshell ec-c18(2.1mm
×
100mm,2.7μm)、agilent eclipse pah(2.1mm
×
100mm,1.8μm)、agilent sb-phenyl(2.1mm
×
100mm,1.8μm)、agilent extend c18(2.1mm
×
100mm,1.8μm)、agilent sb-aq(2.1mm
×
100mm,1.8μm)、hss t3(3.0mm
×
100mm,2.5μm)。
93.(4)溶液配制
94.1mol/l乙酸铵溶液：称取乙酸铵77g，加水950ml溶解，加冰乙酸调节ph 5.0，再用水稀释至1l，摇匀。
95.30％乙腈溶液：移取30ml乙腈，加水稀释至100ml，摇匀。
96.单一标准储备液：取双酚类物质标准品及内标标准品各约10mg(精确至0.1mg)，分别用甲醇溶解并定容至10ml，配制成质量浓度均为1000mg/l的单一标准储备液，于-18℃下保存，有效期为半年。
97.混合标准储备液：移取各双酚类物质标准储备液1.0ml于同一100ml容量瓶中，加甲醇稀释定容，摇匀，配制成质量浓度均为10mg/l的混合标准储备液，于-18℃下保存，有效期为一个月。
98.混合标准中间液：移取混合标准储备液1.0ml于100ml容量瓶中，加甲醇稀释定容，
配制成各双酚类物质质量浓度均为100μg/l的混合标准中间液，现配现用。
99.内标混合储备液：分别移取两种内标单一标准储备液1.0ml于同一100ml容量瓶中，加甲醇稀释定容，摇匀，配制成质量浓度均为10mg/l的内标混合储备液，于-18℃下保存，有效期为一个月。
100.内标混合中间液：移取内标混合储备液2.50ml于100ml容量瓶中，加甲醇稀释定容，摇匀，配制成质量浓度均为250μg/l的内标混合中间液，现配现用。
101.系列标准工作溶液：分别准确移取适量混合标准中间液，各加入适量内标混合中间液，用甲醇稀释定容，摇匀，配制成内标浓度均为2.5ng/ml，双酚类物质质量浓度分别为0.25ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的系列标准工作溶液，现配现用。
102.(5)样品前处理
103.移取5ml试样于20ml带盖玻璃离心管中，加入4.8ml 1mol/l乙酸铵缓冲液和100μl内标混合中间液，混匀，再加入100μlβ-葡萄糖甘酸酶/芳基硫酸酯酶，混匀后置于37℃水浴中水解12h，取出并避光冷却至室温，混匀后于4000r/min下离心5min，取2ml上清液过已预先活化的hlb小柱，依次用3ml水、3ml30％乙腈淋洗，弃去淋洗液，抽干小柱，再用6ml甲醇洗脱，收集洗脱液，于30℃水浴中氮吹至约10μl，残渣用2ml甲醇复溶，混匀，过0.22μm尼龙滤膜后贮存于棕色进样小瓶，进行高效液相色谱-质谱分析。
104.(6)仪器方法
105.液相色谱条件为：
106.a)色谱柱：rrhd sb-c
18
柱，2.1mm
×
100mm，1.8μm，或性能相当者；
107.b)流动相：a为水，b为甲醇，梯度洗脱程序参见表1；
108.c)流量：0.2ml/min；
109.d)柱温：40℃；
110.e)进样量：2μl。
111.表1梯度洗脱程序
112.时间/mina/％b/％0851510010015010015.018515228515
113.质谱条件为：
114.a)离子源：电喷雾离子源(esi源)；
115.b)扫描方式：负离子模式；
116.c)检测方式：多反应监测(mrm)；
117.d)干燥气(n2)温度：350℃；
118.e)雾化气(n2)压力：30psi；
119.f)干燥气流速：5.0l/min；
120.g)毛细管电压：2250v；
121.h)鞘气温度：350℃；
122.i)鞘气流量：12l/min；
123.2)喷嘴电压：2000v
124.k)定性离子对、定量离子对、碰撞能量、碎裂电压参见表2。
125.表2双酚类物质及内标的mrm质谱参数
[0126][0127]
定性测定：
[0128]
在相同的实验条件下，样品溶液中被测物的色谱峰保留时间和标准工作溶液的相同(变化范围在
±
2.5％以内)，并且在扣除背景后的样品溶液谱图中，所选择的离子均出现，各定性离子的相对丰度和标准品离子的相对丰度比，偏差不超过表3规定的范围，则可判断样品中存在对应的待测物。
[0129]
表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
[0130]
相对离子丰度/％＞50＞20～50＞10～20≤10允许的相对偏差/％
±
20
±
25
±
30
±
50
[0131]
定量测定：
[0132]
在相同的实验条件下，将系列标准工作溶液由低到高浓度依次进样分析，以待测物的峰面积除以内标物的峰面积为纵坐标，待测物溶液质量浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，应使样品溶液中各待测物的质量浓度在标准工作曲线质量浓度范围内，超过标准工作曲线质量浓度上限的样品应减少取样量后重新制样测定。
[0133]
结果分析：
[0134]
试样中目标物的含量按照式(1)计算。
[0135][0136]
式中：
[0137]
w——试样中目标物含量，单位为钠克每毫升(ng/ml)；
[0138]
ρ——从标准工作曲线得到的试样中目标物质量浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
[0139]
v——试样定容体积，单位为毫升(ml)；
[0140]v样
——试样取样量，单位为毫升(ml)。
[0141]
计算结果应扣除空白值，以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
[0142]
实施例1样品不同浓缩方式对于结果影响的对比
[0143]
因人体尿液中含有一定量的钠、钾盐，同时双酚类物质因其为外源性物质，在尿中属于痕量级甚至超痕量级水平，因此需要对尿液中双酚类物质进行提取、富集和净化处理。参考文献方法，尿液中双酚类物质的常见前处理方法为固相萃取小柱富集净化，然后浓缩、复溶后测定。在考察固相萃取净化前，对样品浓缩方式进行考察，确保浓缩方式不影响样品中双酚类物质含量，从而更加科学的分析不同固相萃取小柱的净化效果。实验以双酚类物质标准溶液考察了不同浓缩方式，分别考察了溶液自然挥干、氮吹至干以及氮吹至约10μl三种浓缩方式对双酚类物质回收率的影响，结果见表4。由表可知，自然挥干和氮吹至干均存在部分双酚类物质回收率偏低，但氮吹至约10μl可保证每种双酚类物质回收率良好且节省了样品浓缩时间。综合考虑后确定样品浓缩方式为氮吹至近干。
[0144]
表4样品浓缩方式考察(n＝3)
[0145][0146]
实施例2样品固相萃取小柱的选择
[0147]
在考察了样品浓缩方式后，根据参考文献中双酚类物质测定前处理条件及各固相萃取小柱特性，以1ng/ml混合标准工作溶液考察hlb小柱(60mg/3ml)、nexus小柱(60mg/3ml)、c
18
小柱(60mg/3ml)以及plexp(60mg/3ml)小柱等四种固相萃取小柱对双酚类物质的富集净化效果，结果见表5。由表可知，采用hlb小柱净化时，8种双酚类物质回收率均良好，且方法精密度良好，而其余小柱均存在多个双酚类物质回收率和重复性均较差的情况，综合考虑后选择hlb小柱作为最终的净化柱。
[0148]
表5固相萃取小柱净化效果考察(n＝2)
[0149][0150][0151]
实施例3乙酸铵缓冲溶液ph选择
[0152]
由于双酚类物质均含有酚羟基，其在溶液中存在状态受ph值影响较大，同时考虑β-葡萄糖苷酸酶/硫酸酯酶的适用ph范围，通过微调1mol/l乙酸铵缓冲溶液ph值考察hlb固相萃取小柱对双酚类物质富集净化效果的影响，结果见表6。由表可知，bpp和tbbpa在ph5.0条件下的回收率结果均明显优于其他条件，且随着ph值的增加而明显降低，而其余6种双酚类物质各条件下的回收率变化不大，综合考虑后选择1mol/l乙酸铵(ph5.0)缓冲溶液作为样品酶解平衡体系和hlb小柱上样前柱子平衡溶液。
[0153]
表6不同ph缓冲液对双酚类物质净化的影响(n＝2)
[0154][0155]
实施例4hlb小柱淋洗液的选择
[0156]
尿液中除了无机盐外，还含有一些有机物，为了尽量保证hlb小柱富集净化效果，选择不同浓度的乙腈溶液对上样后的hlb小柱进行淋洗，旨在最大程度保留双酚类物质的基础上，最大程度的去除其他基质干扰成分，结果见表7。由表可知，当乙腈浓度达35％(v/v)时，bps回收率严重偏低，而其余条件大部分双酚类物质回收率均良好。为了保证洗脱完全，减少尿液基质成分干扰，综合考虑后选择30％(v/v)乙腈溶液作为hlb小柱淋洗液。
[0157]
表7淋洗液对双酚类物质净化的影响(n＝2)
[0158][0159]
实施例5洗脱液洗脱体积的选择
[0160]
由于不同双酚类物质的pka值不同，其在固相萃取小柱上的保留行为存在差异，因
sb-c
18
色谱柱为实验室常用色谱柱，综合考虑后选择rrhd sb-c
18
作为本方法检测色谱柱。
[0170]
表10色谱柱选择
[0171][0172][0173]
2.流动相组成的优化
[0174]
选定色谱柱后，用混合标准工作溶液考察了4种不同流动相体系(水-甲醇体系、0.1％甲酸-甲醇体系、水-乙腈体系以及0.1％甲酸-乙腈体系)对双酚类物质响应及分离的影响，结果见表11。由表可知，乙腈体系双酚类物质出峰时间较甲醇体系快，bpaf和bpap的分离较甲醇体系差，而流动相中加入甲酸对双酚类物质保留无影响，但严重抑制各待测物的响应，总体而言，水-甲醇体系各待测物响应均显著高于其他流动相体系响应结果，因此选择水-甲醇体系作为本方法检测流动相组成。
[0175]
表11流动相组成优化
[0176][0177][0178]
3.色谱柱温度优化
[0179]
选定流动相组成后，考察了7种色谱柱温度对双酚类物质响应及分离的影响，结果见表12。由表12可知，随着色谱柱柱温的增加，双酚类物质出峰时间略变快，但不影响双酚类物质间的分离情况。为了尽量提高分析效率，降低色谱柱柱压，综合考虑后选择色谱柱温度为40℃。
[0180]
表12色谱柱温度优化
[0181][0182]
4.流动相梯度考察
[0183]
为保证双酚类物质具有良好的分离和响应，考察了不同初始流动相比例(见表13)对双酚类物质保留时间、分离效果以及响应的影响，结果见表14和图10～图14。由表和图可知，高比例有机相会导致所有物质出峰快，且部分物质峰形变差，而低比例有机相条件下，微调初始比例对出峰时间和响应影响不大，综合考虑后选择条件2为流动相梯度洗脱程序。
[0184]
表13流动相梯度条件
[0185][0186][0187]
表14不同梯度条件对双酚类物质的影响
[0188][0189][0190]
实施例8质谱条件优化
[0191]
根据双酚类物质的结构特征，选择esi负离子模式进行一级质谱扫描，得到双酚类物质的分子离子峰，然后优化得到每种双酚类物质的一级质谱最佳源内碎裂电压(frg.)，再对每种双酚类物质的分子离子峰进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到碎片离子信息，然后优化得到每种双酚类物质的二级质谱最佳碰撞能量(ce)。优化后的双酚类物质的mrm信息如表15所示，其多反应监测图见图15～图24。
[0192]
表15双酚类物质及内标的mrm质谱参数
[0193][0194]
本实施例还考察了干燥气温度、干燥气流速、喷雾器压力、毛细管电压、鞘气温度、
鞘气流量及喷嘴电压对双酚类物质响应的影响，结果见表16-表22。由表可知，当气体温度为350℃时，各目标峰响应较其他条件好；当气体流速为5l/min时，各目标峰响应较其他条件好；当雾化器压力为30psi时，各目标峰响应较其他条件好；当毛细管电压为2250v时，各目标峰响应较其他条件好；当鞘气温度为350℃时，各目标峰响应较其他条件好；当鞘气流量为12l时，各目标峰响应较其他条件好；当喷嘴电压为2000v时，各目标峰响应较其他条件好，因此，选择质谱离子源条件为干燥气温度350℃、干燥气流速5l/min、雾化器压力30psi、毛细管电压2250v、鞘气温度350℃、鞘气流量12l，喷嘴电压2000v。
[0195]
表16干燥气温度对双酚类物质的影响
[0196][0197][0198]
表17干燥气流速对四种辣椒素类物质的影响
[0199][0200]
表18雾化器压力对双酚类物质的影响
[0201][0202]
表19毛细管电压对双酚类物质的影响
[0203][0204]
表20鞘气温度对双酚类物质的影响
[0205][0206]
表21鞘气流量对双酚类物质的影响
[0207][0208]
表22喷嘴电压对双酚类物质的影响
[0209][0210]
实施例9线性范围、检出限和定量限
[0211]
在上述“通用的材料和方法”所述条件下，将测定用的系列混合标准工作液分别注入液相色谱-串联质谱仪中，以目标物和内标物的峰面积比值为纵坐标，标准工作溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线，如表22所示。由表可知，各目标物在0.25ng/ml～10ng/ml范围内线性关系均良好，相关系数r均＞0.99。为了考察本方法的灵敏度，采用信噪比法计算本方法的检出限(lod)和定量限(loq)，以信噪比s/n≥3左右的浓度确定为本方法检出限浓度，以信噪比s/n≥10左右的浓度为本方法定量限浓度，具体结果见表23，由表可知，本方法测定双酚类物质具有良好的灵敏度，能够很好满足尿液中8种双酚类物质的痕量甚至超痕
量测定的需要。
[0212]
表23方法线性和灵敏度结果
[0213][0214][0215]
实施例10加标回收率和精密度
[0216]
取人体尿液12份，其中3份完全按上述“通用的材料与方法”方法进行样品前处理方法制备待测液，另9份分别加入适量混合标准中间液使最终测试液浓度构成低浓度、中浓度、高浓度三个不同浓度水平加标样品，再按上述“通用的材料与方法”方法进行样品前处理制备待测液，考查本方法的加标回收率和精密度情况，具体结果见表24～表31。由表可知，本方法测定人体尿液中8种双酚类物质的回收率范围为80.7％～119％，rsd范围为0.9％～6.3％，均满足gb/t 32465-2015《化学分析方法验证确认和内部质量控制要求》、gb/t 27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》等相关标准对方法回收率和精密度的要求，说明本方法能够满足人体尿液中8种双酚类物质含量的准确测定需要。
[0217]
表24bps的添加回收率情况
[0218][0219]
表25bpf的添加回收率情况
[0220][0221][0222]
表26bpa的添加回收率情况
[0223][0224]
表27bpaf的添加回收率情况
[0225][0226][0227]
表28bpap的添加回收率情况
[0228][0229]
表29bpz的添加回收率情况
[0230][0231][0232]
表30bpp的添加回收率情况
[0233][0234]
表31tbbpa的添加回收率情况
[0235][0236][0237]
实施例11待测溶液稳定性
[0238]
分别吸取2μl混合标准工作溶液、尿液样品溶液和尿液低浓度加标溶液，按上述“通用的材料与方法”方法，在0h、1.5h、3h、6h、12h、15h、18h和24h时注入液相色谱-串联质谱仪进行分析，考察各待测溶液稳定性，具体结果见表32～表34。由表可知，各溶液在24小时内响应结果未见明显规律性递减或递增变化规律，按照gb/t 32465-2015《化学分析方法验证确认和内部质量控制要求》、gb/t 27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》等相关标准的要求，各待测溶液的检测结果rsd均符合要求，说明本方法制备的待测液在24h内稳定性均良好。
[0239]
表32混合标准工作溶液稳定性测试结果
[0240][0241]
表33尿液样品溶液稳定性测试结果
[0242][0243][0244]
表34尿液低浓度加标溶液稳定性测试结果
[0245][0246]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种尿液中双酚类物质测定的方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、系列标准工作溶液的配制：分别精确称取8种双酚类物质标准品及2种内标物质标准品溶解并定容，配制成含有内标物质的系列标准工作溶液；s2、待测样品溶液的配制：待测的尿液样品加入2种内标物质，经酶解、离心取上清液、净化、浓缩、复溶后，过尼龙滤膜，得到待测样品溶液；s3、hplc-ms/ms检测：将步骤s1的含有内标物质的系列标准工作溶液依次注入液相色谱质谱联用仪中分析，以双酚类物质的峰面积除以对应的内标物质的峰面积为纵坐标，双酚类物质的质量浓度为横坐标绘制标准工作曲线，在相同检测条件下，检测步骤s2的待测样品溶液，结果代入标准工作曲线，即可求得待测尿液样品中双酚类物质的含量；所述8种双酚类物质为：双酚a、双酚f、双酚s、双酚p、双酚af、双酚ap、双酚z、四溴双酚a-双(2,3-二溴丙基醚)；所述2种内标物质为：四溴双酚a-d
10
、双酚a-d
16
；双酚s、双酚f、双酚a、双酚af对应的内标物质为双酚a-d
16
，双酚ap、双酚z、双酚p、四溴双酚a-双(2,3-二溴丙基醚)对应的内标物质为四溴双酚a-d
10
。2.根据权利要求1所述的一种尿液中双酚类物质测定的方法，其特征在于，步骤s1中溶解、稀释以及步骤s2中复溶均用甲醇。3.根据权利要求1所述的一种尿液中双酚类物质测定的方法，其特征在于，步骤s1中，系列标准工作溶液中2种内标物质的浓度均为2.5ng/ml；系列标准工作溶液中8种双酚类物质的浓度均为0.25ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml。4.根据权利要求1所述的一种尿液中双酚类物质测定的方法，其特征在于，步骤s2中，待测的尿液样品加入2种内标物质后，2种内标物质在待测的尿液样品中的浓度均为5.0ng/ml。5.根据权利要求1所述的一种尿液中双酚类物质测定的方法，其特征在于，步骤s2中，酶解的步骤为：加入与待测的尿液样品等体积的ph值为5.0的乙酸铵缓冲液，再加入β-葡萄糖甘酸酶/芳基硫酸酯酶，混匀后于37℃水浴中水解12h；在酶解之后还包括在避光冷却至室温。6.根据权利要求1所述的一种尿液中双酚类物质测定的方法，其特征在于，步骤s2中，净化的具体步骤为：上清液过已预先活化的hlb小柱，依次用水、30％乙腈淋洗，弃去淋洗液，抽干小柱，再用甲醇洗脱，收集洗脱液；洗脱过程中，甲醇的体积与初始的待测的尿液样品的体积比为5:1-6:1。7.根据权利要求1所述的一种尿液中双酚类物质测定的方法，其特征在于，步骤s2中，浓缩及复溶的具体步骤为：30℃水浴中氮吹至10μl，残渣用甲醇复溶，得到待测样品溶液；待测样品溶液与初始的待测的尿液样品的体积比为2:1。8.根据权利要求1所述的一种尿液中双酚类物质测定的方法，其特征在于，步骤s3中，液相色谱质谱联用仪的液相色谱的条件为：色谱柱：rrhd sb-c
18
柱，2.1mm
×
100mm，1.8μm；流动相：a为水，b为甲醇，梯度洗脱程序参见表；流量：0.2ml/min；柱温：40℃；
进样量：2μl；梯度洗脱程序：时间/mina/％b/％0851510010015010015.018515228515。9.根据权利要求1所述的一种尿液中双酚类物质测定的方法，其特征在于，步骤s3中，液相色谱质谱联用仪的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子模式；检测方式：多反应监测；干燥气n2温度：350℃；雾化气n2压力：30psi；干燥气流速：5.0l/min；毛细管电压：2250v；鞘气温度：350℃；鞘气流量：12l/min；喷嘴电压：2000v定性离子对、定量离子对、碰撞能量、碎裂电压参见表：
10.根据权利要求1所述的一种尿液中双酚类物质测定的方法，其特征在于，所述方法的线性范围为0.25ng/ml～10ng/ml，加标回收率的范围为80.7％～119％，rsd范围为0.9％～6.3％，检出限为0.007ng/ml～0.3ng/ml，定量限为0.02ng/ml～1.0ng/ml。

技术总结
本发明提供了一种尿液中双酚类物质测定的方法，属于检测技术领域。该方法包括如下步骤：系列标准工作溶液的配制：分别精确称取8种双酚类物质标准品及2种内标物质标准品溶解并定容，配制成含有内标物质的系列标准工作溶液；待测样品溶液的配制：待测的尿液样品加入2种内标物质，经酶解、离心取上清液、净化、浓缩、复溶后，过尼龙滤膜，得到待测样品溶液；HPLC-MS/MS检测：用液相色谱质谱联用仪依次分析系列标准工作溶液，然后绘制标准工作曲线，在相同检测条件下，检测待测样品溶液，从而得到待测尿液样品中双酚类物质的含量。采用本方法测定双酚类物质具有良好的灵敏度，能够很好满足尿液中8种双酚类物质的痕量甚至超痕量测定的需要。需要。需要。


技术研发人员：冯德建 吴微 邹燕 赵爱平 王智 王芳 李椤颢 陈泽羽 李嘉骏
受保护的技术使用者：中国测试技术研究院
技术研发日：2023.07.28
技术公布日：2023/10/15