基于单细胞测序筛选炎症状态下种植体周软组织特异性细胞的方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及单细胞测序领域，特别是涉及一种基于单细胞测序筛选炎症状态下种植体周软组织特异性细胞的方法，以及由该方法得到的种植体周软组织的特征性细胞亚群。


背景技术：

2.种植体周围炎(peri-implantitis,pi)是一种发生在种植体周围组织的病理状态，以种植体周围组织的炎症和支持骨的丧失为标志。随着全球接受种植体修复治疗的人数增加，每年约有50万患者接受种植体重建手术。然而，种植体周围炎的新流行损害了种植体的长期成功，估计约有13％至47％的患者受到影响。不幸的是，目前对种植体周围疾病缺乏有效的治疗方法，持续炎症和复发的发生率很高，这表明迫切需要更好地了解其发病机制。
3.种植体周围炎被认为是由种植体表面的微生物生物膜引起的，这与牙周炎是一致的。因此，种植体周围炎的治疗方案根据牙周炎的治疗方案建模。然而，种植体周围炎治疗的结果仍然是高度可变和不可预测的，这增加了最佳治疗方案的制定的复杂性。更糟糕的是，种植体周围炎相关的失稳的进展速度非常快，与牙周炎有一些不同，导致种植体周围骨质流失，最终种植体迅速丢失。有几项研究试图通过人体活检材料和实验模型来分析种植体周围炎与牙周炎的炎症病变有何不同。然而，由于这些研究中使用的实验方法的局限性，无法收集到更稳健的数据。因此，对种植体周围炎的全面认识仍然缺乏，也没有解释种植体周围炎和牙周炎发病机制的差异。这表明有必要重新研究种植体周围炎的独特发病机制，并确定它与牙周炎的区别。
4.单细胞技术的使用使研究人员能够揭示导致疾病发病机制的隐藏分子系统。这项技术为获得牙周炎相关的单个细胞类型的转录组和研究人类组织中的疾病发病机制提供了机会。那么炎症状态下种植体周软组织免疫微环境如何？细胞分子之间又是怎样交互作用的呢？这对于临床治疗又有什么启发呢？


技术实现要素：

5.鉴于此，本发明的目的在于对炎症状态下种植体周软组织进行单细胞测序，通过转录组水平探究种植周软组织免疫微环境的特异性及细胞之间的交互关系，从而进一步揭示疾病发病机制及指导临床治疗。
6.为实现上述目的，本发明所采取的解决方案如下：
7.第一个方面，本发明提供一种基于单细胞测序筛选炎症状态下种植体周软组织特异性细胞的方法，包括如下步骤：
8.s1、样本制备：手术切除种植体周软组织，对切除的组织进行处理，获得种植体周软组织的单细胞悬液；
9.s2、单细胞rna测序，获得种植体周软组织的单细胞的scrna-seq文库；
10.s3、scrna-seq数据统计分析，对获得的scrna-seq文库中的细胞亚群进行聚类分析，找到特征性细胞亚群。
11.优选地，s1步骤后，还包括：对分离后的单细胞染色，进行细胞活力评估。
12.优选地，s1步骤中，对切除的组织进行处理，包括：对切除的种植体周软组织先用pbs洗涤，切成小块放在冰上，然后用胶原酶i、胶原酶ii、胶原酶iv和dna酶i在37℃下处理，洗涤、离心，然后在37℃下用0.1％胰蛋白酶消化，消化后将样品通过70μm细胞过滤器筛分，取300g离心，去上清后，将成球的细胞悬浮于红细胞裂解缓冲液中裂解红细胞，用含0.04％bsa的pbs洗涤后，细胞微球在含0.04％bsa的pbs中重新悬浮，并通过35μm细胞过滤器重新过滤，得到种植体周软组织的单细胞悬液。
13.优选地，s2步骤中，单细胞rna测序，包括：将s1步骤得到的细胞浓缩至大约1000个细胞/μl，使用10x genomics chromium controller仪器和chromium single cell 3’v3.1试剂包，将细胞加载到每个仪器的通道中，生成单细胞凝胶珠-乳珠，将其破碎、纯化并扩增条形码cdna，扩增的被片段化，与适配器连接，将具有条形码cdna的磁珠与细胞配对，并进行指数pcr扩增，使用illumina测序仪进行150bp的配对末端测序，生成scrna-seq文库，使用量子比特高灵敏度dna分析对生成的scrna-seq文库进行量化，并使用生物分析仪2200上的高灵敏度dna芯片确定文库的大小分布。
14.优选地，s3步骤中，scrna-seq数据统计分析，包括：将scrna-seq数据在novelbio公司的novelbrain云分析平台上进行分析，应用带有默认参数的fastp软件来过滤适配器序列并删除低质量的读取来获得高质量的数据，应用umi工具进行单细胞转录组分析以识别细胞条形码白名单，使用star映射和来自umi工具标准管道的自定义参数，将基于umi的清洁数据映射到人类基因组，以获得每个样本的umi计数，含有》200个表达基因且线粒体umi率《80％的细胞通过细胞质量过滤，线粒体基因在表达表中被删除；使用seurat包，根据每个样本的umi计数和线粒体率，根据表达表进行细胞归一化和回归，以获得缩放数据；基于前2000个高变量基因和前10个原则的比例数据进行主成分分析(pca)，获得基于pca top 10原则的无监督细胞聚类结果，并在以下条件下，使用findallmarker函数和wilcoxon秩和检验算法计算标记基因：(1)log2fc》0.25；(2)p值《0.05；(3)最小pct》0.1；为了确定细胞类型的细节，选择相同细胞类型的聚类进行re-tsne分析、基于图的聚类和标记分析，筛选出特征性细胞亚群。
15.优选地，还包括以下步骤：
16.s4、拟时序分析：使用ddr树算法和默认参数的monocle2进行单细胞轨迹分析；在monocle分析之前，选取seurat聚类数据的标记基因和通过筛选的细胞的原始表达计数；在拟时间分析的基础上，应用分支表达分析模型对分支命运决定基因进行分析；
17.s5、细胞通信分析：为了系统分析细胞-细胞间的通信分子，使用cellphonedb进行细胞通信分析，对来自不同时间点的膜蛋白、分泌蛋白和外周蛋白进行注释，通过交互作用计算显著性平均值和细胞通讯显著性(p值《0.05)，通过seurat归一化得到归一化的细胞矩阵；
18.s6、基因富集分析(qusage analysis)，用于描述特定基因的相对通路激活；
19.s7、差异基因表达分析：为了识别样本间的差异表达基因，在以下条件下使用
wilcoxon秩和检验算法查找标记函数：(1)log2fc》0.25；(2)p值《0.05；(3)最小pct》0.1。
20.第二个方面，本发明还提供一种种植体周软组织的特征性细胞亚群，由上所述的基于单细胞测序筛选炎症状态下种植体周软组织特异性细胞的方法获得，获得的种植体周软组织的特征性细胞亚群为炎症因子cxcl13+细胞亚群。
21.第三个方面，本发明还提供一种靶向治疗种植体周软组织的生物标记物，包括中和cxcl13+活性的抗体。
22.第四个方面，本发明还提供一种靶向治疗种植体周软组织的药物组合物，包括如上所述的一种靶向治疗种植体周软组织的生物标记物。
23.优选地，还包括医学上可接受的辅料或载体。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
25.(1)本发明对炎症状态下种植体周软组织进行单细胞测序，筛选出种植体周软组织的特征性细胞亚群，通过转录组水平探究种植周软组织免疫微环境的特异性及细胞之间的交互关系，从而进一步揭示疾病发病机制及指导临床治疗。
26.(2)本发明通过对种植周软组织的单细胞悬液进行生物信息拟时序分析发现，相比于牙周炎，种植体周免疫微环境中更倾向于破骨分化。
附图说明
27.图1为本发明实施例中种植体周围炎(pi)、牙周炎(pd)和健康个体(h)免疫微环境单细胞研究。其中，(a)为研究概览示意图；(b)为经scrna-seq鉴定的pi组10种细胞类型的umap表示(n＝5,39,297个细胞)及相关细胞类型的百分比；(c)为umaps如(b)，但由特殊细胞类型的关键标记基因表达着色；(d)为umap显示h组(n＝5,38,382个细胞)、pd组(n＝5,31,300个细胞)和pi组(n＝5,39,297个细胞)的细胞类型；(e)为盒子图，显示了(d)中h、pd和pi样本中每个簇的细胞百分比，图中心、盒体、晶须和点分别对应中位数、iqr、1.5
×
iqr和》1.5
×
iqr；(f)为h组、pd组和pi组活检组织he染色。比例尺：100μm。
28.图2为本发明实施例中种植体周围炎成纤维细胞和促炎cxcl13+亚群的异质性。其中，(a)为不同组共15个样本中所有成纤维细胞的umap；(b)为成纤维细胞的umap(6个亚簇)，聚类标注并着色；(c)为小提琴图显示所选标记基因在每个亚群中的不同表达(行)；(d)为pi组、pd组和h组成纤维细胞各亚群百分比；(e)为不同组的ferroptosis和凋亡分析的小提琴图；(f)左图：不同组与亚铁变性相关基因acsl4表达差异的小提琴图；右图：各组acsl4蛋白的相对表达情况；(g)左图：不同组凋亡相关基因表达不良的小提琴图差异；右图：各组不良蛋白的相对表达情况；(h)为pi组、pd组和h组成纤维细胞亚群比例。*p《0.05,pi vs h；**p《0.01,pi vs h；(i)为通过go和pathway分析确定cxcl13+亚群的富集项。
29.图3为本发明实施例中种植体周围炎免疫微环境中更多的中性粒细胞浸润。其中，(a)为5簇中性粒细胞的umap；(b)为小提琴图显示了每簇中性粒细胞细胞的制造者和每簇中功能蛋白的表达；(c)为盒子图，显示了h、pd和pi组中每个簇的细胞百分比，图中心、盒体、晶须和点分别对应中位数、iqr、1.5
×
iqr和》1.5
×
iqr；采用非配对双尾t检验进行统计分析；(d)为对不同分组中不同子簇的用法分析；(e)为假时间分析，显示五簇中性粒细胞细胞的进展；所有单细胞的轨迹重建显示三个分支：pre-branch,fate 1和fate 2；(f)为热图，显示了(e)中三个分支中不同表达基因的比例表达，分类为三个主要的基因簇(蓝色、绿
色和黄色)，这些基因簇随着假时间的变化而变化，并在右侧边缘突出每个基因簇中的特定代表性基因；(g)为选定基因(与nfkb通路相关)的表达动态根据伪时间坐标分为两个分支；三个子簇中的所有单细胞都基于(a)进行着色，并根据伪时间进行排序；(h)为显示选定的成纤维细胞-中性粒细胞串话途径；红色信号是纤维母细胞发出的配体，蓝色信号是中性粒细胞表达的受体。
30.图4为本发明实施例中种植体周围炎免疫微环境中的细胞分化。其中，(a)为髓系簇的umap，以样本来源类型(h、pd、pi)和聚类进行标注和着色；(b)为h、pd和pi在单核细胞、巨噬细胞、ma-m2和破骨细胞中的比例；(c)为小提琴图，显示了界定每一簇髓系细胞的关键细胞类型标记；(d)为假时间分析，显示了单核细胞、巨噬细胞、ma-m2和破骨细胞等主要细胞群的进展；所有单细胞的轨迹重建显示三个分支:pre-branch,fate 1和fate 2；柱状图中显示了所有细胞的每个分支的百分比；箭头表示细胞的发育轨迹；(e)为热图，显示了(d)中三个分支中不同表达基因的比例表达，分类为三个主要的基因簇(蓝色、绿色和黄色)，这些基因簇随着假时间的变化而变化，并突出显示了每个基因簇右边缘的特定代表性基因；(f)为巨噬细胞、ma-m2、单核细胞和破骨细胞在假时间轨迹上的分布；(g)为选择基因(与破骨细胞分化有关)的表达动态根据伪时间坐标分为两个分支。
31.图5为本发明实施例中种植体周围炎、牙周炎和健康个体的免疫微环境中的细胞-细胞通讯。其中，(a)为circo图，如图1d所示，手机预测的10种主要细胞类型之间的潜在细胞相互作用；节点大小表示交互次数；边缘的宽度表示两种细胞类型之间的有效配体-受体对的数量；(b)为手机生成的圆点图，显示pi组中与单核细胞和其他细胞类型相关的潜在配体受体对；(c)为纤维母细胞-单核细胞串扰通路的可视化；红色信号是由成纤维细胞发出的配体，蓝色信号是在单核细胞上表达的受体；两个簇之间的配体-受体对的表达使点着色；(d)为h、pd和pi组成纤维细胞趋化因子的表达；表达式值被归一化和缩放平均值；(e)为以种植体周围炎免疫微环境为中心的预测调控网络。
具体实施方式
32.本发明提供一种基于单细胞测序筛选炎症状态下种植体周软组织特异性细胞的方法，包括如下步骤：
33.s1、样本制备：手术切除种植体周软组织，对切除的组织进行处理，获得种植体周软组织的单细胞悬液；
34.s2、单细胞rna测序，获得种植体周软组织的单细胞的scrna-seq文库；
35.s3、scrna-seq数据统计分析，对获得的scrna-seq文库中的细胞亚群进行聚类分析，找到特征性细胞亚群。
36.本发明通过上述对炎症状态下种植体周软组织进行单细胞测序，获得的种植体周软组织的特征性细胞亚群为炎症因子cxcl13+细胞亚群。
37.本发明还提供一种靶向治疗种植体周软组织的生物标记物，包括中和cxcl13+活性的抗体。
38.本发明还提供一种靶向治疗种植体周软组织的药物组合物，包括如上所述的一种靶向治疗种植体周软组织的生物标记物。
39.优选地，所述药物组合物还包括医学上可接受的辅料或载体。
40.优选地，所述药物组合物的剂型选自片剂、粉剂、注射剂、胶囊、混悬剂、糊剂、凝胶、涂布剂、药膜剂、缓释剂或微球。
41.给药以及药物组合物
42.一般来说，本发明的药物组合物可以在有效量下，通过任何可接受的用于其他类似用途的给药方式进行给药。举例来说，本发明的药物组合物可以口服、非肠道给药、透皮给药、局部给药、直肠给药或鼻内给药。
43.当用作药物时，本发明通常以药物组合物的形式给药。这些组合物可用制药学领域熟知的方法进行制备，这些组合物包含至少一种活性化合物，在本发明中，该活性化合物为如上化学式(i)所示的羟基脲或其药学上可接受的盐。在配制本发明提供的组合物时，有效成分通常与医学上可接受的辅料或载体混合，被医学上可接受的辅料或载体稀释或被以胶囊，小袋，纸或其他形式的容器包裹。当所述医学上可接受的辅料或载体作为稀释剂时，可以是固体，半固体，或液体物质，可作为有效成分的运载体、载体或媒介。由此，所述组合物可以是药片、药丸、粉末、锭剂、小袋、胶囊、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆、喷雾(作为固体或在液体介质里)，软膏，软和硬的明胶胶囊，栓剂，无菌注射溶液，和无菌包装粉末的形式。
44.一些典型的医学上可接受的辅料或载体包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。另外还可以包括润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油)、浸润剂、乳化和悬浊剂、防腐剂(如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)、甜味剂和增味剂。本发明的药物组合物可以通过具体赋形方式在对病人进行给药之后达到药物活性成分的快速、持续或延时释放，这也是本领域中广泛应用的方法。
45.活性成分，即本发明中的如上所述的中和cxcl13+活性的抗体，在药物构成和单位剂型中的数量可根据具体应用情况、特定化合物的活性和预期浓度进行改变或有较大调整。
[0046]“治疗”意味着对哺乳动物体内疾病的任何治疗，包括：(1)防止疾病，即造成临床疾病的症状不发展；(2)抑制疾病，即阻止临床症状的发展；(3)减轻疾病，即造成临床症状的消退。
[0047]
以下结合具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
[0048]
实施例：
[0049]
本发明实施例涉及一种基于单细胞测序筛选炎症状态下种植体周软组织特异性细胞的方法，包括如下步骤：
[0050]
《样本制备》
[0051]
手术切除组织，并保存在macs组织存储液中，直到处理。对样品进行如下处理。具体地说，样品首先用pbs洗涤，切碎成小块放在冰上，用200u/ml胶原酶i、100u/ml胶原酶ⅱ、50u/ml胶原酶ⅳ和50u/ml dna酶i在37℃下搅拌30分钟。然后，样品洗涤并在300
×
g下离心5分钟，然后在37℃下用0.1％胰蛋白酶消化30分钟，并搅拌。消化后，样品通过70μm细胞过滤器筛分，300g离心5min。去上清后，将成球的细胞悬浮于红细胞裂解缓冲液中裂解红细
胞。用含0.04％ bsa的pbs洗涤后，细胞微球在含0.04％ bsa的pbs中重新悬浮，并通过35μm细胞过滤器重新过滤。分离后的单细胞用ao/pi染色，使用countstar荧光细胞分析仪进行细胞活力评估。
[0052]
《单细胞rna测序》
[0053]
使用10x genomics chromium controller仪器和chromium single cell 3'v3.1试剂包生成scrna-seq文库。具体地说，细胞被浓缩到大约1000个细胞/μl，并加载到每个通道中生成单细胞凝胶珠-乳剂。rt步骤结束后，破碎宝石，纯化并扩增条形码cdna。扩增的条形码cdna被片段化，a-tailed，与适配器连接，并进行指数pcr扩增。使用量子比特高灵敏度dna分析对最终文库进行量化，并使用生物分析仪2200上的高灵敏度dna芯片确定文库的大小分布。所有文库均使用illumina测序仪进行150bp的配对末端测序。
[0054]
《单细胞rna统计分析》
[0055]
scrna-seq分析由novelbio有限公司进行，使用novelbrain云分析平台。应用fastp，对适配器序列进行默认参数过滤，并删除低质量的读取，以生成干净的数据。然后使用cellranger v6.1.1将reads与人类基因组(grch38 ensemble:version 104)对齐，获得特征条形码矩阵。根据每个样本的每个单元的条形码读数映射，对测序的样本进行样本分析，最终得到聚合矩阵。表达基因超过200个，且线粒体唯一分子标识符(umi)率低于20％的细胞通过了细胞质量过滤，表达表中删除了线粒体基因。
[0056]
使用seurat软件包(版本:4.0.3,https://satijalab.org/seurat/)根据每个样本的umi计数和线粒体率百分比，根据表达表进行细胞归一化和回归，得到缩放后的数据。基于前2000个高变量基因和前10个原则的比例数据进行主成分分析(pca)，分别用于t分布随机邻居嵌入(tsne)构建和umap构建。利用基于图的聚类方法，我们获得了基于pca top 10原则的无监督细胞聚类结果，并在以下条件下，使用findallmarker函数和wilcoxon秩和检验算法计算标记基因:1.log2fc》0.25；2.p值《0.05；3.最小pct》0.1。为了确定细胞类型的细节，选择相同细胞类型的聚类进行re-tsne分析、基于图的聚类和标记分析。
[0057]
《拟时间分析》
[0058]
使用monocle2进行单细胞轨迹分析。使用ddr-tree算法和默认参数,在进行单片分析之前，选取seurat聚类结果的标记基因和经过筛选的细胞的原始表达计数。在拟时间分析的基础上，应用分支表达分析模型对分支命运决定基因进行分析。
[0059]
《细胞通信分析》
[0060]
为了系统分析细胞-细胞间的通信分子，应用了cellphonedb(一个包含配体、受体及其相互作用的公共知识库)进行细胞通信分析。对来自不同时间点的膜蛋白、分泌蛋白和外周蛋白进行了注释。通过交互作用计算显著性平均值和细胞通讯显著性(p值《0.05)，通过seurat归一化得到归一化的细胞矩阵。
[0061]
《qusage analysis(基因富集分析)》
[0062]
为了描述特定基因的相对激活，如通路激活，进行了qusage(2.16.1)分析。
[0063]
《差异基因表达分析》
[0064]
为了识别样本间的差异表达基因，在以下条件下使用wilcoxon秩和检验算法查找标记函数(function find markers with wilcoxon rank-sum test algorithm):1.log2fc》0.25；2.p值《0.05；3.最小pct》0.1。
[0065]
《免疫组织化学》
[0066]
根据前期研究进行免疫组化(ihc)染色。具体地说，切取3mm厚的组织切片并进行处理，使用抗bad抗体(目录号gb11198,1:20 00,servicebio，武汉，中国)或小鼠抗acsl4抗体(目录号66617-1-lg,1:20 00,proteintech,rosemont,il,usa)进行ihc检测。这些图像采用徕卡显微镜拍摄。
[0067]
图1为本发明实施例中种植体周围炎(pi)、牙周炎(pd)和健康个体(h)免疫微环境单细胞研究。
[0068]
图1中，(a)为研究概览示意图，即手术切除种植体周软组织，对切除的组织进行处理，获得种植体周软组织的单细胞悬液，然后对获得的种植体周软组织的单细胞悬液进行单细胞rna测序，获得种植体周软组织的单细胞的scrna-seq文库。
[0069]
图1中，(b)为经scrna-seq鉴定的pi组10种细胞类型的umap表示(n＝5,39,297个细胞)及相关细胞类型的百分比；(c)为umaps如(b)，但由特殊细胞类型的关键标记基因表达着色；(d)为umap显示h组(n＝5,38,382个细胞)、pd组(n＝5,31,300个细胞)和pi组(n＝5,39,297个细胞)的细胞类型；(e)为盒子图，显示了(d)中h、pd和pi样本中每个簇的细胞百分比，图中心、盒体、晶须和点分别对应中位数、iqr、1.5
×
iqr和》1.5
×
iqr；(f)为h组、pd组和pi组活检组织he染色。比例尺：100μm。
[0070]
由图1可以看出，相比于牙周炎(pd)和健康个体(h)，种植体周围炎(pi)在免疫微环境中有更多的中性粒细胞(neutrophil)浸润。
[0071]
图2为本发明实施例中种植体周围炎成纤维细胞和促炎cxcl13+亚群的异质性。
[0072]
图2中，(a)为不同组共15个样本中所有成纤维细胞的umap；(b)为成纤维细胞的umap(6个亚簇)，聚类标注并着色；(c)为小提琴图显示所选标记基因在每个亚群中的不同表达(行)；(d)为pi组、pd组和h组成纤维细胞各亚群百分比；(e)为不同组的ferroptosis和凋亡分析的小提琴图；(f)左图：不同组与亚铁变性相关基因acsl4表达差异的小提琴图；右图：各组acsl4蛋白的相对表达情况；(g)左图：不同组凋亡相关基因表达不良的小提琴图差异；右图：各组不良蛋白的相对表达情况；(h)为pi组、pd组和h组成纤维细胞亚群比例。*p《0.05,pi vs h；**p《0.01,pi vs h；(i)为通过go和pathway分析确定cxcl13+亚群的富集项。
[0073]
由图2(d)、图2(h)和图2(i)可以看出，通过本发明的方法对炎症状态下种植体周软组织(pi)进行单细胞测序，筛选出来的特征性细胞亚群为炎症因子cxcl13+细胞亚群。
[0074]
图3为本发明实施例中种植体周围炎免疫微环境中更多的中性粒细胞浸润。
[0075]
图3中，(a)为5簇中性粒细胞的umap；(b)为小提琴图显示了每簇中性粒细胞细胞的制造者和每簇中功能蛋白的表达；(c)为盒子图，显示了h、pd和pi组中每个簇的细胞百分比，图中心、盒体、晶须和点分别对应中位数、iqr、1.5
×
iqr和》1.5
×
iqr；采用非配对双尾t检验进行统计分析；(d)为对不同分组中不同子簇的用法分析；(e)为假时间分析，显示五簇中性粒细胞细胞的进展；所有单细胞的轨迹重建显示三个分支：pre-branch,fate 1和fate2；(f)为热图，显示了(e)中三个分支中不同表达基因的比例表达，分类为三个主要的基因簇(蓝色、绿色和黄色)，这些基因簇随着假时间的变化而变化，并在右侧边缘突出每个基因簇中的特定代表性基因；(g)为选定基因(与nfkb通路相关)的表达动态根据伪时间坐标分为两个分支；三个子簇中的所有单细胞都基于(a)进行着色，并根据伪时间进行排序；
(h)为显示选定的成纤维细胞-中性粒细胞串话途径；红色信号是纤维母细胞发出的配体，蓝色信号是中性粒细胞表达的受体。
[0076]
由图3可以看出，种植体周围炎免疫环境中，增多的中性粒细胞有促炎特性，且cxcl13+成纤维细胞对其招募信号最强。
[0077]
图4为本发明实施例中种植体周围炎免疫微环境中的细胞分化。
[0078]
图4中，(a)为髓系簇的umap，以样本来源类型(h、pd、pi)和聚类进行标注和着色；(b)为h、pd和pi在单核细胞、巨噬细胞、ma-m2和破骨细胞中的比例；(c)为小提琴图，显示了界定每一簇髓系细胞的关键细胞类型标记；(d)为假时间分析，显示了单核细胞、巨噬细胞、ma-m2和破骨细胞等主要细胞群的进展；所有单细胞的轨迹重建显示三个分支:pre-branch,fate 1和fate 2；柱状图中显示了所有细胞的每个分支的百分比；箭头表示细胞的发育轨迹；(e)为热图，显示了(d)中三个分支中不同表达基因的比例表达，分类为三个主要的基因簇(蓝色、绿色和黄色)，这些基因簇随着假时间的变化而变化，并突出显示了每个基因簇右边缘的特定代表性基因；(f)为巨噬细胞、ma-m2、单核细胞和破骨细胞在假时间轨迹上的分布；(g)为选择基因(与破骨细胞分化有关)的表达动态根据伪时间坐标分为两个分支。
[0079]
从图4可以看出，从种植体周围炎(pi)、牙周炎(pd)和健康个体(h)三种样本在单核细胞(monocyte)、巨噬细胞(macrophage)、ma-m2细胞和破骨细胞(osteoclast)中的比例来看，种植体周围炎(pi)的破骨细胞的比例明显比牙周炎(pd)的破骨细胞的比例，种植体周围炎(pi)比牙周炎(pd)更趋向于破骨细胞分化，从免疫微环境的角度阐明了种植体周围炎和牙周炎之间不同的交流模式，解释了种植体周围炎的恶化进程比牙周炎的恶化进程要快的原因，进而对种植体周围炎的相关治疗提供新的思路。
[0080]
图5为本发明实施例中种植体周围炎、牙周炎和健康个体的免疫微环境中的细胞-细胞通讯。
[0081]
图5中，(a)为circo图，如图1d所示，手机预测的10种主要细胞类型之间的潜在细胞相互作用；节点大小表示交互次数；边缘的宽度表示两种细胞类型之间的有效配体-受体对的数量；(b)为手机生成的圆点图，显示pi组中与单核细胞和其他细胞类型相关的潜在配体受体对；(c)为纤维母细胞-单核细胞串扰通路的可视化；红色信号是由成纤维细胞发出的配体，蓝色信号是在单核细胞上表达的受体；两个簇之间的配体-受体对的表达使点着色；(d)为h、pd和pi组成纤维细胞趋化因子的表达；表达式值被归一化和缩放平均值；(e)为以种植体周围炎免疫微环境为中心的预测调控网络。
[0082]
从图5(e)可以看出，从炎症状态下种植体周软组织切除的组织样本中，在分层鳞状上皮(stratified squamous epithelium)的下方，包括b细胞(b cell)、t细胞(t cell)、红细胞(erythrocyte)、成纤维细胞(fibroblast)、单核细胞(monocyte)、巨噬细胞(macrophage)、破骨细胞(osteoclasts)和中性粒细胞(neutrophil)，其中有两条通路，一条为成纤维细胞上的cxcl配体与中性粒细胞上的cxclr受体进行配对，一条为成纤维细胞上的ccl配体与单核细胞、巨噬细胞和破骨细胞的串联通路上的ccr受体进行配对，以此揭示了以种植体周围炎免疫微环境为中心的预测调控网络。
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.基于单细胞测序筛选炎症状态下种植体周软组织特异性细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、样本制备：手术切除种植体周软组织，对切除的组织进行处理，获得种植体周软组织的单细胞悬液；s2、单细胞rna测序，获得种植体周软组织的单细胞的scrna-seq文库；s3、scrna-seq数据统计分析，对获得的scrna-seq文库中的细胞亚群进行聚类分析，找到特征性细胞亚群。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，s1步骤后，还包括：对分离后的单细胞染色，进行细胞活力评估。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，s1步骤中，对切除的组织进行处理，包括：对切除的种植体周软组织先用pbs洗涤，切成小块放在冰上，然后用胶原酶i、胶原酶ii、胶原酶iv和dna酶i在37℃下处理，洗涤、离心，然后在37℃下用0.1％胰蛋白酶消化，消化后将样品通过70μm细胞过滤器筛分，取300g离心，去上清后，将成球的细胞悬浮于红细胞裂解缓冲液中裂解红细胞，用含0.04％bsa的pbs洗涤后，细胞微球在含0.04％bsa的pbs中重新悬浮，并通过35μm细胞过滤器重新过滤，得到种植体周软组织的单细胞悬液。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，s2步骤中，单细胞rna测序，包括：将s1步骤得到的细胞浓缩至大约1000个细胞/μl，使用10x genomics chromium controller仪器和chromium single cell 3’v3.1试剂包，将细胞加载到每个仪器的通道中，生成单细胞凝胶珠-乳珠，将其破碎、纯化并扩增条形码cdna，扩增的被片段化，与适配器连接，将具有条形码cdna的磁珠与细胞配对，并进行指数pcr扩增，使用illumina测序仪进行150bp的配对末端测序，生成scrna-seq文库，使用量子比特高灵敏度dna分析对生成的scrna-seq文库进行量化，并使用生物分析仪2200上的高灵敏度dna芯片确定文库的大小分布。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，s3步骤中，scrna-seq数据统计分析，包括：将scrna-seq数据在novelbio公司的novelbrain云分析平台上进行分析，应用带有默认参数的fastp软件来过滤适配器序列并删除低质量的读取来获得高质量的数据，应用umi工具进行单细胞转录组分析以识别细胞条形码白名单，使用star映射和来自umi工具标准管道的自定义参数，将基于umi的清洁数据映射到人类基因组，以获得每个样本的umi计数，含有>200个表达基因且线粒体umi率<80％的细胞通过细胞质量过滤，线粒体基因在表达表中被删除；使用seurat包，根据每个样本的umi计数和线粒体率，根据表达表进行细胞归一化和回归，以获得缩放数据；基于前2000个高变量基因和前10个原则的比例数据进行主成分分析(pca)，获得基于pca top 10原则的无监督细胞聚类结果，并在以下条件下，使用findallmarker函数和wilcoxon秩和检验算法计算标记基因：(1)log2fc>0.25；(2)p值<0.05；(3)最小pct>0.1；为了确定细胞类型的细节，选择相同细胞类型的聚类进行re-tsne分析、基于图的聚类和标记分析，筛选出特征性细胞亚群。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：s4、拟时序分析：使用ddr树算法和默认参数的monocle2进行单细胞轨迹分析；在monocle分析之前，选取seurat聚类数据的标记基因和通过筛选的细胞的原始表达计数；在拟时间分析的基础上，应用分支表达分析模型对分支命运决定基因进行分析；s5、细胞通信分析：为了系统分析细胞-细胞间的通信分子，使用cellphonedb进行细胞
通信分析，对来自不同时间点的膜蛋白、分泌蛋白和外周蛋白进行注释，通过交互作用计算显著性平均值和细胞通讯显著性(p值<0.05)，通过seurat归一化得到归一化的细胞矩阵；s6、基因富集分析(qusage analysis)，用于描述特定基因的相对通路激活；s7、差异基因表达分析：为了识别样本间的差异表达基因，在以下条件下使用wilcoxon秩和检验算法查找标记函数：(1)log2fc>0.25；(2)p值<0.05；(3)最小pct>0.1。7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，经scrna-seq文库基于无监督聚类分析，筛选出包括成纤维细胞(fibroblast)、肌成纤维细胞(myofibroblast)、内皮细胞(endothelial)、上皮细胞(epithelial)、原生质细胞(plasma)、髓细胞(myeloid cell)、中性粒细胞(neutrophil)、t细胞(t cell)、b细胞(b cell)和肥大细胞(mast)在内的10种细胞类型，并确定这些细胞类型的umap表示和含量百分比，从而获得单细胞组织样本中不同细胞类型在免疫微环境中的浸润情况；与牙周炎软组织样本相比，种植体周软组织样本在免疫微环境中有更多的中性粒细胞(neutrophil)浸润。8.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，经scrna-seq文库基于无监督聚类分析和生物信息拟时序分析，分析包括单核细胞(monocyte)、巨噬细胞(macrophage)、ma-m2细胞和破骨细胞(osteoclast)在内的髓系细胞，并确定这些细胞类型的umap表示和含量百分比；与牙周炎组织样本相比，种植体周软组织样本在免疫微环境中更趋向于破骨细胞分化。9.一种种植体周软组织的特征性细胞亚群，其特征在于，由权利要求1-6任一项所述的基于单细胞测序筛选炎症状态下种植体周软组织特异性细胞的方法获得，获得的种植体周软组织的特征性细胞亚群为炎症因子cxcl13+细胞亚群。10.一种靶向治疗种植体周软组织的生物标记物，其特征在于，包括中和cxcl13+活性的抗体。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及单细胞测序领域，特别是涉及一种基于单细胞测序筛选炎症状态下种植体周软组织特异性细胞的方法，以及由该方法得到的种植体周软组织的特征性细胞亚群。本发明对炎症状态下种植体周软组织进行单细胞测序，筛选出种植体周软组织的特征性细胞亚群，通过转录组水平探究种植周软组织免疫微环境的特异性及细胞之间的交互关系，从而进一步揭示疾病发病机制及指导临床治疗。本发明通过对种植周软组织的单细胞悬液进行生物信息拟时序分析发现，相比于牙周炎，种植体周免疫微环境中更倾向于破骨分化。植体周免疫微环境中更倾向于破骨分化。植体周免疫微环境中更倾向于破骨分化。


技术研发人员：李洁 吴轶群 代庆刚 石超吉
受保护的技术使用者：上海交通大学医学院附属第九人民医院
技术研发日：2023.07.04
技术公布日：2023/10/8