葫芦轻花叶病毒及其侵染性克隆载体、构建方法和应用

1.本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种含rna1和rna2组分的正单链rna病毒葫芦轻花叶病毒(cucurbit mild mosaic virus，cummv)及其侵染性克隆载体、构建方法和应用。


背景技术：

2.葫芦轻花叶病毒cummv是fabavirus病毒属成员，最初被发现侵染南瓜引起叶片花叶症状；之后被发现能侵染葫芦科作物的多年生作物瓜蒌，引起叶片上花叶的症状。fabavirus是secoviridae科comovirinae亚科的病毒属，目前该属已经有8个确定的病毒种。fabaviruses在一些单子叶和许多双子叶中有广泛的宿主范围，已知它们以蚜虫为介体以非持续性的方式进行传播。
3.fabaviruses是一种正单链rna病毒，基因组由两个rna即rna1和rna2组成，其中rna1为5.8-6.4kb，rna2为3.1-4.1kb；rna1和rna2各编码一个多聚蛋白，并被加工成有功能的蛋白质。rna1编码与复制和表达相关的蛋白，包括蛋白酶所需的辅助因子(co-pro)，推定解旋酶(hel)，基因组-连接蛋白(vpg)，蛋白酶(pro)和rna依赖的rna聚合酶(rdrp)。rna2编码运动蛋白(mp)和两种外壳蛋白(lcp和scp)。作为fabavirus属唯一自然条件下侵染葫芦科作物的病毒，cummv仅公布了全基因组序列，缺乏对该病毒生物学特性、致病性等方面的了解。
4.植物病毒的侵染性cdna克隆是研究病毒蛋白功能及病毒与寄主的相互作用的有力工具。通过对植物侵染性克隆基因进行靶向修饰可用于研究植物病毒基因或序列的功能。基于病毒侵染性克隆的衍生载体，例如插入报告基因(β-葡萄糖醛酸酶gus、绿色荧光蛋白gfp等)，可用来跟踪植物病毒在植物中的运动。然而，在fabavirus属中，仅有少部分物种的侵染性克隆被成功构建。
5.目前，未见cummv侵染性克隆的报道。部分病毒具有保守的表达特性，需要准确、完整的序列才能实现表达，对于一些含ploya尾序列的病毒，则需要添加适量的ploya尾实现病毒的致病性；在病毒基因组获得、重组转化及质粒培养、菌株表达等过程都会对病毒的致病性产生影响，需要基于病毒特性、精细把控各环节，从而实现有活性的病毒侵染性克隆的构建。


技术实现要素：

6.本发明的第一目的是提供一种葫芦轻花叶病毒。
7.本发明的第二目的是提供一种侵染性克隆载体及其构建方法和应用。
8.本发明在获得侵染瓜蒌的葫芦轻花叶病毒rna1和rna2全基因组序列基础上，在外源序列引入、基因重组、菌株培养、质粒转化等方面进行了优化，基于含有35s启动子的植物双元表达载体pcb301，分别构建了葫芦轻花叶病毒rna1和rna2全长cdna序列的侵染性克隆，通过农杆菌介导转化后在寄主体内转录、复制、侵染，以用于病毒的功能基因组研究。
9.为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
10.一种葫芦轻花叶病毒(cucurbit mild mosaic virus，cummv)，其rna1和rna2全基因组序列如seq id no：21-22所示。
11.本发明所述的葫芦轻花叶病毒的侵染性克隆载体，分别由葫芦轻花叶病毒cummv的rna1和rna2的全基因组序列融合到带35s启动子和核酶rz的载体pcb301制备得到。
12.进一步的，由葫芦轻花叶病毒cummv的rna1和rna2全基因组序列添加ploya尾后融合到带35s启动子和核酶rz的载体pcb301制备得到。
13.该葫芦轻花叶病毒的侵染性克隆载体的制备方法，包括以下的步骤：
14.(1)获得葫芦轻花叶病毒cummv的rna1和rna2核苷酸全序列﹔
15.(2)将cummv的rna1分为3段，rna2分为2段，分别设计同源重组引物cummv-rna1-insert1f/1r，cummv-rna1-insert2f/2r，cummv-rna1-insert3f/3r，以及cummv-rna2-insert1f/1r，cummv-rna2-insert2f/2r，以瓜蒌病叶rna反转录的cdna为模板进行片段扩增，获得rna1的三个片段：cummv-rna1-insert1、cummv-rna1-insert2和cummv-rna1-insert3以及rna2的两个片段cummv-rna2-insert1和cummv-rna2-insert2。
16.所述引物cummv-rna1-insert1f/1r，cummv-rna1-insert2f/2r，cummv-rna1-insert3f/3r，cummv-rna2-insert1f/1r和cummv-rna2-insert2f/2r的基因序列分别如seq id no：1-10所示；
17.(3)选用stui和smai双酶切pcb301载体，产物与步骤(2)获得的扩增片段进行切胶回收纯化，纯化产物进行同源重组反应，连接产物转化进大肠杆菌后，筛选目的片段插入为阳性的单克隆，进一步测序验证从而获得具有cummv rna1和rna2基因组核苷酸全序列的克隆pcb301-cummv-rna1和pcb301-cummv-rna2；
18.(4)提取含pcb301-cummv-rna1和pcb301-cummv-rna2的质粒，获得葫芦轻花叶病毒的侵染性克隆载体。
19.其中，所述步骤(1)具体包括：
20.1.1)将产生花叶、斑驳、褪绿等疑似受病毒侵染的瓜蒌植物病叶总rna的提取，将样品进行小rna测序；
21.1.2)cummv核苷酸全序列的扩增：根据小rna测序结果组装的contigs，结合病毒数据库中其它cummv的基因组序列，设计基因组扩增引物进行序列扩增，对于cummv的rna1组分，设计三对扩增引物cummv-rna1-1f/1r，cummv-rna1-2f/2r，cummv-rna1-3f/3r(如seq id no：11-16)进行扩增；对于rna2组分，设计两对扩增引物cummv-rna2-1f/1r，cummv-rna2-2f/2r(如seq id no：17-20)进行扩增。扩增产物经胶回收纯化后连接t载体，转化到大肠杆菌，筛选阳性克隆后提取质粒测序，序列拼接获得cummv的全基因组。
22.其中，所述步骤1.2)中的pcr扩增体系为：10μl 5
×
transstart fastpfu buffer、4μl 2.5mm dntps、上下游引物10μm各1μl、1μl cdna模板、1μl transstart fastpfu dna polymerase，32μl ddh2o，总反应体系为50μl；各片段的反应条件为：95℃3min；95℃20s，55℃30s，72℃2min，35个循环；72℃8min。
23.其中，所述步骤(3)中重组反应采用10μl反应体系，其中经stui和smai双酶切线性化克隆载体pcb301 20ng左右，片段cummv-rna1-insert1、cummv-rna1-insert2和cummv-rna1-insert3各50ng左右(或cummv-rna2-insert1、cummv-rna2-insert2各50ng左右)，5
×
ceⅱbuffer 4μl，exnaseⅱ1μl，ddh2o补足体系至10μl；重组反应条件为37℃30min。
24.其中，所述步骤(4)中插入pcb301-cummv-rna1和pcb301-cummv-rna2质粒大肠杆菌的培养条件为，37℃220rpm、避光培养14h。
25.一种携带葫芦轻花叶病毒侵染性克隆的农杆菌菌株，由上述的葫芦轻花叶病毒侵染性克隆载体由电击转化法导入到农杆菌菌株eha105获得。
26.本发明上述的侵染性克隆载体及农杆菌菌株可以用于葫芦轻花叶病毒的致病性分析、病毒基因功能研究。
27.同现有技术相比，本发明的突出效果在于：
28.(1)本发明获得了侵染瓜蒌的葫芦轻花叶病毒全基因组，并将病毒rna1和rna2全长cdna转入高效植物表达载体pcb301上，避免插入突变和碱基缺失，同时添加适宜的ploy a，将rna1和rna2重组载体分别经电击高效转化到农杆菌中，使其具备了高效的侵染能力。本发明为研究葫芦轻花叶病毒的基因组结构、功能、侵染机理及植物与病毒的相互作用等研究提供了成熟的体系。
29.(2)本发明提供的农杆菌菌株可以大量产生葫芦轻花叶病毒的侵染性克隆。
30.(3)采用本发明提供的侵染性克隆载体能高效侵染瓜蒌、黄瓜等多种葫芦科作物，易于操作、重复性好。
31.(4)利用本发明提供的侵染性克隆载体可有效用于葫芦轻花叶病毒的致病性分析。
32.下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的葫芦轻花叶病毒及其侵染性克隆载体、构建方法和应用作进一步说明。
附图说明
33.图1为侵染性克隆载体pcb301-cummv-rna1和pcb301-cummv-rna2构建示意图；
34.图2为cummv农杆菌接种瓜蒌的症状表现及病毒检测结果；
35.其中，a：pcb301空载体模拟接种的健康瓜蒌对照；a：pcb301-cummv接种瓜蒌14天后的症状；
36.b：cummv及对照接种瓜蒌的rt-pcr检测结果，其中，m：dna marker。
37.图3为cummv农杆菌接种黄瓜的症状表现及病毒rt-pcr检测结果；
38.其中，a:pcb301空载体模拟接种的健康黄瓜对照；a：pcb301-cummv接种黄瓜18天后症状。
39.b：cummv及对照接种黄瓜的rt-pcr检测结果，其中，m：dna marker。
40.图4为cummv农杆菌接种其它三种葫芦科作物的症状表现及病毒rt-pcr检测结果；
41.其中，a:pcb301空载体模拟接种的健康甜瓜对照；a：pcb301-cummv接种甜瓜31天后症状。
42.b:pcb301空载体模拟接种的健康西葫芦对照；b：pcb301-cummv接种西葫芦31天后症状。
43.c:pcb301空载体模拟接种的健康西瓜对照；c：pcb301-cummv接种西瓜31天后症状。
44.d：cummv及对照接种三种葫芦科作物的rt-pcr检测结果，其中，m：dna marker。
具体实施方式
45.本发明所提供的实施例如无特殊说明，则均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如表1所示。
46.表1cummv全序列扩增及载体构建引物
[0047][0048]
实施例1葫芦轻花叶病毒基因组全序列的克隆和测定
[0049]
(1)瓜蒌植物病叶总rna的提取及小rna测序
[0050]
取1g瓜蒌病叶样品在液氮中研磨成粉末，加入10ml trizol，涡旋震荡混匀后，室温静置5min,4℃，12000rpm离心20min离心取上清，加入0.3倍体积的氯仿，涡旋震荡混匀，室温放置5min。4℃，12000rpm离心15min。取最上层液相，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置20min。4℃，12000rpm离心20min。去上清，沉淀用70％的乙醇洗涤2次，最后一次离心后将管壁的酒精离心至底部，用枪头吸出。在超净工作台中开盖风干20min，用300μl 65℃预热的depc水溶解。rna质检合格后送至诺禾致源公司进行小rna测序。采用小rna样本预试
试剂盒构建cdna文库。获得的文库首先进行质量控制步骤，然后利用illumina hiseq 2000测序平台进行测序。测序后，通过去除接头序列和低质量序列，从原始reads中获得干净的reads。根据植物病毒小rna的富集特性，筛选18-26bp的srna进行后续分析。用spades和velvet软件将病毒小rna组装成contigs。
[0051]
(2)cummv全序列扩增及全基因组序列测定
[0052]
根据cummv相关contigs序列及在数据库中的比对结果，设计基因组扩增引物进行序列扩增，对于cummv的rna1组分，设计三对扩增引物cummv-rna1-1f/1r，cummv-rna1-2f/2r，cummv-rna1-3f/3r(如seq id no：1-6)进行扩增；对于rna2组分，设计两对扩增引物cummv-rna2-1f/1r，cummv-rna2-2f/2r(如seq id no：7-10)，以瓜蒌病叶rna反转录cdna为模板进行扩增，pcr扩增体系为：10μl 5
×
transstart fastpfu buffer、4μl 2.5mm dntps、上下游引物(10μm)各1μl、1μl cdna模板、1μl transstart fastpfu dna polymerase、32μl ddh2o，总反应体系为50μl；扩增反应条件为：95℃3min；95℃20s，55℃30s，72℃2min，35个循环；72℃8min。扩增产物经胶回收纯化，连接到peasy-blunt载体，转化到大肠杆菌dh5α细胞中提取质粒测序，序列拼接后获得cummv的rna1和rna2全长核苷酸序列，其中rna1为5838nt，rna2为3296nt，如seq id no：21-22所示。
[0053]
实施例2葫芦轻花叶病毒侵染性克隆pcb301-cummv的构建
[0054]
根据实施例1获得的全长核苷酸序列，对病毒rna1和rna2两个组分进行分别构建，采用同源重组的方式，rna1分为3段，rna2分为2段，分别设计同源重组引物cummv-rna1-insert1f/1r，cummv-rna1-insert2f/2r，cummv-rna1-insert3f/3r，以及cummv-rna2-insert1f/1r，cummv-rna2-insert2f/2r(如seq id no：11-20所示)，以瓜蒌病叶rna反转录的cdna为模板进行片段扩增，获得rna1的三个片段：cummv-rna1-insert1、cummv-rna1-insert2和cummv-rna1-insert3；以及rna2的两个片段cummv-rna2-insert1和cummv-rna2-insert2。产物经胶回收纯化后，与经stui和smai双酶切线性化的克隆载体pcb301进行同源重组连接，采用ii one step cloning kit重组克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)进行重组，采用10μl体系反应，其中5
×
ceⅱbuffer 2μl，stui和smai双酶切线性化克隆载体pcb301 20ng，cummv-rna1-insert1、cummv-rna1-insert2和cummv-rna1-insert3各50ng(或cummv-rna2-insert1、cummv-rna2-insert2各50ng)，exnaseⅱ1μl，ddh2o补足体系至10μl；重组反应条件为37℃30min。将连接产物转入大肠杆菌，对于rna1和rna2克隆分别采用cummv-rna1-insert1f/1r和cummv-rna2-insert1f/1r引物对进行阳性克隆筛选，筛选两个阳性克隆进行培养(为28℃220rpm摇床培养14h)、质粒提取和测序，验证插入正确的克隆，命名为pcb301-cummv-rna1和pcb301-cummv-rna2，取200ng pcb301-cummv-rna1和pcb301-cummv-rna2质粒分别加入100μl eha105农杆菌感受态中，通过电击转化将质粒转入到农杆菌eha105，获得具有侵染能力的pcb301-cummv-rna1和pcb301-cummv-rna2(eha105)菌株。
[0055]
实施例3pcb301-cummv侵染性克隆接种
[0056]
分别挑取电击转化的pcb301-cummv-rna1和pcb301-cummv-rna2(eha105)单菌落接种于含有卡那霉素(50mg/l)和利福平(50mg/l)抗性的lb培养基中28℃240rpm振荡培养至od
600
为1.0；然后经4000rpm离心10min收集菌体；用浸润buffer(终浓度为10mm mgcl2，10mm mes(ph 5.6)，200μm乙酰丁香酮(acs))重悬，调整菌液浓度至od
600
为1.0；在室温下避
光放置2～3小时。接种前pcb301-cummv-rna1和pcb301-cummv-rna2进行等体积混合，将用无针头的1ml注射器将约400μl的菌悬液浸润到生长三周的瓜蒌上部两叶背面。对于黄瓜、甜瓜、西葫芦和西瓜的接种，用无针注射器浸透刚伸展开的子叶。将植株置于25℃的生长室内进行培养，光周期为16:8h。
[0057]
实施例4pcb301-cummv侵染性克隆的侵染性测定
[0058]
对接种后的瓜蒌、黄瓜、甜瓜、西葫芦和西瓜进行症状观察。
[0059]
症状观察表明，pcb301-cummv农杆菌浸润接种瓜蒌14天叶片出现花叶症状(图2a)，rt-pcr结果表明症状样品中cummv的存在(图2b)。
[0060]
pcb301-cummv农杆菌浸润的黄瓜从第一片真叶开始出现病毒侵染症状，第18天后黄瓜新生叶出现明显的花叶和褪绿表型(图3a)；rt-pcr结果表明黄瓜症状样品中cummv的存在(图3b)。
[0061]
接种31d后，甜瓜新生叶产生斑点和轻微的花叶症状(图4a)；西葫芦产生明显的花叶表型(图4b)；西瓜除产生花叶症状外，相对于对照还出现矮化症状(图4c)。使用rt-pcr对产生病毒侵染症状和对照样品进行检测，表明产生症状的植物cummv为阳性，对照样本的表现为cummv阴性(图4d)。
[0062]
上述结果表明：构建的pcb301-cummv侵染性克隆具有生物学活性，能成功侵染包括瓜蒌、黄瓜、甜瓜、西葫芦和西瓜等广泛的葫芦科作物。
[0063]
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种葫芦轻花叶病毒(cucurbit mild mosaic virus，cummv)，其特征在于：其rna1和rna2全基因组序列如seq id no：21-22所示。2.权利要求1所述的葫芦轻花叶病毒的侵染性克隆载体，其特征在于：分别由葫芦轻花叶病毒rna1和rna2的全基因组序列融合到带35s启动子和核酶rz的载体pcb301制备得到。3.权利要求2所述侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于：包括以下的步骤：(1)将葫芦轻花叶病毒cummv的rna1分为3段，rna2分为2段，分别设计同源重组引物cummv-rna1-insert1f/1r，cummv-rna1-insert2f/2r，cummv-rna1-insert3f/3r，以及cummv-rna2-insert1f/1r，cummv-rna2-insert2f/2r，以瓜蒌病叶rna反转录的cdna为模板进行片段扩增，获得rna1的三个片段：cummv-rna1-insert1、cummv-rna1-insert2和cummv-rna1-insert3；以及rna2的两个片段cummv-rna2-insert1和cummv-rna2-insert2；所述引物cummv-rna1-insert1f/1r、cummv-rna1-insert2f/2r、cummv-rna1-insert3f/3r、cummv-rna2-insert1f/1r和cummv-rna2-insert2f/2r的基因序列分别如seq id no：1-10所示；(2)选用stui和smai双酶切pcb301载体，产物与步骤(1)获得的扩增片段进行切胶回收纯化，纯化产物进行同源重组反应，连接产物转化进大肠杆菌后，筛选目的片段插入为阳性的单克隆，进一步测序验证从而获得具有cummv rna1和rna2基因组核苷酸全序列的克隆pcb301-cummv-rna1和pcb301-cummv-rna2；(3)培养含pcb301-cummv-rna1和pcb301-cummv-rna2质粒的大肠杆菌，提取质粒，获得葫芦轻花叶病毒的侵染性克隆载体。4.根据权利要求3所述的侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)具体包括：针对葫芦轻花叶病毒cummv的rna1组分，设计三对扩增引物cummv-rna1-1f/1r，cummv-rna1-2f/2r，cummv-rna1-3f/3r进行扩增；对于rna2组分，设计两对扩增引物cummv-rna2-1f/1r，cummv-rna2-2f/2r进行扩增；扩增产物经胶回收纯化后连接到peasy-blunt载体，转化到大肠杆菌，经阳性筛选后提取质粒测序，序列拼接后分别获得cummv rna1和rna2的全基因组序列；pcr扩增体系为：10μl 5
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transstart fastpfu buffer、4μl 2.5mm dntps、上下游引物10μm各1μl、1μl cdna模板、1μl transstart fastpfu dna polymerase，32μl ddh2o，总反应体系为50μl；各片段的反应条件为：95℃3min；95℃20s，55℃30s，72℃2min，35个循环；72℃8min。5.根据权利要求3所述的侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)中cummv-rna1-insert3和cummv-rna2-insert2片段分别在cummv rna1和rna2基因组序列后添加25个ploy a尾序列。6.根据权利要求3所述的侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)中重组反应采用10μl反应体系，其中经stui和smai双酶切线性化克隆载体pcb301 20ng；片段cummv-rna1-insert1、cummv-rna1-insert2和cummv-rna1-insert3各50ng，或cummv-rna2-insert1、cummv-rna2-insert2各50ng；5
×
ceⅱbuffer 4μl，exnaseⅱ1μl，ddh2o补足体系至10μl；重组反应条件为37℃30min。7.根据权利要求3所述的侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中插入pcb301-cummv-rna1和pcb301-cummv-rna2质粒大肠杆菌的培养条件为，37℃220rpm、避
光培养14h。8.权利要求2所述的侵染性克隆载体在葫芦轻花叶病毒的致病性分析、病毒基因功能研究中的应用。9.一种携带葫芦轻花叶病毒侵染性克隆的农杆菌菌株，其特征在于：由权利要求2所述的葫芦轻花叶病毒侵染性克隆载体由电击转化法导入到农杆菌菌株eha105获得。10.权利要求9所述农杆菌菌株在葫芦轻花叶病毒的致病性分析、病毒基因功能研究中的应用。

技术总结
本发明公开了一种葫芦轻花叶病毒及其侵染性克隆载体、构建方法和应用，所述葫芦轻花叶病毒(Cucurbit mild mosaic virus，CuMMV)的RNA1和RNA2全基因组序列如SEQ IDNo：21-22所示。该葫芦轻花叶病毒的侵染性克隆载体分别由葫芦轻花叶病毒RNA1和RNA2的全基因组序列融合到带35S启动子和核酶Rz的载体pCB301制备得到。通过农杆菌介导转化后在寄主体内转录、复制、侵染，以用于病毒的功能基因组研究。本发明为研究该病毒基因组结构和功能，以及其与葫芦科作物的相互作用研究提供了成熟的体系。芦科作物的相互作用研究提供了成熟的体系。芦科作物的相互作用研究提供了成熟的体系。


技术研发人员：杨秀玲 周雪平 陈诚 杜敏
受保护的技术使用者：中国农业科学院植物保护研究所
技术研发日：2023.07.06
技术公布日：2023/10/8