具有强力抗肿瘤活性的靶向TLR9的球形核酸的制作方法

具有强力抗肿瘤活性的靶向tlr9的球形核酸
1.本技术是cn201780038253.x的分案申请。
2.关联申请
3.本技术根据35 u.s.c.
§
119(e)要求2016年5月6日提交的发明名称为“具有强力抗肿瘤活性的靶向tlr的球形核酸”的美国临时申请序列号62/333,139以及2017年4月3日提交的发明名称为“具有强力抗肿瘤活性的靶向tlr的球形核酸”的美国临时申请序列号62/480,936的优先权，通过引用将它们整体并入本文。
4.发明背景
5.免疫系统是高度进化的、异常精密的内源性机制，用于清除外来的、有害的和不必要的物质，包括病原体以及衰老的或恶性的宿主细胞。已知为了治疗或预防目的而调节免疫系统是可能的，其通过引入调节具体免疫细胞活性的化合物。在正在开发的免疫刺激性化合物中，toll样受体(tlr)激动剂已显示出突出的潜力。在一些例子中，诸如单磷酰脂质a(mpl)之类的tlr4激动剂已在各个国家进入临床试验和批准的后期。尽管有这些有希望的结果，但对能够安全和有效诱导能清除胞内病原体和癌症的应答的化合物仍然有着明确和重要的需求，例如细胞介导的免疫的诱导剂。tlr 3、tlr 7/8和tlr 9激动剂由于其诱导th1细胞介导的免疫应答的强大能力而具有极佳潜力。合成的tlr 7/8激动剂咪喹莫特(imiquimod)已被批准用于治疗各种皮肤病，包括浅表癌和生殖器疣，并且正在开发用于各种其他适应症。类似地，tlr 9激动剂正处于临床开发的各个阶段，用于治疗带有大量未满足医学需求的各种疾病。然而，由于缺乏疗效、脱靶硫代磷酸酯酯效应和毒性这些担心，已拖慢了tlr 7/8和9激动剂的有效临床应用。
6.发明概述
7.本公开的一些方面包括免疫刺激性球形核酸(is-sna)，其包含具有寡核苷酸壳核和检查点抑制剂，该寡核苷酸壳包含位于核外部的免疫刺激性寡核苷酸。
8.在一些实施方案中，核是实心核或空心核。在另一实施方案中，核是实心核，其包含了包括金和银在内的贵金属，包括铁和钴在内的过渡金属，包括二氧化硅在内的金属氧化物，聚合物或其组合。在其他实施方案中，核是实心聚合物核，其中聚合物核包含了两亲性嵌段共聚物，包括聚苯乙烯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚羟基乙酸、聚己内酯在内的疏水聚合物以及其他生物相容性聚合物。
9.在一些实施方案中，核是脂质体核。在另一实施方案中，脂质体核包含选自以下的一种或多种脂质：诸如鞘氨醇、鞘氨醇磷酸酯、甲基鞘氨醇和二氢鞘氨醇、神经酰胺、神经酰胺磷酸酯、1-0酰基神经酰胺、二氢神经酰胺、2-羟基神经酰胺、鞘磷脂、糖基化鞘脂、硫苷脂、神经节苷脂、鞘磷脂及各种长度和饱和状态的植物鞘氨醇以及它们的衍生物的鞘脂，诸如磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酸、溶血磷脂酸、环状lpa、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、肌醇磷酸酯、lpi、心磷脂、溶血心磷脂、双(单酰甘油)磷酸酯、(二酰甘油)磷酸酯、醚脂、二植烷醚脂及各种长度、饱和状态的缩醛磷脂以及它们的衍生物的磷脂，诸如胆固醇、脱氢胆固醇、豆甾醇、羊毛甾醇、烯胆烷醇、薯蓣皂苷元、谷甾醇、酵母甾醇、zymostenol、14-脱甲基羊
毛甾醇、胆固醇硫酸酯、dhea、dhea硫酸盐、14-脱甲基-14-脱氢羊毛甾醇、谷甾烷醇、菜油甾醇、醚阴离子脂质、醚阳离子脂质、镧系螯合脂质、a-环取代氧化固醇、b-环取代氧化固醇、d-环取代氧化固醇、侧链取代氧化固醇、双取代氧化固醇、胆甾烷酸衍生物、氟化固醇、荧光甾醇、磺化固醇、磷酸化固醇及不同长度、饱和状态的多不饱和固醇及其衍生物的固醇。在其他实施方案中，脂质体核包括一种类型的脂质。在另一实施方案中，脂质体核包括2-10种不同脂质。
10.在一些实施方案中，将检查点抑制剂掺入脂质体核。在另一实施方案中，将检查点抑制剂与is-sna一起配制在组合物中。在其他实施方案中，检查点抑制剂选自单克隆抗体、人源化抗体、全人源抗体、融合蛋白或其组合或者小分子。在另一实施方案中，检查点抑制剂抑制选ctla-4、pdl1、pdl2、pd1、b7-h3、b7-h4、btla、hvem、tim3、gal9、lag3、vista、kir、2b4、cd160、cgen-15049、chk 1、chk2、a2ar、b-7家族配体或其组合的检查点蛋白。在一些实施方案中，检查点抑制剂是抗pd-1抗体。在一些实施方案中，抗pd-1抗体是bms-936558(纳武单抗(nivolumab))。在一些实施方案中，检查点抑制剂是抗pdl1抗体。在另一实施方案中，抗pdl1抗体是mpdl3280a(阿特朱单抗(atezolizumab))。在另一实施方案中，检查点抑制剂是抗ctla-4抗体。在其他实施方案中，抗ctla-4抗体是伊匹单抗(ipilimumab)。
11.在一些实施方案中，一种或多种免疫刺激性寡核苷酸包含选自seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6和seq id no:7的序列。
12.本公开的一些方面包括用于治疗癌症的方法，包括通过静脉内注射给予患有癌症的受试者治疗癌症有效量的免疫刺激性球形核酸(is-sna)，该球形核酸包括核和寡核苷酸壳，该寡核苷酸壳包含位于核外部的免疫刺激性寡核苷酸。
13.在一些实施方案中，给予受试者is-sna至少4次，每次给药间隔至少3天。在其他实施方案中，每周给予受试者is-sna一次共4-12周。
14.在一些实施方案中，该方法还包括给予受试者检查点抑制剂。在其他实施方案中，is-sna和检查点抑制剂是同天给予的。在另一实施方案中，is-sna和检查点抑制剂是在不同天给予的。在一些实施方案中，检查点抑制剂是在is-sna之前给予的。
15.在一些实施方案中，is-sna诱导细胞因子分泌。在一些实施方案中，is-sna诱导th1型细胞因子分泌。在某些实施方案中，相对于不连接到is-sna的线性免疫刺激性寡核苷酸，is-sna中的免疫刺激性寡核苷酸增加了效应t细胞与调节t细胞的比例。
16.在一些实施方案中，is-sna是本文所描述的任何is-sna。在一些实施方案中，is-sna靶向受试者细胞中的tlr9受体。
17.在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，受试者是人。
18.在一些实施方案中，癌症选自胆道癌；脑癌；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食管癌；胃癌；上皮内肿瘤；淋巴瘤；肝癌；肺癌(例如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)；黑色素瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；睾丸癌；甲状腺癌；和肾癌。
19.本公开的其他方面提供了用于治疗癌症的方法，包括给予患有癌症的受试者治疗癌症有效量的免疫刺激性球形核酸(is-sna)和检查点抑制剂，该球形核酸包括核和寡核苷酸壳，该寡核苷酸壳包含位于核外部的免疫刺激性寡核苷酸。
20.在一些实施方案中，is-sna和检查点抑制剂的联合给药对受试者的存活产生了协
同效应。
21.在其他实施方案中，is-sna和检查点抑制剂是同天给予的。在另一实施方案中，is-sna和检查点抑制剂是在不同天给予的。在其他实施方案中，检查点抑制剂是在is-sna之前给予的。
22.在一些实施方案中，is-sna诱导细胞因子分泌。在一些实施方案中，is-sna诱导th1型细胞因子分泌。在某些实施方案中，相对于不连接到is-sna的线性免疫刺激性寡核苷酸，is-sna中的免疫刺激性寡核苷酸增加了效应t细胞与调节t细胞的比例。
23.在一些实施方案中，is-sna是本文所描述的任何is-sna。在一些实施方案中，is-sna靶向受试者细胞中的tlr9受体。
24.在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，受试者是人。
25.在一些实施方案中，检查点抑制剂选自单克隆抗体、人源化抗体、全人源抗体、融合蛋白或其组合或者小分子。在另一实施方案中，检查点抑制剂抑制选自ctla-4、pdl1、pdl2、pd1、b7-h3、b7-h4、btla、hvem、tim3、gal9、lag3、vista、kir、2b4、cd160、cgen-15049、chk 1、chk2、a2ar、b-7家族配体或其组合的检查点蛋白。在一些实施方案中，检查点抑制剂是抗pd-1抗体。在另一实施方案中，抗pd-1抗体是bms-936558(纳武单抗)。在一些实施方案中，检查点抑制剂是抗pdl1抗体。在另一实施方案中，抗pdl1抗体是mpdl3280a(阿特朱单抗)。在其他实施方案中，检查点抑制剂是抗ctla-4抗体。在一些实施方案中，抗ctla-4抗体是伊匹单抗。
26.在一些实施方案中，is-sna诱导细胞因子分泌。在一些实施方案中，is-sna诱导th1型细胞因子分泌。在某些实施方案中，相对于不连接到is-sna的线性免疫刺激性寡核苷酸，is-sna中的免疫刺激性寡核苷酸增加了效应t细胞与调节t细胞的比例。
27.在一些实施方案中，is-sna是本文所描述的任何is-sna。在一些实施方案中，is-sna靶向受试者细胞中的tlr9受体。
28.在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，受试者是人。
29.在其他方面，本公开提供了用于治疗癌症的方法，包括通过瘤内或皮下注射给予患有癌症的受试者治疗癌症有效量的免疫刺激性球形核酸(is-sna)，该球形核酸包括核和寡核苷酸壳，该寡核苷酸壳包含位于核外部的免疫刺激性寡核苷酸，其中给予受试者is-sna至少4次，每次给药间隔至少3天。
30.在一些实施方案中，核是实心或空心核。在其他实施方案中，核是实心核，包含了包括金和银在内的贵金属，包括铁和钴在内的过渡金属，包括二氧化硅在内的金属氧化物，聚合物或其组合。在另一实施方案中，核是实心聚合物核，其中聚合物核包含了两亲性嵌段共聚物，包括聚苯乙烯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚羟基乙酸、聚己内酯在内的疏水聚合物以及其他生物相容性聚合物。
31.在一些实施方案中，核是脂质体核。在其他实施方案中，脂质体核包含选自以下的一种或多种脂质：诸如鞘氨醇、鞘氨醇磷酸酯、甲基鞘氨醇和二氢鞘氨醇、神经酰胺、神经酰胺磷酸酯、1-0酰基神经酰胺、二氢神经酰胺、2-羟基神经酰胺、鞘磷脂、糖基化鞘脂、硫苷脂、神经节苷脂、鞘磷脂及各种长度和饱和状态的植物鞘氨醇以及它们的衍生物的鞘脂，诸如磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酸、溶血磷脂酸、环状lpa、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、肌
醇磷酸酯、lpi、心磷脂、溶血心磷脂、双(单酰甘油)磷酸酯、(二酰甘油)磷酸酯、醚脂、二植烷醚脂及各种长度、饱和状态的缩醛磷脂以及它们的衍生物的磷脂，诸如胆固醇、脱氢胆固醇、豆甾醇、羊毛甾醇、烯胆烷醇、薯蓣皂苷元、谷甾醇、酵母甾醇、zymostenol、14-脱甲基羊毛甾醇、胆固醇硫酸酯、dhea、dhea硫酸盐、14-脱甲基-14-脱氢羊毛甾醇、谷甾烷醇、菜油甾醇、醚阴离子脂质、醚阳离子脂质、镧系螯合脂质、a-环取代氧化固醇、b-环取代氧化固醇、d-环取代氧化固醇、侧链取代氧化固醇、双取代氧化固醇、胆甾烷酸衍生物、氟化固醇、荧光甾醇、磺化固醇、磷酸化固醇及不同长度、饱和状态的多不饱和固醇及其衍生物的固醇。在一些实施方案中，脂质体核包括一种类型的脂质。在其他实施方案中，脂质体核包括2-10种不同脂质。
32.在一些实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸是cpg寡核苷酸。在其他实施方案中，cpg寡核苷酸是b类cpg寡核苷酸。在另一实施方案中，cpg寡核苷酸是c类cpg寡核苷酸。在一些实施方案中，cpg寡核苷酸是a类cpg寡核苷酸。在其他实施方案中，cpg寡核苷酸是a类cpg寡核苷酸、b类cpg寡核苷酸和c类cpg寡核苷酸的混合物。在另外的实施方案中，cpg寡核苷酸的长度为4-100个核苷酸。
33.在一些实施方案中，寡核苷酸壳的寡核苷酸是放射状朝向外部的。在其他实施方案中，寡核苷酸壳具有5-1,000个寡核苷酸/sna的密度。在另一实施方案中，寡核苷酸壳具有100-1,000个寡核苷酸/sna的密度。在还有的另一实施方案中，寡核苷酸壳具有500-1,000个寡核苷酸/sna的密度。
34.在一些实施方案中，寡核苷酸具有至少一个核苷间硫代磷酸酯连接。在其他实施方案中，cpg寡核苷酸的每一个核苷间连接都是硫代磷酸酯。
35.在一些实施方案中，is-sna诱导细胞因子分泌。在一些实施方案中，is-sna诱导th1型细胞因子分泌。在某些实施方案中，相对于不连接到is-sna的线性免疫刺激性寡核苷酸，is-sna中的免疫刺激性寡核苷酸增加了效应t细胞与调节t细胞的比例。
36.在一些实施方案中，is-sna是本文所描述的任何is-sna。在一些实施方案中，is-sna靶向受试者细胞中的tlr9受体。
37.在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，受试者是人。
38.在其他方面，本公开提供了用于治疗病症的方法，包括经鼻或肌内给予患有病症的受试者治疗病症有效量的免疫刺激性球形核酸(is-sna)和检查点抑制剂，该球形核酸包括核和寡核苷酸壳，该寡核苷酸壳包括位于核外部的免疫刺激性寡核苷酸。在某些实施方案中，病症是癌症。
39.本发明的每一限定都能涵盖本发明的各个实施方案。因此，可以预期的是，涉及任一要素或要素组合的本发明每一限定都能在本发明每一方面中被包括。本发明并不限于其在以下描述中所阐述的或在附图中所显示的组件结构和排列细节中的应用。本发明能够是其他实施方案并以各种方式实施或执行。
40.附图简述
41.附图并不打算按比例绘制。在附图中，各图所图示的每个相同或近似相同的组件都通过同样的数字表示。为了清楚目的，可以不在每幅附图中都标记出每个组件。在附图中：
42.图1是在带有ct26肿瘤的balb/c小鼠中皮下和瘤内递送is-sna(3.2和6.4mg/kg)
的研究设计示意图。
43.图2显示了在带有ct26肿瘤的balb/c小鼠中皮下递送is-sna(3.2和6.4mg/kg)之后所得肿瘤生长和存活(均值
±
sd，n＝8/组)。
44.图3显示了在带有ct26肿瘤的balb/c小鼠中瘤内递送is-sna(3.2和6.4mg/kg)之后所得肿瘤生长和存活(均值
±
sd，n＝8/组)。
45.图4是在带有mc38肿瘤的c57bl/6小鼠中瘤内递送is-sna(0.8、3.2和6.4mg/kg)的研究设计示意图。
46.图5显示了在带有mc38肿瘤的c57bl/6小鼠中瘤内递送is-sna(0.8、3.2和6.4mg/kg)之后所得肿瘤生长曲线(均值
±
sd，n＝10/组)。
47.图6显示了在带有mc38肿瘤的c57bl/6小鼠中瘤内递送is-sna(0.8、3.2和6.4mg/kg)之后所得存活曲线(均值
±
sd，n＝10/组)。
48.图7是在带有emt-6肿瘤的balb/c小鼠中静脉内递送is-sna(0.8mg/kg)的研究设计示意图。
49.图8显示了在带有emt-6肿瘤的balb/c小鼠中瘤内递送is-sna(0.8mg/kg)之后所得肿瘤生长曲线(均值
±
sd，n＝8/组)。
50.图9显示了在带有emt-6肿瘤的balb/c小鼠中瘤内递送is-sna(0.8mg/kg)之后所得存活曲线(均值
±
sd，n＝8/组)。
51.图10是在带有emt-6肿瘤的balb/c小鼠中皮下递送is-sna(0.8mg/kg)的研究设计示意图。
52.图11显示了在带有emt-6肿瘤的balb/c小鼠中皮下递送is-sna(0.8mg/kg)之后所得肿瘤生长曲线(均值
±
sd，n＝8/组)。
53.图12显示了在带有emt-6肿瘤的balb/c小鼠中皮下递送is-sna(0.8mg/kg)之后，引流淋巴结中效应t细胞与调节t细胞的比例(均值
±
sd，n＝8/组)。
54.图13是在带有b16f10黑色素瘤的c57bl/6小鼠中皮下递送is-sna(0.8mg/kg)的研究设计示意图。
55.图14显示了在带有b16f10黑色素瘤的c57bl/6小鼠中皮下递送is-sna(0.8mg/kg)之后所得肿瘤生长曲线(均值
±
sd，n＝10/组)。
56.图15a-15c显示了tlr9激动剂sna的摄取和tlr9活化。在图15a中，用荧光标记的sna1或线性寡核苷酸2tlr9激动剂寡核苷酸处理人pbmc。24小时后，用细胞相关的荧光标记化合物经流式细胞术评估细胞部分。图15b显示了tlr9激动剂在报告细胞中的人tlr9活化。用sna1、线性寡核苷酸2或对照sna5(包含gpc来代替cpg)处理htlr9-hek-blue报告细胞4小时。更换培养基，将细胞再孵育20小时。使用quanti-blue报告测定法来评估nf-κb活化。显示了三次独立实验的均值
±
sem。p值：*《0.05,**《0.005,****《0.0001。图15c显示了tlr9激动剂sna的特异性。用5μm sna1或85nm多聚i:c(htlr3)、0.5μm sna1或1μm r848(htlr7，htlr8)、5μmsna1或5μm对照sna5(htlr9)以及5μm sna1或10μg/ml pma(空(null)1)处理不表达tlr(空1)、表达htlr3、htlr7、htlr8或htlr9的hek-blue报告细胞24小时。如图17b图例所述评估了nf-κb活化。显示了n＝3或4次独立重复的均值+sem。***p《0.001,****p《0.0001。
57.图16显示了sna中的tlr9激动剂寡核苷酸和线性形式在人pbmc中的摄取。用荧光
标记的sna1或线性寡核苷酸2处理人pbmc。24小时后，使用流式细胞术评估每个细胞中细胞相关寡核苷酸的量。均值+sem，n＝4个供体。p值：**《0.01,****《0.0001。
58.图17a-17d显示了原代白细胞和小鼠体内经由tlr9激动剂sna与线性寡核苷酸相比的细胞因子诱导。用tlr9激动剂处理24小时后，使用多重elisa定量原代白细胞的细胞培养上清中的细胞因子(图17a和17b)，或者在皮下给药tlr9激动剂之后的小鼠血清中定量细胞因子(图17c和17d)；显示了四只小鼠的均值+sem。图17a显示了用sna3、线性寡核苷酸4或pbs处理的小鼠脾细胞。对于ifn-γ，用10μm寡核苷酸或1μm寡核苷酸处理细胞。显示了重复孔的均值+sd，代表n＝3次独立实验。图17b显示了用2.5μm sna1、线性寡核苷酸2、对照sna5或pbs处理人pbmc。显示了7-13个独立供体的平均和单独应答。配对t检验p值*《0.05,**《0.01。图17c显示了小鼠中3mg/kg sna3的血清细胞因子应答的时间过程。图17d显示了小鼠中对sna3的剂量依赖性血清细胞因子应答。
59.图18a-18b显示了原代白细胞中经由tlr9激动剂sna的细胞因子诱导。用tlr9激动剂处理24小时之后，使用多重elisa定量原代白细胞的细胞培养上清中的细胞因子。图18a显示了用sna3、线性寡核苷酸4或pbs处理的小鼠脾细胞中的th2和th17细胞因子诱导。用10μm寡核苷酸处理细胞。显示了重复孔的均值+sd，代表n＝3次独立实验。图18b显示了原代hpbmc中经由sna1和对照sna5的细胞因子诱导的剂量反应。显示了来自一个供体的重复孔的均值+sem，代表七次独立实验(供体)。
60.图19a-19b显示了对tlr9激动剂sna的体内小鼠血清细胞因子应答。在皮下给药之后，使用多重elisa定量小鼠血清中的细胞因子。显示了四只小鼠的均值+sem。图19a显示了给药7.5mg/kg sna1之后的时间过程。图19b显示了对sna1和对照sna5的剂量反应。
61.图20a-20c显示了在非人灵长类动物中皮下给药sna1和对照sna5的体内应答。按所示剂量给予食蟹猴sna1或对照sna5。显示了n＝4只猴子的均值+sem。图20a显示了给药24小时后经pbmc流式细胞术测定的免疫细胞活化。图20b显示了给药12小时后的血清细胞因子水平。图20c显示了1mg/kg剂量的血清细胞因子诱导的时间过程。
62.图21显示了在非人灵长类动物中皮下给药sna1的体内血液学变化。按所示剂量皮下注射sna1给食蟹猴。展示了n＝4只猴子的均值+sem。
63.图22a-22f显示了mc38肿瘤荷瘤小鼠中sna单独治疗和与抗pd-1联合。皮下接种mc38结直肠细胞给小鼠以建立胁腹(flank)肿瘤。在肿瘤达到100mm3后开始给药sna和抗pd-1，每三天进行一次共五次给药(由箭头指示)。以所示剂量水平瘤内注射sna。以5mg/kg经腹膜内给药抗pd-1。展示了n＝8只小鼠的平均肿瘤体积+sem。****p《0.0001vs第23天的媒介物对照。第23天时，与媒介物对照相比的肿瘤生长抑制(tgi)。图22a显示了sna3单独治疗。图22b显示了sna3与抗pd-1联合治疗。图22c和22d显示了sna3单独治疗和联合治疗，每周一次或两次给药。每周一次给药是由钩形(hook)指示的。图22e显示了sna1或sna3单独治疗。图22f显示了先用sna3(1.6mg/kg每周两次)处理再联合抗pd-1治疗的小鼠的存活，抗pd-1治疗是在用mc38结直肠细胞经腹膜内(ip)攻击之后进行的。sna3+抗pd-1为n＝4只小鼠，未经实验处理小鼠(mice)n＝6。
64.图23显示了在mc38肿瘤荷瘤小鼠中对sna3给药的细胞因子应答。第一(第9天)剂sna3之后四小时，评估了mc38肿瘤荷瘤小鼠中的血清细胞因子应答。显示了n＝4只小鼠的平均和单独应答。p值：*《0.05,**《0.01,***《0.001,****《0.0001。
65.图24a-24f显示了用sna单独治疗以及与抗pd-1联合治疗的emt6肿瘤。在带有emt6胁腹肿瘤的小鼠中，在1000mm3平均肿瘤体积(mverage tumor volume，mtv)时开始(图24a-24c)或者在肿瘤接种之后三天(d3)开始(图24d)，每三天(图24a、24b、24d)或每周(图24c)皮下注射sna3、sna1、对照sna5或线性寡核苷酸4(总共5个剂量，由箭头指示)。图24a显示了sna3单独治疗。mtv+sem，n＝8只小鼠。*p《0.05,****p《0.0001vs媒介物对照d27。图24b显示了两侧胁腹都荷瘤的小鼠sna3单独治疗。mtv+sem，n＝16。*p《0.05,****p《0.0001vs媒介物对照d34。图24c显示了sna1或对照sna5单独治疗。mtv+sem，n＝10。****p《0.0001vs媒介物对照d25。图24d显示了sna3+抗pd-1联合。在d3开始，每5天皮下注射sna3或线性寡核苷酸4以及腹膜内注射10mg/kg抗pd-1(3个剂量；空心箭头)。mtv+sem，n＝8。tgi vs媒介物对照d27。图24e显示了随后用相同肿瘤细胞系(emt6)在另一侧胁腹再攻击的小鼠。mtv+sem，n＝7。图24f显示随后用来自相同组织(4t1乳腺)或不同组织(ct26结直肠)的不同肿瘤细胞系再攻击的小鼠。mtv+sem，n＝3/组。
66.图25a-25d显示了带有emt6肿瘤的小鼠中sna诱导的抗肿瘤免疫力的生物标志物。用emt6乳腺肿瘤细胞经皮下接种小鼠以建立胁腹肿瘤。肿瘤接种之后三天开始，每三天经皮下注射sna3或线性寡核苷酸4，每5天注射抗pd-1。图25a显示了肿瘤生长。展示了平均肿瘤体积+sem。在第27天时比较了与pbs的p值和tgi。****p《0.0001。图25b-25d：来自肿瘤接种之后第10天时的五只小鼠，图25b：将肿瘤取下通过免疫组织化学进行检查，图25c：取下引流淋巴结进行流式细胞术评估，图25d：通过流式细胞术评估检查了肿瘤的mmdsc。p值：*《0.05,**《0.01,***《0.001vs pbs；#《0.05,##《0.01,###《0.001vs抗pd-1；^^^《0.001vs sna3。
67.图26显示了对静脉内给药sna的小鼠血清细胞因子应答。在皮下(s.c.)或静脉内(i.v.)给药7.5mg/kg sna1之后，使用多重elisa定量了小鼠血清中的细胞因子。展示了n＝4只小鼠的平均和单独应答。p值vs pbs：*《0.05,**《0.01,***《0.001,****《0.0001。
68.图27a-27c显示了带有emt6肿瘤的小鼠中经静脉内给药sna。用emt6乳腺肿瘤细胞经皮下接种小鼠以建立胁腹肿瘤。肿瘤接种之后三天，以所示剂量水平经静脉内注射sna3，每三天一次总共5个剂量(由箭头指示给药事件)，作为单独治疗(图27a)以及与抗pd-1抗体联合(图27b)。展示了n＝8中小鼠的均值+sem。在第20天与媒介物对照相比的p值：**《0.01,***《0.001,****《0.0001。在第20天与媒介物对照相比的tgi。图27c显示了用sna联合治疗经静脉内给药进行治疗的小鼠中的emt6肿瘤再攻击。在第65天时，用1
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(一百万)或2
×
(二百万)emt6细胞在对侧胁腹经皮下再攻击sna+抗pd-1联合治疗组的存活小鼠。展示了n＝6只小鼠的均值+sem。在第95天时与未经实验处理小鼠相比的p值：****《0.0001。
69.发明详述
70.本文描述了被称为is-sna的免疫刺激性球形核酸用于治疗癌症的用途，其作为单独治疗和/或与检查点抑制剂和其他治疗剂联合。is-sna是由紧密包装并放射状朝向球形脂双层周围的免疫刺激性寡核苷酸所组成的新型类别的试剂。这些结构展示了通过清道夫受体和脂筏的参与而无需辅助性递送媒介物或转染试剂就进入细胞的能力。
71.根据本发明令人惊讶地发现，is-sna在通过静脉途径给药时能够有效递送免疫刺激性寡核苷酸到肿瘤。线性tlr9靶向性免疫刺激性寡核苷酸的在先研究未在临床试验健康人志愿者中产生治疗性免疫应答(1)。因此，当本文发现不但免疫刺激性寡核苷酸能够通过
静脉途径被递送给受试者并产生免疫应答，而且如此静脉内给药的寡核苷酸显示出强抗肿瘤活性，这是相当令人惊讶的。如本文所阐述的实施例中所显示的，emt-6肿瘤模型中的is-sna静脉内给药显示出与阴性对照相比的肿瘤体积显著减小。这些发现证明了静脉内递送is sna用于癌症治疗的可行性。
72.研究了诸如ct26结直肠癌、mc38结肠癌、emt-6乳腺癌和b16f10黑色素瘤之类的各种同系小鼠肿瘤模型中is-sna作为单独治疗的抗肿瘤效应，以及在emt-6和b16f10模型中作为与抗pd-1联合治疗的抗肿瘤效应。本文已在肿瘤模型中使用了is-sna的几种给药途径(皮下、瘤内和静脉内)来评估不同给药途径是否能治疗癌症患者。有趣的是，在体内肿瘤模型中is-sna的皮下和瘤内递送显示出同样强力的抗肿瘤活性，这表明is-sna的两种给药途径都是令人满意的。此外，在mc38肿瘤模型中，6.4mg/kg剂量的is-sna瘤内递送产生了肿瘤消退。
73.本文还已发现，当is-sna和检查点抑制剂体内联合给药时，产生了协同治疗反应。诸如pd-1之类的检查点抑制剂已显示出在免疫调节和维持外周耐受方面发挥作用(2)。肿瘤细胞上表达的pd-l1与t细胞上pd-1的相互作用已显示出减弱t细胞活化，从而削弱t细胞对肿瘤的抗肿瘤活性。抑制pd-1和pd-l1相互作用的几种单克隆抗体已在许多肿瘤中证实了抗肿瘤活性。然而，在某些肿瘤类型中反应率更低——例如在三阴性乳腺癌患者中只有18％反应率(3)。本发明的联合治疗将通过提高检查点抑制剂的疗效而给癌症患者提供极大好处。特别是本文证实了is-sna和检查点抑制剂(即pd1抑制剂)的联合在对抗pd-1活性有抗性的两种动物模型(emt-6乳腺癌和b16f10黑色素瘤小鼠肿瘤模型)中产生了强力抗肿瘤反应。实施例所显示的结果证实，is-sna与pd-1抑制剂的联合在这些模型中提供了比is-sna单独更强的抗肿瘤效应。在肿瘤体积减小和存活时间增加两方面都是协同性结果。总之，这些研究证实了is-sna作为免疫肿瘤试剂与检查点抑制剂联合的实用性。
74.因此，在一些方面，本发明涉及is-sna和检查点抑制剂的联合治疗。is-sna可以与检查点抑制剂一起给药。术语“一起”或“共同给药”是指包括递送两种治疗剂给患者或受试者的治疗。两种治疗剂可以在单一组合物中同时一起递送，使用相同或不同给药途径的分开的组合物中递送，或者使用相同或不同给药途径在不同时间递送。
75.在一些实施方案中，将is-sna和检查点抑制剂两者都给予受试者。两者的给药时间可以不同。在一些实施方案中，优选在给药is-sna之后给药检查点抑制剂。在一些实施方案中，在检查点抑制剂给药之前以及基本上同时或之后将is-sna给予受试者。is-sna和检查点抑制剂的给药也可以是互斥的，以使得在治疗时间段期间的任意特定时间，只有一种这些试剂在受试者中有活性。另外，在一些优选例子中，两种试剂的给药有交叉，以便两种试剂在受试者中同时都有活性。
76.在一些实施方案中，is-sna是基于每周或每两周给药，检查点抑制剂更频繁地给药(例如每天)。然而，如果is-sna的剂量充分降低的话，就有可能以与检查点抑制剂相同频率给药is-sna，尽管是以减少的剂量。
77.在一些情况下，is-sna和/或检查点抑制剂基本上是在除去肿瘤的手术之前或之后给药的。如本文所使用的“基本上...之前或之后”意指除去肿瘤的手术之前或之后至少六个月、至少五个月、至少四个月、至少三个月、至少两个月、至少一个月、至少三周、至少两周、至少一周、至少5天或者至少2天。
78.类似地，可以在给药检查点抑制剂之前或之后立即给药is-sna(例如给药48小时内、24小时内、12小时内、6小时内、4小时内、3小时内、2小时内、1小时内、30分钟内或者10分钟内)，或者基本上与检查点抑制剂同时给药(例如在受试者接受检查点抑制剂的时间期间)。
79.在本发明的其他实施方案中，按常规计划给药is-sna。也可按常规计划给药检查点抑制剂，但另外可以根据所需来给药。如本文所使用的“常规计划”是指预先确定的规定时段。常规计划可以包括时长相同或不同的时段，只要计划是预先确定的。例如，日常计划可包括按天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、按周、按双周、按双月或者之间的任意设定天数或周数、每两个月、每三个月、每四个月、每五个月、每六个月、每七个月、每八个月、每九个月、每十个月、每十一个月、每十二个月等给药is-sna。另外，预先确定的常规计划可包括第一周按天给药is-sna，接下来的几个月按月给药，然后，在那之后每三个月给药。任何具体组合都将被常规计划所涵盖，只要提前确定了合适计划包括在某一天给药。
80.检查点蛋白包括但不限于pd-1、tim-3、vista、a2ar、b7-h3、b7-h4、btla、ctla-4、ido、kir和lag3。ctla-4、pd-1及其配体是共信号传导分子cd28-b7家族的成员，其在t细胞功能和其他细胞功能的所有阶段都发挥重要作用。ctla-4即细胞毒t淋巴细胞相关蛋白4(cd152)参与调控t细胞增殖。
81.pd-1受体表达在活化t细胞(和b细胞)表面上，在正常情况下，它结合在诸如树突状细胞或巨噬细胞之类的抗原提呈细胞表面上表达的它的配体(pd-l1和pd-l2)。这一相互作用发送信号到t细胞中并抑制它。癌细胞通过驱使pd-l1在其表面上的高水平表达而利用该系统。这就使它们能够获得对pd-1通路的控制并关闭表达pd-1的可以进入肿瘤微环境的t细胞，从而抑制抗癌免疫应答。pembrolizumab(以前的mk-3475和lambrolizumab，商品名keytruda)是用于癌症免疫治疗的人抗体。它靶向pd-1受体。
82.ido即吲哚胺2,3-双加氧酶是色氨酸分解酶，其抑制t细胞和nk细胞，产生并活化treg和髓源性抑制细胞，并促进肿瘤血管生成。tim3(t细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白(mucin)结构域3)作为th1/tc1功能的负调控因子起作用，一旦与其配体(半乳糖结合蛋白-9)相互作用就触发细胞死亡。vista，t细胞活化的v-结构域ig抑制因子。
83.检查点抑制剂可以是诸如单克隆抗体、人源化抗体、全人源抗体、融合蛋白或其组合或小分子之类的分子。例如，检查点抑制剂抑制检查点蛋白，其可以是ctla-4、pdl1、pdl2、pd1、b7-h3、b7-h4、btla、hvem、tim3、gal9、lag3、vista、kir、2b4、cd160、cgen-15049、chk 1、chk2、a2ar、b-7家族配体或其组合。检查点蛋白的配体包括但不限于ctla-4、pdl1、pdl2、pd1、b7-h3、b7-h4、btla、hvem、tim3、gal9、lag3、vista、kir、2b4、cd160、cgen-15049、chk 1、chk2、a2ar和b-7家族配体。在一些实施方案中，抗pd-1抗体是bms-936558(纳武单抗)。在其他实施方案中，抗ctla-4抗体是伊匹单抗(商品名yervoy，以前被称为mdx-010和mdx-101)。
84.is-sna是由紧密包装的放射状朝向的核酸组成的，其刺激免疫应答特别是刺激诸如tlr9之类的toll样受体(tlr)。在一些实施方案中，is-sna是tlr的激动剂(tlr激动剂)。如本文所使用的tlr激动剂是与tlr相互作用并刺激tlr活性的核酸分子。在一些实施方案中，is-sna是靶向tlr-9的免疫刺激性球形核酸。
85.toll样受体(tlr)是在哺乳动物固有免疫中发挥关键作用的高度保守多肽家族。
已鉴别到至少十个家族成员，命名为tlr1-tlr10。各种tlr的胞质结构域是以toll-白介素1(il-1)受体(tir)结构域为特征的。medzhitov r等.(1998)mol cell 2:253-8。通过tlr对微生物入侵的识别就触发了信号级联的激活，其在果蝇和哺乳动物中都是进化上保守的。已报道了包含tir结构域的衔接蛋白myd88与tlr关联并将il-1受体相关激酶(irak)和肿瘤坏死因子(tnf)受体相关因子6(traf6)募集到tlr。据信myd88依赖的信号通路引起了nf-κb转录因子和c-jun氨基末端激酶(jnk)丝裂原活化蛋白激酶(mapk)的活化，这是免疫活化和炎性细胞因子产生的关键步骤。综述参见aderem a等.(2000)nature 406:782-87。
86.据信tlr在各种组织中和各种类型免疫细胞上分化表达。例如，已报道tlr7在胎盘、肺、脾、淋巴结、扁桃体中和浆细胞样前体树突状细胞(pdc)上表达。chuang t-h等.(2000)eur cytokine netw11:372-8)；kadowaki n等.(2001)j exp med 194:863-9。已报道tlr8在肺、外周血白细胞(pbl)、胎盘、脾、淋巴结中和单核细胞上表达。kadowaki n等.(2001)j exp med 194:863-9；chuang t-h等.(2000)eur cytokine netw 11:372-8。据报道，人tlr9在脾、淋巴结、骨髓、pbl中以及pdc和b细胞上表达。kadowaki n等.(2001)j exp med194:863-9；bauer s等.(2001)proc natl acad sci usa 98:9237-42；chuang t-h等.(2000)eur cytokine netw 11:372-8。
87.人和鼠tlr9的核酸和氨基酸序列是已知的。参见例如genbank登记号nm_017442、af259262、ab045180、af245704、ab045181、af348140、af314224、nm_031178；以及np_059138、aaf72189、bab19259、aaf78037、bab19260、aak29625、aak28488和np_112455，通过引用将其全部内容并入本文。据报道，人tlr9存在至少两个异形体，一个为1032个氨基酸长，另一个为1055个氨基酸长。鼠tlr9为1032个氨基酸长。tlr9多肽包括带有富含亮氨酸重复区的胞外结构域、跨膜结构域和包括了tir结构域的胞内结构域。
88.如本文所使用的术语“tlr9信号传导”是指与通过tlr9信号传导相关联的胞内信号传导的任何方面。如本文所使用的术语“tlr9介导的免疫应答”是指与tlr9信号传导相关联的免疫应答。tlr9介导的免疫应答是与tlr9信号传导相关联的应答。该应答的更多特征至少有ifn-γ和il-12的产生/分泌，尽管其水平低于通过tlr-8介导的免疫应答所获得的。
89.术语“tlr9激动剂”是指能够增强tlr9信号传导的任何试剂(即tlr9的激动剂)。tlr9激动剂具体包括但不限于免疫刺激性寡核苷酸，特别是cpg免疫刺激性寡核苷酸。
90.如本文所使用的“免疫刺激性寡核苷酸”是包含能够诱导免疫应答的免疫刺激性基序或主链的任何核酸(dna或rna)。免疫应答诱导是指免疫细胞数量或活性的任意增加，或者诸如细胞因子之类的免疫因子表达或绝对水平的增加。免疫细胞包括但不限于nk细胞、cd4+t淋巴细胞、cd8+t淋巴细胞、b细胞、树突状细胞、巨噬细胞和其他抗原提呈细胞。
91.本身所使用的术语“cpg寡核苷酸”、“免疫刺激性cpg核酸”或“免疫刺激性cpg寡核苷酸”是指能够活化免疫细胞的任何包含cpg的寡核苷酸。cpg二核苷酸中的至少c一般是非甲基化的。免疫刺激性cpg寡核苷酸描述于许多已授权专利和已公开专利申请中，包括美国专利号6,194,388；6,207,646；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705和6,429,199。
92.在一些实施方案中，cpg寡核苷酸长度为4-100个核苷酸。在其他实施方案中，cpg寡核苷酸长度为4-90、4-80、4-70、4-60、4-50、4-40、4-30、4-20或4-10个核苷酸。
93.在一些实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸具有诸如硫代磷酸酯(ps)主链之类的修饰主链。在其他实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸具有磷酸二酯(po)主链。在还有的其他实
施方案中，免疫刺激性寡核苷酸具有混合的po和ps主链。cpg寡核苷酸可以是a类寡核苷酸、b类寡核苷酸或c类寡核苷酸。“a类”cpg免疫刺激性核酸已描述于公布的pct申请wo 01/22990中。这些寡核苷酸的特征在于诱导高水平干扰素-α而对b细胞活化影响极小的能力。a类cpg免疫刺激性核酸可包含yamamoto和同事所描述的六聚体回文gacgtc、agcgct或aacgtt。yamamoto s等.j immunol 148:4072-6(1992)。传统a类寡核苷酸具有富含多聚g的5'和3'末端以及回文中部区域。一般而言，5'和3'末端的核苷酸具有稳定的核苷酸间连接，中部回文区域具有磷酸二酯连接(嵌合体)。
94.b类cpg免疫刺激性核酸强力活化人b细胞但对诱导干扰素-α影响极小而无需另外的修饰。传统上而言，b类寡核苷酸包括序列5'tcn1tx1x2cgx3x
4 3'(seq id no:9)，其中x1是g或a；其中x2是t、g或a；x3是t或c；x4是t或c；以及n是任意核苷酸，n1和n2是每个约0-25个n的核酸序列。通常完全稳定且在某些优选碱基范围内包括非甲基化cpg二核苷酸的b类cpg寡核苷酸在活化b细胞方面是强大的，但是在诱导ifn-α和nk细胞活化方面相对较弱。参见例如美国专利号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116和6,339,068。
95.在一个实施方案中，b类cpg寡核苷酸由至少以下通式表示：
96.5'x1x2cgx3x
4 3'(seq id no:11)
97.其中x1、x2、x3和x4是核苷酸。在一个实施方案中，x2是腺嘌呤、鸟嘌呤或胸腺嘧啶。在另一实施方案中，x3是胞嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶。
98.在另一实施方案中，本发明提供了分离的b类cpg寡核苷酸，由至少以下通式表示：
99.5'n1x1x2cgx3x4n
2 3'(seq id no:10)
100.其中x1、x2、x3和x4是核苷酸，n是任意核苷酸，n1和n2是由每个约0-25个n所组成的核酸序列。在一个实施方案中，x1x2是选自gpt、gpg、gpa、apa、apt、apg、cpt、cpa、cpg、tpa、tpt和tpg的二核苷酸；x3x4是选自tpt、apt、tpg、apg、cpg、tpc、apc、cpc、tpa、apa和cpa的二核苷酸。优选地，x1x2是gpa或gpt且x3x4是tpt。在其他实施方案中，x1或x2或两者都是嘌呤且x3或x4或两者都是嘧啶，或者x1x2是gpa且x3或x4或两者都是嘧啶。在另一优选实施方案中，x1x2是选自tpa、apa、apc、apg和gpg的二核苷酸。在还有的另一实施方案中，x3x4是选自tpt、tpa、tpg、apa、apg、gpa和cpa的二核苷酸。x1x2在另一实施方案中是选自tpt、tpg、apt、gpc、cpc、cpt、tpc、gpt和cpg的二核苷酸；x3是选自a和t的核苷酸且x4是核苷酸，但是其中当x1x2是tpc、gpt或cpg时，x3x4不是tpc、apt或apc。
101.在另一优选实施方案中，cpg寡核苷酸具有序列5'tcn1tx1x2cgx3x
4 3'(seq id no:9)。本发明一些实施方案中的cpg寡核苷酸包括x1x2选自gpt、gpg、gpa和apa且x3x4选自tpt、cpt和tpc。
102.c类免疫刺激性核酸包含至少两个不同基序，其具有对免疫系统细胞独特且希望的刺激性效应。这些odn中的一些同时具有传统“刺激性”cpg序列和“富含gc的”或“b细胞中和性”基序。这些组合基序核酸具有介于与传统“b类”cpg odn相关联的效应和与a类cpg odn相关联的效应两者之间的免疫刺激性效应，“b类”cpg odn是b细胞活化和树突状细胞(dc)活化的强诱导剂，a类cpg odn是ifn-α和自然杀伤(nk)细胞活化的强诱导剂但是b细胞和dc活化的相对弱的诱导剂。krieg am等.(1995)nature 374:546-9；ballas zk等.(1996)j immunol 157:1840-5；yamamoto s等.(1992)j immunol148:4072-6。尽管优选的b类cpg odn通常具有硫代磷酸酯主链以及优选的a类cpg odn具有混合的或嵌合的主链，但c类组合
基序免疫刺激性核酸可以具有稳定的例如硫代磷酸酯主链、嵌合主链或磷酸二酯主链，在优选实施方案中，它们具有半软主链。
103.刺激性结构域或基序由通式：5'x1dcghx
2 3'(seq id no:12)定义。d是除c之外的核苷酸。c是胞嘧啶。g是鸟嘌呤。h是除g之外的核苷酸。
104.x1和x2是0到10个核苷酸长的任意核酸序列。x1可包括cg，在这种情况下，优选在该cg之前紧接t。在一些实施方案中，dcg是tcg。x1优选0到6个核苷酸长度。在一些实施方案中，x2不含任何多聚g或多聚a基序。在其他实施方案中，免疫刺激性核酸在5'末端或3'末端具有多聚t序列。如本文所使用的“多聚a”或“多聚t”将分别指四个或更多个连续a或t的核酸段(stretch)，例如5'aaaa 3'或5'tttt 3'。
105.如本文所使用的“多聚g末端”将指四个或更多个连续g的核酸段，例如5'gggg 3'，其出现在核酸的5'末端或3'末端。如本文所使用的“多聚g核酸”将指具有通式5'x1x2gggx3x
4 3'(seq id no:13)的核酸，其中x1、x2、x3和x4是核苷酸且优选至少x3和x4之一是g。
106.该通式下b细胞刺激性结构域的一些优选设计包括tttttcg、tcg、ttcg、tttcg、ttttcg、tcgt、ttcgt、tttcgt、tcgtcgt。
107.核酸的第二基序被称为p或n，位于紧接x1的5’或紧接x2的3’。
108.n是b细胞中和性序列，它以cgg三核苷酸开始且至少10个核苷酸长。b细胞中和性基序包括至少一个cpg序列，其中cg之前为c或者之后为g(krieg am等.(1998)proc natl acad sci usa 95:12631-12636)，或者是包含cg的dna序列，其中cg的c被甲基化。如本文所使用的“cpg”将指5'胞嘧啶(c)之后为3'鸟嘌呤(g)并通过磷酸酯键连接。至少5'cg 3'的c必须是非甲基化的。中和性基序是这样的基序，当存在另外的非刺激性基序时，它们具有一定程度的免疫刺激性能力，但是当存在于其他免疫刺激性基序环境中时，它们用来降低其他基序的免疫刺激性潜力。
109.p是富含gc的回文，其包含至少10个核苷酸长的序列。如本文所使用的“回文”和等价的“回文序列”将指反向重复，即诸如abcdee'd'c'b'a'(seq id no:14)之类的序列，其中a和a'、b和b'等是能够形成常见沃森-克里克碱基配对的碱基。
110.如本文所使用的“富含gc的回文”将指具有至少三分之二g和c的碱基组成的回文。在一些实施方案中，富含gc的结构域优选在“b细胞刺激性结构域”的3'。在10个碱基长的富含gc的回文例子中，回文就因此而包含至少8个g和c。在12个碱基长的富含gc的回文例子中，回文也包含至少8个g和c。在14聚体的富含gc的回文例子中，回文至少十个碱基是g和c。在一些实施方案中，富含gc的回文是完全由g和c组成的。
111.在一些实施方案中，富含gc的回文具有至少81％ g和c的碱基组成。在这样的10个碱基长的富含gc的回文例子中，回文就因此而全部由g和c组成。在这样的12个碱基长的富含gc的回文例子中，优选回文至少十个碱基(83％)是g和c。在一些优选实施方案中，12个碱基长的富含gc的回文完全由g和c组成。在14-聚体的富含gc的回文例子中，回文至少十二个碱基(86％)是g和c。在一些优选实施方案中，14个碱基长的富含gc的回文完全由g和c组成。富含gc的回文的c能够是非甲基化的，或者它们能够是甲基化的。
112.一般而言，该结构域具有至少3个c和g，更优选每种4个，以及最优选每种5个或更多个。该结构域中c和g的数量不必相同。优选c和g的排列能够使它们形成自身互补的双链
或回文，诸如ccgcgcgg。这可以通过a或t进行中断，但优选自身互补性是至少部分保守的，如同作为例子的基序cgacgttcgtcg(seq id no:2)或cggcgccgtgccg(seq id no:3)。当互补性不保守时，优选非互补碱基对是tg。在优选实施方案中，不是回文一部分的连续碱基不超过3个，优选不超过2个，最优选仅1个。在一些实施方案中，富含gc的回文包括至少一个cgg三聚体，至少一个ccg三聚体，或者至少一个cgcg四聚体。
113.球形核酸(sna)是一类公认的大分子，是通过将核酸放射状组织在纳米颗粒核即无机金属核周围而形成的(mirkin ca,letsinger rl,mucic rc,&storhoff jj(1996),a dna-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials.nature382(6592):607-609.)。这些结构展示了通过a类清道夫受体(sr-a)和脂筏的参与而无需辅助性递送媒介物或转染试剂就进入细胞的能力(patel pc等,(2010)scavenger receptors mediate cellular uptake of polyvalent oligonucleotide-functionalized gold nanoparticles.bioconjugate chemistry 21(12):2250-2256.)。一旦在细胞内部，传统sna的核酸组分抵抗了核酸酶降解，就会延长胞内有效期。此外，由于它们的多功能化学结构，sna具有以多价方式结合其目标的能力(choi ch,hao l,narayan sp,auyeung e,&mirkin ca(2013)mechanism for the endocytosis of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates.proceedings of the national academy of sciences of the united states of america 110(19):7625-7630；wu xa,choi ch,zhang c,hao l,&mirkin ca(2014)intracellular fate of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates.journal of the american chemical society136(21):7726-7733)。
114.本文已发现，配成is-sna的免疫刺激性寡核苷酸具有增强的癌症治疗性质。已根据本发明研发了is-sna，其在实心和/或脂质核周围掺入紧密包装的寡核苷酸壳。这些独特分子能够用于有效递送寡核苷酸和可选的其他治疗剂或诊断剂给细胞，特别是以有效方式递送给细胞，产生增强的治疗反应。包在sna中的分子将通过清道夫受体介导的内吞被摄取到细胞中，产生了高效且快速的内涵体积累。
115.本发明的纳米结构通常是由具有核的纳米颗粒和寡核苷酸壳所组成的，它是通过将cpg寡核苷酸排列成从核放射状朝向外部而形成的。疏水性(例如脂质)锚定基团优选用来将寡核苷酸嵌入脂质基纳米颗粒中，该锚定基团连接到寡核苷酸的5'末端还是3'末端将取决于要将寡核苷酸排列成5'末端还是3'末端从核面向外部。锚发挥作用驱使插入到脂质纳米颗粒中，并将寡核苷酸锚定到脂质上。
116.在一些实施方案中，寡核苷酸壳的至少25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1,000个或其任意范围组合的免疫刺激性寡核苷酸都位于核外部。在一些实施方案中，寡核苷酸壳具有1-1,000、5-1,000、100-1,000、500-1,000、10-500、50-250或50-300个寡核苷酸/is-sna的密度。
117.在一些实施方案中，寡核苷酸壳的免疫刺激性寡核苷酸是结构上相同的免疫刺激性寡核苷酸。在其他实施方案中，寡核苷酸壳的免疫刺激性寡核苷酸具有至少两种结构上不同的免疫刺激性寡核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸壳的免疫刺激性寡核苷酸具有2-50、2-40、2-30、2-20或2-10种不同的核苷酸序列。
118.在一些实施方案中，至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的
寡核苷酸位于纳米结构表面上。当脂质体核外表面至少10％的可用表面区域都包括免疫刺激性寡核苷酸时，寡核苷酸壳就形成了。在一些实施方案中，脂质体外表面至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或100％的可用表面区域都包括免疫刺激性寡核苷酸。寡核苷酸壳的免疫刺激性寡核苷酸可朝向各个方向。在一些实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸放射状朝向外部。
119.在一些实施方案中，寡核苷酸壳中至少10％的免疫刺激性寡核苷酸都通过脂质锚定基团连接到纳米颗粒上。脂质锚是由能够将寡核苷酸或核酸插入并锚定到脂质膜上的疏水基团所组成的。在一些实施方案中，寡核苷酸壳中至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的寡核苷酸都通过脂质锚定基团连接到脂质纳米颗粒上。在一些实施方案中，脂质锚定基团是胆固醇。在其他实施方案中，脂质锚定基团是固醇、棕榈酰基、二棕榈酰基、硬脂酰基、二硬脂酰基、c16烷基链、胆汁酸、胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸盐、油酰石胆酸、油酰胆烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、诸如类固醇之类的类异戊二烯、诸如维生素e之类的维生素、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、脂肪酸酯或者本领域已知的其他脂质。
120.在一些实施方案中，寡核苷酸具有寡核苷酸和脂质锚定基团之间的接头。接头的非限制性例子是四甘醇(tetraethyleneglycol)。
121.纳米结构包括核。核可以是实心或空心核，诸如脂质体核。实心核是没有空心中心的球形材料。如本文所使用的术语球形是指一般形状，并未暗示或限制到完美的球形或圆形。它可以包括不完美。
122.能够由本领域技术人员已知的各种材料来构建实心核，包括但不限于：贵金属(金、银)、过渡金属(铁、钴)和金属氧化物(二氧化硅)。此外，这些核可以是惰性的、顺磁性的或者超磁性的。能够由所述材料的纯组成或者任意数量材料混合物的结合或者材料的层状组成来构建实心核。此外，实心核能够由聚合物核所组成，诸如两亲性嵌段共聚物，诸如聚苯乙烯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚羟基乙酸、聚己内酯之类的疏水聚合物以及本领域技术人员已知的其他生物相容性聚合物。实心核优选由脂双层所包围。
123.另外，核可以是空心核，其在壳材料中心区域至少具有一些空间。空心核包括脂质体核。如本文所使用的脂质体核是指位于中心的核隔室，是由形成脂双层的脂质或磷脂组分所形成的。“脂质体”是各种大小和结构的自我封闭的人工囊泡结构，其中一种或几种膜包封水性核。最典型的脂质体膜是由脂双层膜所形成的，其中亲水头部基团朝向水性环境而脂质链被包埋在亲脂性核中。脂质体也能由其他两亲性单体和聚合物分子所形成，诸如嵌段共聚物这样的聚合物或多肽。单层囊泡是由封闭水性空间的单层膜所限定的脂质体。相比之下，寡层(oligolamellar)或多层(multilamellar)囊泡是由几层膜所构建的。通常，膜为大约4nm厚且由诸如磷脂之类的天然或合成来源的两亲性脂质所组成。可选地，能够通过掺入诸如固醇或胆酸衍生物之类的其他脂质来修饰膜性质。
124.脂双层是由两层脂质分子所组成的。层里的每个脂质分子都是基本上平行朝向相邻脂双层的，形成脂双层的两层都具有它们分子暴露于水相的极性末端和互相邻近的非极性末端。脂质体核的中心水性区域可以是空的或者完全或部分充满水、水乳、寡核苷酸或者诸如抗微生物剂之类的其他治疗剂或诊断剂。
[0125]“脂质”是指其作为通用术语的常规含义，包括脂肪、脂质、原生质的醇-醚可溶性
成分，它们不溶于水。脂质通常由亲水性部分和疏水性部分组成。在水中，脂质能够自我组织形成双层膜，其中亲水性部分(头部基团)朝向水相而亲脂性部分(酰基链)被包埋在双层核中。脂质也能包含两个亲水性部分(双亲水基两亲化合物(bola amphiphile))。在那种情况下，膜可以由单层脂质层而不是双层来形成。在本上下文中，脂质的典型例子是脂肪、脂肪油、香精油、蜡、类固醇、固醇、磷脂、糖脂、硫脂、氨基脂、脂色素(chromolipid)和脂肪酸。该术语包括天然存在和合成的脂质两者。与本发明相关的优选脂质是：类固醇和固醇特别是胆固醇，包括磷脂酰、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂在内的磷脂。如果有脂肪酸的话，它们可能是大约12-24个碳链长度，包含多达6个双键。脂肪酸连接到可源自甘油的主链上。一个脂质中的脂肪酸能够是不同的(非对称的)，或者可以仅有1种脂肪酸链存在，例如溶血卵磷脂。混合配方也是可能的，特别是当非阳离子脂质源自天然来源时，诸如从蛋黄、牛心、脑、肝或大豆纯化的卵磷脂(磷脂酰胆碱)。
[0126]
能够从本领域技术人员已知的一种或多种脂质来构建脂质体核，其包括但不限于：诸如鞘氨醇、鞘氨醇磷酸酯、甲基鞘氨醇和二氢鞘氨醇、神经酰胺、神经酰胺磷酸酯、1-0酰基神经酰胺、二氢神经酰胺、2-羟基神经酰胺、鞘磷脂、糖基化鞘脂、硫苷脂、神经节苷脂、鞘磷脂及各种长度和饱和状态的植物鞘氨醇以及它们的衍生物的鞘脂，诸如磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酸、溶血磷脂酸、环状lpa、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、肌醇磷酸酯、lpi、心磷脂、溶血心磷脂、双(单酰甘油)磷酸酯、(二酰甘油)磷酸酯、醚脂、二植烷醚脂及各种长度、饱和状态的缩醛磷脂以及它们的衍生物的磷脂，诸如胆固醇、脱氢胆固醇、豆甾醇、羊毛甾醇、烯胆烷醇、薯蓣皂苷元、谷甾醇、酵母甾醇、zymostenol、14-脱甲基羊毛甾醇、胆固醇硫酸酯、dhea、dhea硫酸盐、14-脱甲基-14-脱氢羊毛甾醇、谷甾烷醇、菜油甾醇、醚阴离子脂质、醚阳离子脂质、镧系螯合脂质、a-环取代氧化固醇、b-环取代氧化固醇、d-环取代氧化固醇、侧链取代氧化固醇、双取代氧化固醇、胆甾烷酸衍生物、氟化固醇、荧光甾醇、磺化固醇、磷酸化固醇及不同长度、饱和状态的多不饱和固醇及其衍生物的固醇。
[0127]
寡核苷酸位于核外部。位于核上的寡核苷酸通常被称为连接(couple)到核。连接可以是直接的或间接的。可将寡核苷酸可逆或不可逆地连接到核。可逆连接的化合物是使用敏感连接(susceptible linkage)来互相结合的。敏感连接是在生理条件下易于分开的连接。例如沃森克里克碱基配对就是敏感连接。可切割的接头也是敏感连接。
[0128]
因此，在本发明的一些方面，is-sna适于用作治疗患癌受试者的独立治疗、联合治疗或者疫苗。能够将is-sna与或者不与用于癌症治疗的检查点抑制剂或抗原或其他治疗剂一起给药。
[0129]
患癌受试者是具有可检测到的癌细胞的受试者。癌症可是恶性或非恶性癌症。癌症或肿瘤包括但不限于胆道癌；脑癌；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食管癌；胃癌；上皮内肿瘤；淋巴瘤；肝癌；肺癌(例如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)；黑色素瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；睾丸癌；甲状腺癌；和肾癌，以及其他癌(carcinoma)和肉瘤。在一个实施方案中，癌症是毛细胞白血病、慢性髓细胞白血病、皮肤t细胞白血病、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌、肾细胞癌、前列腺癌、膀胱细胞癌或结肠癌。
[0130]
受试者意指人或脊椎动物，包括但不限于狗、猫、马、奶牛、猪、绵羊、山羊、火鸡、
鸡、诸如猴子之类的灵长类动物以及诸如鲑鱼之类的鱼(水产养殖类)。因此，也能将本发明用于治疗非人类受试者的癌症和肿瘤。癌症是伴侣动物(即猫和狗)死亡的主要原因之一。
[0131]
如本文所使用的术语治疗(treat、treated或treating)，当涉及到诸如癌症之类病症而使用时，是指增加受试者对疾病发展的抵抗力或者换句话说就是降低受试者发展成疾病的可能性的预防性治疗，以及在患者已发展成疾病后为了对抗疾病(例如减少或消除癌症)或防止病情加重的治疗。
[0132]
可以修饰is-sna以包括癌抗原。或者，可将癌抗原与is-sna一起给药。术语抗原广泛包括被宿主免疫系统识别为外来物的任何类型的分子。如本文所使用的癌抗原是与肿瘤或癌细胞表面结合的化合物，诸如肽或蛋白质，当在mhc分子存在下于抗原提呈细胞表面上表达时，它能够激发免疫应答。能够通过以下方式从癌细胞制备癌抗原：例如cohen等,1994,cancer research,54:1055所描述的通过制备癌细胞的粗提物，通过部分纯化抗原，通过重组技术，或者通过从头合成已知抗原。癌抗原包括但不限于重组表达的抗原、整个肿瘤或癌症的免疫原性部分或者整个肿瘤或癌症。能够分离或通过重组或通过本领域已知的任何其他方式制备这样的抗原。
[0133]
也可将is-sna与抗癌治疗负载到一起(co-loaded)或者与抗癌治疗一起给药。抗癌治疗包括癌症药物、辐射和手术。如本文所使用的，“癌症药物”是指为了治疗癌症的目的而给予受试者的试剂。如本文所使用的，“治疗癌症”包括预防癌症发展、减少癌症症状和/或抑制已确定癌症的生长。在其他方面，将癌症药物给予有癌症发展风险的受试者以降低发展成癌症的风险。本文描述了用于治疗癌症的各种类型的药物。为了本说明书的目的，将癌症药物分为化疗剂、免疫治疗剂、检查点抑制剂、癌症疫苗、激素治疗和生物反应调节剂。
[0134]
此外，本发明的方法打算包括将多于一种的癌症药物与is-sna一起使用。作为例子，合适的话，可将is-sna与化疗剂、检查点抑制剂和免疫治疗剂两者一起给药。或者，癌症药物可包括免疫治疗剂和癌症疫苗，或者化疗剂和癌症疫苗，或者化疗剂、免疫治疗剂和癌症疫苗全部给予一个受试者以治疗患癌受试者或者有发展成癌症风险的受试者。
[0135]
化疗剂可选自甲氨蝶呤、长春新碱、阿霉素(adriamycin)、顺铂、不含糖的氯乙基亚硝基脲、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素c、博莱霉素、阿霉素(doxorubicin)、氮烯咪胺(dacarbazine)、紫杉醇、fragyline、meglamine gla、戊柔比星(valrubicin)、卡莫司汀(carmustaine)和poliferposan、mmi270、bay 12-9566、ras法尼基转移酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、mmp、mta/ly231514、ly264618/洛美曲索(lometexol)、glamolec、ci-994、tnp-470、hycamtin/拓扑替康(topotecan)、pkc412、valspodar/psc833、novantrone/mitroxantrone、metaret/苏拉明(suramin)、巴马司他(batimastat)、e7070、bch-4556、cs-682、9-ac、ag3340、ag3433、incel/vx-710、vx-853、zd0101、isi641、odn 698、ta 2516/marmistat、bb2516/marmistat、cdp 845、d2163、pd183805、dx8951f、lemonal dp 2202、fk 317、picibanil/ok-432、ad 32/戊柔比星、metastron/锶衍生物、temodal/替莫唑胺(temozolomide)、evacet/阿霉素脂质体、yewtaxan/紫杉醇(paclitaxel)、taxol/紫杉醇、xeload/卡培他滨(capecitabine)、furtulon/去氧氟尿苷、cyclopax/口服紫杉醇、口服紫杉类、spu-077/顺铂、hmr 1275/flavopiridol、cp-358(774)/egfr、cp-609(754)/ras癌基因抑制物、bms-182751/口服铂、uft(替加氟(tegafur)/尿嘧啶)、ergamisol/左旋咪唑(levamisole)、eniluracil/776c85/5fu增效剂、campto/左旋咪唑、camptosar/伊利替康、
tumodex/ralitrexed、leustatin/克拉屈滨(cladribine)、paxex/紫杉醇、doxil/阿霉素脂质体、caelyx/阿霉素脂质体、fludara/氟达拉滨(fludarabine)、pharmarubicin/表柔比星(epirubicin)、depocyt、zd1839、lu 79553/双萘酰亚胺、lu 103793/dolastain、caetyx/阿霉素脂质体、gemzar/吉西他滨、zd 0473/anormed、ym 116、碘种子、cdk4和cdk2抑制剂、parp抑制剂、d4809/dexifosamide、ifes/mesnex/异环磷酰胺、vumon/替尼泊苷、paraplatin/卡铂、plantinol/顺铂、vepeside/依托泊甙(etoposide)、zd 9331、taxotere/多西他赛(docetaxel)、阿糖鸟嘌呤的前药、taxane类似物、亚硝基脲、烷化剂诸如马法兰(melphelan)和环磷酰胺、安鲁米特(aminoglutethimide)、门冬酰胺酶、白消安、卡铂、苯丁酸氮芥(chlorombucil)、盐酸阿糖胞苷、放线菌素d、盐酸柔红霉素、雌莫司汀磷酸钠(estramustine phosphate sodium)、依托泊甙(vp16-213)、氟尿苷(floxuridine)、氟尿嘧啶(5-fu)、氟他胺(flutamide)、羟基尿素(羟基脲)、异环磷酰胺(ifosfamide)、干扰素alfa-2a、alfa-2b、醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)(lhrh释放因子类似物)、洛莫司汀(lomustine)(ccnu)、盐酸氮芥(mechlorethamine hcl)(氮芥)、巯基嘌呤、美司钠(mesna)、密妥坦(mitotane)(o.p
′‑
ddd)、盐酸米托蒽醌(mitoxantrone hcl)、奥曲肽、普卡霉素(plicamycin)、盐酸丙卡巴肼(procarbazine hcl)、链佐星(streptozocin)、枸橼酸他莫昔芬(tamoxifen citrate)、硫鸟嘌呤、塞替哌(thiotepa)、硫酸长春碱、安吖啶(amsacrine)(m-amsa)、阿扎胞苷(azacitidine)、红细胞生成素、六甲蜜胺(hexamethylmelamine)(hmm)、白介素2、米托胍腙(mitoguazone)、喷司他丁(pentostatin)(2'-脱氧柯福霉素)、司莫司汀(semustine)(甲基ccnu)、替尼泊苷(teniposide)(vm-26)、硫酸长春地辛，但并不限于此。
[0136]
免疫治疗剂可选自ributaxin、herceptin、quadramet、panorex、idec-y2b8、bec2、c225、oncolym、smart m195、atragen、ovarex、bexxar、ldp-03、ior t6、mdx-210、mdx-11、mdx-22、ov103、3622w94、抗vegf、zenapax、mdx-220、mdx-447、melimmune-2、melimmune-1、ceacide、pretarget、novomab-g2、tnt、gliomab-h、gni-250、emd-72000、lymphocide、cma 676、monopharm-c、4b5、ior egf.r3、ior c5、babs、抗flk-2、mdx-260、ana ab、smart 1d10 ab、smart abl 364ab和immurait-cea，但并不限于此。
[0137]
癌症疫苗可选自egf、抗独特型癌症疫苗，gp75抗原、gmk黑色素瘤疫苗、mgv神经节苷脂缀合疫苗、her2/neu、ovarex、m-vax、o-vax、l-vax、stn-khltheratope、blp25(muc-1)、脂质体独特型疫苗、melacine、肽抗原疫苗、毒素/抗原疫苗、基于mva的疫苗、pacis、bcg疫苗、ta-hpv、ta-cin、disc-病毒和immucyst/theracys，但并不限于此。
[0138]
将is-sna与诸如单克隆抗体之类的免疫治疗剂一起使用，就能够通过许多机制增加长期存活时间，包括adcc的显著增强、自然杀伤(nk)细胞的活化以及ifnα水平的增加。当与单克隆抗体联合使用时，is-sna的作用是降低所需的抗体剂量来获得生物结果。
[0139]
本发明的制剂是以药学可接受的溶液给药的，其可以常规含有药学可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体、佐剂和可选的其他治疗组分。
[0140]
对于治疗用途来说，能够通过将is-sna递送到所希望表面上的任何模式将有效量的is-sna给予受试者，例如经粘膜或全身给药。可以通过本领域技术人员已知的任何方式来实现本发明药物组合物的给药。优选的给药途径包括但不限于口服、肠胃外、肌内、鼻内、舌下、气管内、吸入、经眼、经阴道和经直肠。在一些实施方案中，优选途径包括静脉内注射、
瘤内注射和经皮下。
[0141]
药物组合物也可包含合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。这样的载体或赋形剂的例子包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶以及诸如聚乙二醇之类的聚合物。
[0142]
is-sna和可选的其他治疗剂和/或抗原可以本身(未搀(neat))给药或者以药学可接受盐的形式给药。当用于医学时，盐应当是药学可接受的，但非药学可接受的盐也可以方便地用来制备其药学可接受的盐。这样的盐包括但不限于由以下酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。此外，这样的盐能够被制成碱金属或碱土金属盐，诸如羧酸基团的钠盐、钾盐或钙盐。
[0143]
合适的缓冲剂包括：乙酸及盐(1-2％w/v)；柠檬酸及盐(1-3％w/v)；硼酸及盐(0.5-2.5％w/v)；磷酸及盐(0.8-2％w/v)。合适的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003-0.03％w/v)；氯丁醇(0.3-0.9％w/v)；对羟基苯甲酸酯类(0.01-0.25％w/v)以及硫柳汞(0.004-0.02％w/v)。
[0144]
本发明的药物组合物包含可选包括在药学可接受的载体中的有效量的is-sna和可选的抗原和/或其他治疗剂。术语药学可接受的载体意指适于给药到人或其他脊椎动物的一种或多种相容性固体或液体填料、稀释剂或包封物质。术语载体是指天然或合成的有机或无机组分，活性成分与其结合以促进应用。药物组合物的组分也能以基本上不存在削弱所期望的药学功效的相互作用这种方式与本发明的化合物混合以及互相混合。
[0145]
本发明并不限于其在以下描述中所阐述的或在附图中所显示的组件结构和排列细节中的应用。本发明能够是其他实施方案并以各种方式实施或执行。此外，如本文所使用的措辞和术语都是为了说明目的，不应视为限制性的。“包括”、“包含”(“including,”“comprising,”)或者“具有”、“含有”、“包括”(“having,”“containing,”“involving,”)及其在本文中变体的使用，都是为了包括其后所列举的项目及其等价物以及额外项目。
[0146]
使用不超过常规的实验，本领域技术人员就将认识到或者能够确认本文所描述的发明具体实施方案的许多等效方案。打算通过以下权利要求来包括这些等效方案。
[0147]
本文所披露的包括专利文献在内的所有参考文献都通过引用以其整体并入。
实施例
[0148]
实施例1.作为单独治疗和与抗pd-1抗体联合的靶向tlr9的球形核酸在同系肿瘤模型中显示了强抗肿瘤活性
[0149]
结果
[0150]
实验1：皮下和瘤内给药is-sna(ct26肿瘤)
[0151]
将is-sna瘤内给予带有ct26肿瘤(大小约100mm3)的balb/c荷瘤小鼠。在第10、13、16、19和22天以3.2或6.4mg/kg剂量给药is-sna(图1)。每周测定两次肿瘤体积，直到肿瘤大小达到2000mm3。结果表明瘤内和皮下递送is-sna两者都表现出了剂量依赖方式的强效抗肿瘤效应。结果还表明小鼠的存活随is-sna剂量的增加而增加。
[0152]
is-sna的皮下递送(图2)或瘤内递送(图3)显示了类似水平的抗肿瘤效应。
[0153]
实验2：瘤内给药is-sna(mc38肿瘤)
[0154]
将is-sna瘤内给予带有约100mm3的mc38肿瘤的c57bl/6荷瘤小鼠。在第9、12、15、18和21天以0.8、3.2或6.4mg/kg剂量给药is-sna(图4)。每周测定两次肿瘤体积，直到肿瘤大小达到2000mm3。结果表明is-sna表现出了剂量依赖方式的强力抗肿瘤效应。6.4mg/kg剂量的is-sna能够使mc38肿瘤生长完全消退(图5)。结果还表明小鼠的存活以剂量依赖方式增加(图6)。
[0155]
实验3：与pd-1联合静脉内给药is-sna(emt-6肿瘤)
[0156]
监测了is-sna作为单独治疗和与检查点抑制剂抗pd-1联合治疗在带有约100mm3大小emt-6乳腺癌肿瘤的balb/c荷瘤小鼠中的抗肿瘤效应。在第10、13、16、19和21天以0.8mg/kg静脉内(iv)给药is-sna，在第3、6、10、13、17、20、23和27天以10mg/kg腹膜内给予抗pd-1(图7)。每周测定两次肿瘤体积，直到肿瘤大小达到2000mm3。结果表明单独静脉内给药is-sna和与检查点抑制剂联合给药两者都能施加强效抗肿瘤反应(图8)。此外，is-sna和抗pd-1联合组比is-sna单独组具有增加的动物存活，表明了联合治疗在抗pd-1无效的emt-6乳腺癌模型中的协同效应(图9)。
[0157]
实验4：与pd-1联合皮下给药is-sna(emt-6肿瘤)
[0158]
监测了is-sna作为单独治疗和与检查点抑制剂抗pd-1联合治疗在带有约4mm3大小emt-6乳腺癌肿瘤的balb/c荷瘤小鼠中的抗肿瘤效应。在第3、6、9、12和15天以0.8mg/kg在肿瘤细胞接种部位周围经皮下(瘤周)给药is-sna，在第3、8和13天以10mg/kg腹膜内给予抗pd-1(图10)。每周测定两次肿瘤体积，直到肿瘤大小达到2000mm3。在第10天测定5只动物引流淋巴结中的t
效应
/t
调节
(t
eff
/t
reg
)的比值以探索机理性理解。结果表明单独皮下给药is-sna和与检查点阻断剂联合给药两者都能施加强效抗肿瘤反应。is-sna和抗pd-1联合使动物中的肿瘤生长完全消退了(图11)。机理性表征结果显示is-sna+抗pd-1的t
eff
/t
reg
平均值高于单独的is-sna，表明联合组的更高抗肿瘤效应是通过预期的机制(图12)。
[0159]
实验5：与pd-1联合皮下给药is-sna(b16f10肿瘤)
[0160]
监测了is-sna作为单独治疗和与检查点抑制剂抗pd-1联合治疗在带有约4mm3大小b16f10黑色素瘤肿瘤的c57bl/6荷瘤小鼠中的抗肿瘤效应。在第3、6、9、12和15天以0.8mg/kg在肿瘤细胞接种部位周围经皮下给药is-sna，在第3、7、11和15天以10mg/kg腹膜内给予抗pd-1(图13)。每周测定两次肿瘤体积，直到肿瘤大小达到2000mm3。结果表明单独皮下给药is-sna和与检查点阻断剂联合给药两者都能施加强效抗肿瘤反应。is-sna和抗pd-1联合使动物中的肿瘤生长完全消退了(图14)。
[0161]
材料和方法
[0162]
寡核苷酸合成。使用自动化固相载体亚磷酰胺合成法来合成寡核苷酸。is-sna序列是5-[0163]
t*c*c*a*t*g*a*c*g*t*t*c*c*t*g*a*c*g*t*t-(sp18)-(sp 18)-胆固醇(seq id no:1)，*＝'ps'取代且sp18＝六乙二醇间隔物18分子。
[0164]
脂质体合成。脂质体的合成是通过使用直径47mm、孔径50nm的聚碳酸酯膜(sterlitech)，将在磷酸盐缓冲盐水溶液(pbs)(137mm nacl，10mm磷酸盐，2.7mm kcl，ph 7.4，hyclone)中水化的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)挤出。使用malvern zetasizer nano(malvern instruments)，用动态光散射法测定脂质体直径。用磷脂酰胆碱定量试剂盒(sigma)测定dopc浓度。
[0165]
sna合成(is-sna)。为制备sna，通过将寡核苷酸与脂质体以100:1的比例混合接着通过在室温孵育4h，将缀合胆固醇的寡核苷酸连接到脂质体表面上。然后使用带有300-kda透析膜的krosflo渗滤系统(spectrum labs)经tff浓缩脂质体。使用dopc浓度、脂质体直径和磷脂酰胆碱头部基团面积(0.71nm2)来计算脂质体浓度。通过将脂质体溶解在100％甲醇中用uv分光光度计确定寡核苷酸浓度。确定了该平均负载量为100个寡核苷酸/脂质体。
[0166]
小鼠肿瘤模型。对于ct26模型(实验1)，用1
×
106个ct26肿瘤细胞在胁腹中经皮下接种7到8周龄雌性balb/c小鼠(charles river)。
[0167]
对于mc38模型(实验2)，用1
×
106个mc38肿瘤细胞在胁腹中经皮下接种7到8周龄雌性c57bl/6小鼠(charles river)。
[0168]
对于emt-6模型(实验3和4)，用1
×
106个emt-6肿瘤细胞在胁腹中经皮下接种7到8周龄balb/c小鼠(charles river)。
[0169]
对于b16f10模型(实验5)，用0.2
×
106个b16f10肿瘤细胞在胁腹中经皮下接种7到8周龄雌性c57bl/6小鼠(charles river)。
[0170]
使用卡钳以二维方式每周测定两次肿瘤大小，使用以下公式表示体积，单位为mm3：
[0171]
肿瘤体积＝(宽2×
长)/2
[0172]
在相应实验的示意图中显示了is-sna和抗pd-1(克隆：rmp1-14，目录号：be0146，同种型：rat 2a3，bioxcell)的给药计划。在预防模型中，在肿瘤细胞接种后第3天开始给药is-sna，而在已确定肿瘤的模型中，当各组的平均肿瘤体积达到100mm3肿瘤大小时开始is-sna给药。在某些实验中，收获肿瘤和肿瘤-引流淋巴结来测量免疫浸润细胞。通过使用graphpad prism 6.05用sidak的anova(双向anova)post-hoc多重比较来进行各组之间的统计学比较。当p《0.05就认为各组之间的差异是显著的。
[0173]
facs分析。通过facs分析表征来自每个所收集样品的免疫浸润细胞。简而言之，通过机械分离处理所收集的样品并在100μl染色缓冲液(pbs,0.2％ bsa,0.02％ nan3)中制备。然后根据厂商对每种抗体所描述的程序添加直接针对所选标志物的抗体。
[0174]
抗体和它们用于facs分析小鼠样品上免疫细胞群特征的相应同种型列在下面的表中。在暗处于室温下孵育混合物20到30分钟，洗涤并重悬浮在200μl染色缓冲液中。还用对照同种型抗体处理样品。
[0175]
在孵育期结束时，如果必要的话就用透化缓冲液洗涤细胞，离心并用参考微珠溶液(pkh26，ref p7458，sigma，在染色缓冲液中1/2稀释)重悬浮。所有样品在冰上避光保存直到facs分析。用配备有波长405、488和633nm的3种激发激光的space流式细胞仪(lsr ii,bd biosciences)分析染色细胞。直到记录每个样品10,000个mcd45+事件或者2分钟最长持续时间才获取facs数据。获取期间保存所有事件。
[0176]
表1.用于髓源性抑制细胞分析的抗体
[0177]
[0178][0179]
表2.用于t细胞分析的抗体
[0180]
[0181][0182]
参考文献
[0183]
1.a.m.krieg,s.m.efler,m.wittpoth,m.j.al adhami,and h.l.davis,'induction of systemic th1-like innate immunity in normal volunteers following subcutaneous but not intravenous administration of cpg 7909,a synthetic b-class cpg oligodeoxynucleotide tlr9 agonist',j immunother,27(2004),460-71.
[0184]
2.t.okazaki,and t.honjo,'the pd-1-pd-l pathway in immunological tolerance',trends immunol,27(2006),195-201.
[0185]
3.l.pusztai,a.ladanyi,b.szekely,and m.dank,'[immunotherapy opportunities in breast cancer]',magy onkol,60(2016),34-40.
[0186]
实施例2.靶向tlr9的球形核酸在猴子中诱导免疫应答以及在小鼠中与抗pd-1抗体的抗肿瘤免疫性
[0187]
摘要
[0188]
已经在临床上评价了tlr9激动剂的抗肿瘤活性，但没有成功。球形核酸(sna)是基于寡核苷酸在纳米颗粒核上紧密球形排列的新型试剂，克服了线性治疗性寡核苷酸的局限。与线性寡核苷酸相比，tlr9激动剂sna增加了体外细胞摄取和tlr9活化。在体内，在小鼠和猴子中，sna都诱导了比线性寡核苷酸更高的th1型细胞因子。在鼠肿瘤模型中，sna抑制了肿瘤生长并延长了小鼠的存活。与任一试剂单独相比，sna和抗pd-1的组合都增强了抗肿瘤效应。sna治疗的小鼠肿瘤组织和引流淋巴结显示了细胞毒t细胞增加以及treg和单核细胞mdsc减少。肿瘤再攻击证实了肿瘤特异性免疫记忆。这些研究支持tlr9激动剂sna作为单独治疗和与检查点抑制剂联合治疗的有前景的癌症免疫治疗。
[0189]
简介
[0190]
通过固有免疫系统对病原体和危险信号的识别依赖于模式识别受体(prr)。toll样受体(tlr)是prr类别之一。在人类中已鉴别到十一种tlr(tlr1-11)。tlr9表达于人b细胞和浆细胞样树突状细胞(pdc)的内涵体隔室中。tlr9识别包含非甲基化cpg二核苷酸的细菌和合成寡核苷酸(oligonucleotide)(寡核苷酸(oligo))，该二核苷酸存在于特定序列上下文中，被称为cpg基序(1-5)。经由cpg寡核苷酸的tlr9刺激引起th1型固有和适应性免疫应答(6,7)。根据序列特征和它们所产生的具体免疫刺激谱(profile)，将tlr9激动剂分类成a、b和c类(8)。已经在用于癌症和感染性疾病的前临床(8-10)和临床研究(11)中广泛评价了所有三种类型的tlr9激动剂。
[0191]
tlr9激动剂刺激固有和适应性免疫应答两者的潜力已引起了肿瘤学界的关注，已
经使用tlr9激动剂在癌症患者中进行了超过三打的临床试验。属于b类tlr9激动剂的cpg 7909(也称为odn 2006，f-3512676和promune)是最广泛研究过的(12)。迄今为止所评价过的tlr9激动剂，包括cpg 7909在内，既未作为单独治疗产生足够的抗肿瘤应答，也未在与其他经批准的抗癌试剂联合时改善疗效(12,13)，这是由于它们的细胞摄取很差。
[0192]
sna是核酸的三维排列，紧密包装的寡核苷酸放射状排列在中心的纳米颗粒核上(14,15)。sna平台是高度可适应的，并且能够与各种核酸类型一起使用，包括免疫刺激性和免疫调节性寡核苷酸、反义寡核苷酸、sirna和mirna(16)。此外，sna还能被设计为在纳米颗粒上包括肽、蛋白质或靶向抗体与寡核苷酸一起(17-19)。中心纳米颗粒核充当结构元件来形成sna，它能够由各种材料组成，包括金、二氧化硅或脂双层(16)。不同于其他通常使用的寡核苷酸递送系统例如阳离子脂质、聚合物或脂质体包封，sna上的寡核苷酸是向外暴露的并随时可以与它们的靶相互作用，包括诸如tlr9之类的跨膜受体。已显示sna经由清道夫受体被细胞摄取并递送到表达tlr9的内涵体中(20-22)。
[0193]
利用sna的性质，将tlr9激动剂寡核苷酸(表3)配制成围绕中性dopc脂质核的sna，体外和体内评估了它们在小鼠和非人灵长类动物(nhp)中的免疫刺激谱，以及鼠肿瘤模型中的抗肿瘤效应。tlr9激动剂sna作为单独治疗和与抗pd-1检查点抑制剂(cpi)联合治疗两者，在基于细胞的测定中都显示了特异性tlr9活化，体外和体内诱导th1型细胞因子，并促进鼠肿瘤模型中的抗肿瘤免疫性。通过在sna治疗过小鼠的肿瘤微环境(tme)和引流淋巴结(dln)中增加细胞毒t细胞并减少调节t细胞和单核细胞髓源性抑制细胞(mmdsc)，sna促进了抗肿瘤免疫性。
[0194]
表3.sna和线性寡核苷酸的寡核苷酸序列。从上到下，化合物对应于seq id no:4、5、6、7和8。
[0195]
化合物名称寡核苷酸序列(5
’→3’
)*选择性sna1tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-(sp18)
2-teg-胆固醇人线性寡核苷酸2tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt人sna3tccatgacgttcctgacgtt-(sp18)
2-teg-胆固醇小鼠线性寡核苷酸4tccatgacgttcctgacgtt小鼠对照sna5tgctgcttttgtgcttttgtgctt-(sp18)
2-teg-胆固醇n/a
[0196]
*所有序列都包含硫代磷酸酯主链；sp18代表间隔物-18或六乙二醇接头；teg代表四甘醇接头；下划线表示cpg。对于摄取研究，使用了荧光素标记的sna1和线性寡核苷酸2，这是通过在3'-末端胸苷上带有荧光素标记而合成的。
[0197]
结果
[0198]
与线性寡核苷酸相比，sna增加了细胞摄取
[0199]
通过将人外周血单核细胞(hpbmc)与荧光标记的sna1或线性寡核苷酸2一起孵育，研究了sna和非sna形式的线性寡核苷酸的细胞摄取。如流式细胞术所测定的，在用荧光标记的sna1处理之后，比起线性寡核苷酸2，pbmc的更大部分是荧光素阳性的(图15a)。此外，sna处理过的细胞的平均荧光密度更强，这表明当以sna形式递送时，比起线性寡核苷酸，每个细胞摄取了更多数量的寡核苷酸(图16)。
[0200]
与线性寡核苷酸相比，sna导致更强的tlr9活化
[0201]
在稳定转染人tlr9的hek293细胞中，评价了sna1和线性寡核苷酸2的tlr9活化。在
孵育四小时之后，在1.25μm浓度时，sna1的tlr9活化是线性寡核苷酸2的约2倍(图15b)。对sna1和线性寡核苷酸2测到的ec
50
分别是0.88和2.59μm。与线性寡核苷酸2相比sna1的更高的tlr9活化是与前一实验中所观察到的sna细胞摄取增加相一致的。
[0202]
tlr9激动剂sna的特异性
[0203]
为证实sna刺激是tlr9特异性的，使用未转染tlr(空)或者稳定转染了识别基于rna核酸的人tlr3、tlr7或tlr8或者稳定转染了tlr9的hek293报告细胞。只有表达tlr9的hek细胞被sna1刺激(图15c)。其中的cpg寡核苷酸被gpc二核苷酸取代了的对照sna5未活化tlr9，这表明sna中的cpg寡核苷酸是tlr9有效相互作用和刺激所必需的。表达tlr3、tlr7或tlr8的hek细胞由它们相应的配体所活化，但是sna1没有(图15c)，这表明sna1不刺激这些具体tlr。带有sna1的tlr空细胞孵育未显示任何活化，进一步证实了sna1刺激是tlr9特异性的。
[0204]
tlr9激动剂sna在小鼠和人原代细胞培养物中的细胞因子诱导
[0205]
在确定sna激动剂在细胞系中的更高细胞摄取和tlr9特异性活化之后，然后研究了tlr9激动剂在小鼠脾细胞中诱导的细胞因子谱。当用sna3或线性寡核苷酸4过夜孵育原代小鼠脾细胞时，观察到了th1型细胞因子水平的增加，两种化合物的细胞培养上清中都有il-2、il-6、il-12、ifn-γ、tnf-α和il-10(图17a)。没有观察到或者观察到了极少的th2型细胞因子，诸如il-3、il-4、il-5或il-17(图18a)。一般而言，sna3比线性寡核苷酸4在小鼠脾细胞中诱导了除il-10之外的更高水平的th1型细胞因子(图17a)。
[0206]
类似地，用人特异性sna1和线性寡核苷酸2在多个健康人志愿者pbmc培养物中进行了实验。一般而言，sna1比线性寡核苷酸2在原代hpbmc中诱导了更高水平的th1型细胞因子il-6、il-12、ifn-γ、tnf-α、ip-10和il-10(图17b)。对照sna5显示了类似于pbs对照的背景水平的细胞因子诱导(图17b)。另外，在人pbmc中的细胞因子诱导取决于所使用的sna1浓度(图18b)。
[0207]
sna在小鼠中的体内细胞因子诱导
[0208]
接下来，评估了皮下给予c57bl/6小鼠sna3和线性寡核苷酸4之后的全身性细胞因子诱导的水平、动力学和类型。sna3和线性寡核苷酸4两者都在小鼠中诱导了全身性th1型细胞因子应答。如之前已报道的，对线性寡核苷酸tlr9激动剂的高峰血清细胞因子应答发生在给药后2到6小时(23-25)。然而，sna3的高峰细胞因子应答发生在给药后的8到12个小时(图17c)。用人tlr9选择性sna1在小鼠中观察到了细胞因子诱导的类似时间过程(图19a)。sna3诱导了th1型细胞因子il-6、il-12和ifn-γ以及趋化因子mip-1α、mcp-1和rantes，且诱导是依赖于所给药的sna3剂量(图17d)。sna1也在小鼠中显示了剂量依赖性细胞因子诱导，尽管比预期的程度更低(图19b)。其中的cpg二核苷酸被gpc二核苷酸取代的对照sna5未刺激细胞因子应答(图19b)，这表明cpg二核苷酸的存在是tlr9介导的细胞因子诱导所必需的。
[0209]
tlr9激动剂sna在非人灵长类动物中的体内免疫应答谱
[0210]
由于tlr9表达在啮齿动物和灵长类动物中是不同的(26-29)，评价了sna1在nhp中的体内免疫应答谱。在食蟹猴中皮下给药sna1，在sna给药之后24小时时诱导了剂量依赖性b细胞和pdc活化两者的增加以及pdc成熟(图20a)。sna1还在同一时间点显示了nk细胞、t细胞和mdc的活化(图20a)。sna1给药产生了剂量依赖性血清细胞因子诱导(图20b)。然而，取
决于细胞因子类型以及所给予的sna剂量，高峰浓度在8到16个小时变化(图20c)。在nhp中，观察到了与体外小鼠和人原代细胞培养物以及体内小鼠研究中相同的th1型细胞因子谱。此外，在所研究的所有剂量水平都观察到了循环血细胞群水平的短暂变化。在sna给药之后72-96小时之内，循环血细胞群回到了给药前水平(图21)，与其他tlr9激动剂在灵长类动物中已报道的相同(30,31)。
[0211]
tlr9激动剂sna的肿瘤免疫治疗
[0212]
看到sna1和sna3在nhp和啮齿动物中的体内强力持续性th1型细胞因子诱导后，评估了sna3在鼠肿瘤模型中的疗效。用0.2、0.8和1.6mg/kg的sna3瘤内注射mc38结直肠肿瘤荷瘤小鼠，每周两次一共五次，当平均肿瘤体积(mean tumor volume，mtv)达到约100mm3时开始注射。在所有三个剂量水平时都有统计学上显著的剂量依赖性肿瘤生长抑制(tgi)(图22a)。在最高剂量时，观察到了88％ tgi。与媒介物组小鼠相比，伴随tgi同时观察到了sna3治疗组中小鼠存活的增加。与媒介物组的23天相比，最低剂量组的中位存活为约40天，更高两个剂量组大于50天。这些结果证实，tlr9激动剂sna显示了强力tgi并延长小鼠的存活。为评估sna瘤内给药之后的固有免疫细胞因子诱导，在单独研究中测定了第一次给药之后4小时在荷瘤小鼠中对sna3的血清细胞因子应答。在荷瘤小鼠血清中观察到了剂量依赖性th1型细胞因子诱导(图23)。
[0213]
tlr9激动剂sna联合抗pd-1的肿瘤免疫治疗
[0214]
近年来由于cpi的使用而使肿瘤治疗受益匪浅(32)，cpi通过降低免疫应答抑制起作用，从而使得抗肿瘤免疫应答能够扩展。不幸的是，cpi仅仅在10-30％的患者中有效(33,34)，所以存在对增强cpi疗效的联合治疗的强烈需求。促进免疫应答的免疫刺激性tlr9激动剂sna和支持免疫应答扩展的cpi的组合是协同这两种治疗方法的机制的合理方法。在mc38结直肠肿瘤模型中以0.2mg/kg剂量瘤内给药sna3和以5mg/kg剂量腹膜内给药抗pd-1抗体的组合。两种试剂都是每周给药两次总共五次，当mtv为约100mm3时开始给药。观察到了sna和抗pd-1联合治疗的协同效应，与sna3和抗pd-1单独治疗分别为77％和80％的tgi相比，有高达93％的tgi(图22b)。与两种单独治疗组的约40天或媒介物组的约23天相比，联合治疗的小鼠的中位存活大于50天。
[0215]
在以上实验中，sna3是每周两次给药共五次。接下来，通过在小鼠mc38结直肠肿瘤模型中以1.6mg/kg剂量给药sna3每周一次或两次共五次，作为单独治疗或者与抗pd-1联合治疗，评估了sna给药计划对肿瘤生长的影响。sna单独治疗的每周一次给药计划显示了与每周两次治疗组类似的tgi和小鼠的存活(图22c)。还评估了每周一次和每周两次给药sna+抗pd-1联合治疗。由于用1.6mg/kg sna单独治疗获得了88-90％ tgi，因此联合治疗组的90-94％ tgi只有少量额外收益。如用sna单独治疗所见，每周给药一次sna+抗pd-1联合治疗显示了与每周两次给药sna+抗pd-1联合治疗类似的tgi(图22d)。
[0216]
由于已知人tlr9激动剂啮合小鼠tlr9，因此分别比较了人和小鼠选择性的sna1和3在mc38肿瘤模型中的抗肿瘤效应。该研究的剂量水平是根据这两种化合物在小鼠中的血清细胞因子剂量应答研究来选择的(图17d和图19b)。根据这些研究，预期sna1比sna3的剂量高50％是合适的。分别以2.4mg/kg和1.6mg/kg的人(sna1)和小鼠(sna3)选择性sna剂量进行了mc38肿瘤模型研究。正如预期的那样，作为单独治疗(图22e)和与抗pd-1联合治疗，sna1和sna3都产生了彼此类似的tgi和小鼠的存活。这些结果证实了sna1的抗肿瘤疗效以
及带有不同寡核苷酸序列的sna结构的实用性。
[0217]
当几个治疗组的小鼠存活到研究末期(第50天)时，对每周两次sna3(1.6mg/kg)+抗pd-1治疗组(图22d)的存活小鼠用mc38肿瘤细胞经腹膜内再攻击。作为对照，以相同方式攻击未经实验处理小鼠组。对照组的所有未经实验处理小鼠都显示了肿瘤生长，6只中有5只自肿瘤接种日起39天内就由于肿瘤负荷而死去，而在先治疗过的组中没有小鼠显示肿瘤生长，这表明了治疗组中的强大肿瘤特异性记忆应答(图22f)。
[0218]
emt6乳腺癌模型中的sna单独治疗
[0219]
接下来在对抗pd-1抗体治疗不敏感肿瘤模型(34)鼠emt6乳腺癌模型中评估了tlr9激动剂sna的效果。在第0天时用emt6肿瘤细胞接种小鼠。在肿瘤接种10天后当mtv为100mm3时开始，以0.8和3.2mg/kg剂量皮下给药sna3，每三天一次总共5次。如在mc38模型中一样，在emt6乳腺癌模型中的sna治疗也产生了剂量依赖性的统计学上显著的tgi(图24a)。sna3对肿瘤生长的抑制还导致了小鼠存活的延长。媒介物组小鼠显示了33.5天的中位存活时间，0.8和3.2mg/kg sna3剂量组小鼠的中位存活时间分别是39天和大于50天。
[0220]
然后评估了sna治疗对对侧肿瘤的抗肿瘤效应。在第0天在两侧胁腹都用emt6肿瘤接种小鼠，在第10天当mtv达到100mm3时开始治疗。经皮下注射在一侧胁腹肿瘤附近以3.2mg/kg瘤内给药sna3，监测了两侧胁腹上肿瘤的肿瘤生长。sna3单独治疗处理在两侧胁腹都产生了肿瘤的明显tgi(图24b)。
[0221]
此外，研究了人特异性sna1和阴性对照sna5在emt6模型中的疗效。用sna1或对照sna5以3.6mg/kg瘤内注射100mm
3 emt6肿瘤荷瘤小鼠，每周一次共5周。如用sna3所见，用sna1单独治疗处理的小鼠(图24c)显示出了统计学上显著的tgi，用对照sna5未观察到。sna1单独治疗也导致了荷瘤小鼠的存活随之增加，所有小鼠的存活都大于42天，而用媒介物和对照sna5处理的小鼠的中位存活分别是31.5和35.5天。
[0222]
emt6模型中的抗pd-1联合治疗
[0223]
接下来研究了sna3和抗pd-1组合在emt6肿瘤模型中的效果。以0.8mg/kg剂量皮下给药sna3或线性寡核苷酸4，每三天一次总共五次，在肿瘤接种之后第3天开始。以10mg/kg剂量腹膜内单独给药抗pd-1或者与sna3或线性寡核苷酸4联合给药，每五天一次总共三次，在肿瘤接种之后第5天开始。单独的抗pd-1未显示与媒介物相比的tgi(图24d)。以前的报道已表明，emt6肿瘤对抗pd-1治疗无效，本观察结果是与这些研究一致的(35)。与抗pd-1联合的线性寡核苷酸4对tgi影响极小。反之，与抗pd-1联合的sna3在8只小鼠的7只中导致了肿瘤的完全消退(图24d)且小鼠的存活大于44天。
[0224]
在第44天时，用emt6肿瘤细胞在对侧胁腹再攻击sna3+抗pd-1治疗组的存活小鼠，用一组未经实验处理小鼠作为对照。对照组的未经实验处理小鼠如预期那样产生了肿瘤。相比之下，先用sna3+抗pd-1治疗过的小鼠未显示肿瘤生长并存活到第104天(图24e)，这表明sna3+抗pd-1治疗之后就已经在这些小鼠中建立了肿瘤特异性适应性记忆应答。在第104天，用异源肿瘤细胞ct26结直肠或4t1乳腺肿瘤细胞攻击存活小鼠。这些异源肿瘤如在未经实验处理对照小鼠中一样生长(图24f)，表明sna和抗pd-1治疗引起了针对emt6肿瘤的肿瘤特异性适应性免疫应答，但不是针对异源ct26和4t1肿瘤。
[0225]
荷瘤小鼠的sna治疗改变了调节t细胞和效应t细胞应答
[0226]
为理解由sna以及sna与抗pd-1组合所诱导的抗肿瘤免疫性背后的机制，检查了
emt6肿瘤模型中tme和dln中的t细胞应答。肿瘤接种后第10天(第三剂sna之后一天)，将emt6肿瘤荷瘤小鼠处死进行免疫评估(图25a-25d)。通过免疫组织化学测定肿瘤中并通过流式细胞术测定dln中的foxp3调节t细胞(treg)和cd8效应t细胞(teff)。已观察到，显示tgi(图25a)的sna单独治疗降低了外周肿瘤中的treg并增加了深部肿瘤中的teff(图25b)，以及增加了dln中的teff:treg比值(图25c)。抑制emt6肿瘤生长无效的抗pd-1单独治疗在tme中也没有诱导t细胞水平的改变，但是引起了dln中treg细胞的增加和teff:treg比值的降低。显示出最强tgi的sna与抗pd-1组合降低了外周肿瘤treg，增加了外周和深部肿瘤teff，防止或逆转了由单独抗pd-1所诱导的dln treg增加，并增加了dln的teff:treg比值。这些数据表明了teff和treg水平之间的明显关联性，以及sna和抗pd-1联合治疗的肿瘤生长抑制。此外还检查了这些肿瘤中的mmdsc水平。观察到了sna单独治疗之后肿瘤中mmdsc降低的趋势，以及sna和抗pd-1联合治疗之后的进一步降低(图25d)。
[0227]
emt6肿瘤荷瘤小鼠中sna的静脉内给药
[0228]
在健康志愿者中静脉内给药tlr9激动剂cpg 7909未诱导细胞因子应答(31)。作为起始步骤，比较了皮下或静脉内用sna治疗过的小鼠中的血清细胞因子诱导。观察到了类似的细胞因子谱，尽管静脉内给药sna1时细胞因子应答发生得更早(4小时vs.10小时)(图26)。然后会被问到tlr9激动剂sna在emt6肿瘤荷瘤小鼠中静脉内给药时会不会显示抗肿瘤效应。单独静脉内给药sna3(0.25、1或2mg/kg)(图27a)或者与腹膜内给药抗pd-1相联合都引起了剂量依赖性tgi(图27b)。此外，伴随tgi的同时，小鼠的存活增加了。媒介物组和抗pd-1单独治疗组都显示了类似的34天的中位存活。在0.25mg/kg sna3时，作为单独治疗的中位存活为42天，当与抗pd-1联合时则为58.5天。在1和2mg/kg剂量水平时，作为单独治疗和与抗pd-1联合治疗两者的中位存活都大于63天。这些结果证实，tlr9激动剂sna作为单独治疗或与抗pd-1联合的iv给药之后都是有效的。
[0229]
为进一步评价静脉内给药sna会不会也引起肿瘤特异性长期记忆应答，随后分别用1
×
或2
×
emt6肿瘤细胞攻击来自sna3(1和2mg/kg组)的抗pd-1联合治疗组存活小鼠。无论多少肿瘤细胞数量用于再攻击，肿瘤都被排斥了并且未显示肿瘤生长(图27c)。
[0230]
讨论
[0231]
已表明tlr9激动剂促进固有和适应性免疫应答，包括b细胞增殖、ig产生、th1型细胞因子诱导和表面标志物活化。基于由不同类别的tlr9激动剂所诱导的特异性免疫应答谱，它们已作为癌症、哮喘和过敏症、感染性疾病治疗以及作为疫苗佐剂在临床前和临床研究中得到充分评价(13)。b类tlr9激动剂cpg 7909、iss 1018、imo-2055和mgn1703已作为单一治疗以及与肽、单克隆抗体、放疗和化疗联合的潜在癌症疗法在临床试验中得到评价(13,36-38)。然而，无论是作为单独治疗还是与抗癌试剂联合治疗，均未观察到临床益处，这就凸显了对更强效tlr9激动剂的需求。
[0232]
sna是一类新型试剂，其中寡核苷酸紧密包装在纳米颗粒上，与线性寡核苷酸相比，形成寡核苷酸的三维排列。已表明sna促进了细胞摄取的增加并抵抗核酸酶的降解(17,39)。因此，已选择已知的tlr9激动剂，诸如在肿瘤模型和/或临床试验中已经得到研究的线性寡核苷酸2和4，创建sna结构(分别是sna1和sna3)来建立sna在免疫肿瘤学应用中的广泛治疗应用。
[0233]
目前的研究清楚地证实，以sna形式提呈的寡核苷酸(sna1)比非sna形式的相同寡
核苷酸(线性寡核苷酸)更有效地被全身循环中的免疫细胞所摄取。这些结果与raw 264.7细胞中sna更高摄取的早期观察结果(17)相一致，表明了原代细胞对sna的有效摄取。此外，sna1在细胞系中选择性刺激tlr9，比线性寡核苷酸更强力。tlr9活化的增加能够归因于与线性寡核苷酸相比，sna形式的寡核苷酸增加了i)细胞摄取和ii)核酸酶稳定性。已表明sna显示出了比线性寡核苷酸更高的核酸酶稳定性，这是由于纳米颗粒结构周围增加的负电荷密度和盐梯度导致了核酸酶对sna中寡核苷酸的可及性和活性的降低(39)。
[0234]
在原代小鼠脾细胞和人pbmc中，sna3和sna1分别诱导th1型细胞因子分泌，但不诱导th2型细胞因子分泌。细胞因子诱导是时间和sna剂量依赖性的。与线性寡核苷酸相比，sna在啮齿动物和人原代细胞中都诱导相对更高水平的细胞因子。其中的cpg二核苷酸被gpc二核苷酸取代的对照sna则没有观察到细胞因子分泌或者仅仅是背景水平的分泌。这些结果确立了sna形式的cpg寡核苷酸选择性地与tlr9相互作用，比线性cpg寡核苷酸更有效地诱导tlr9介导的免疫应答。
[0235]
除了体外研究外，已证实sna在小鼠和在nhp中体内诱导tlr9介导的免疫应答。单剂量的sna在小鼠中产生了th1型全身性细胞因子诱导(40)，这些结果也与体外研究一致。此外，与相同序列的线性寡核苷酸相比，sna在小鼠中显示了更慢和更持久的细胞因子诱导谱。已表明线性cpg寡核苷酸在给药后4-8小时内诱导细胞因子的高峰水平，12-16小时就恢复到给药前水平，这取决于所诱导的细胞因子类型(23-25)。相比之下，sna显示了更慢的细胞因子诱导动力学，在给药后10-16小时达到高峰水平，20-24小时或有时超过24小时才恢复到给药前水平，这取决于细胞因子类型。可以假设，与线性寡核苷酸相比，sna细胞因子诱导更慢的动力学可能是由于纳米颗粒结构导致通过淋巴管到引流淋巴结更慢。除了皮下给药途径外，还研究了肌内、静脉内和鼻腔给药途径，已在小鼠中观察到了类似的th1型细胞因子谱。
[0236]
tlr9的表达在啮齿动物中(b细胞、pdc、巨噬细胞、单核细胞和mdc)比在灵长类动物中(b细胞和pdc)更广泛(27,29)。作为概念验证，本研究证实了在食蟹猴中急性给药sna就诱导了剂量依赖性免疫应答而没有任何不良事件。在nhp中给药的sna剂量耐受性良好，没有明显的局部注射部位反应和临床参数的变化(所监测到的临床观察结果列于材料和方法部分)。sna给药在治疗24小时内就导致nk细胞、b细胞、t细胞、mdc和pdc的活化和pdc群在循环中的成熟。免疫细胞活化呈剂量依赖性，在4.5mg/kg剂量达到高峰水平，然后在6mg/kg的最高剂量钝化。这些结果与tlr9激动剂产生钟形的剂量反应曲线的先前报道一致(8,41,42)，因为免疫调节回路是在炎症反应诱导阈值水平之后被激活的(10,43)。已显示ip-10是灵长类动物tlr9活化最可靠的生物标志物(44)。与本观察结果一致，sna在nhp中诱导了快速且强烈的剂量依赖性ip-10诱导。sna对nhp的给药还导致全身循环的短暂血液学改变，这是由24小时之内淋巴细胞、白细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞的减少和中性粒细胞的增加所确定的。正如所预期的，这些血液学变化在接下来的一两天内就恢复到给药前水平。外周血中的这些血液学变化也是与灵长类动物中其他tlr9激动剂和人类中重组细胞因子的报道结果一致的(45-47)。这些结果证实，sna与tlr9结合并诱导强力的tlr9介导的免疫应答，在啮齿动物和nhp中没有任何不良事件。
[0237]
在鼠肿瘤模型中，tlr9激动剂sna给药在mc38结直肠癌和emt6乳腺癌模型中诱导了剂量依赖性肿瘤生长的降低和存活的增加。鼠特异性sna和人特异性sna在小鼠中都具有
活性，但正如所预期的，小鼠特异性sna在较低剂量水平下就具有活性。
[0238]
cpi是一类通过阻断某些免疫抑制蛋白而发挥作用的治疗剂，这就使抗肿瘤免疫应答能够发展或扩大。近年来，随着美国fda批准的靶向ctla-4、pd-l1和pd-1检查点蛋白的药物，cpi治疗蓬勃发展，并且正在开发其他靶标。然而，相当多的患者在治疗后复发或者根本对cpi治疗无反应(33,34)。若干研究已经表明，肿瘤逃逸cpi治疗可能是由于效应t细胞耗尽、功能受损的抗原提呈细胞(apc)和/或诸如mdsc之类的肿瘤支持细胞类型的浸润(48)。已知tlr9激动剂产生快速的固有免疫应答以及长期的适应性免疫应答。已显示tlr9激动剂产生包括apc、cd4和cd8 t细胞在内的免疫细胞的广泛活化，并抑制tme中的treg和mdsc(49-51)。因此，使用tlr9激动剂sna可能是与cpi联合来有效治疗更大患者群的合理方法。与预期的机制一致，sna在抗pd-1敏感性(mc38)和不敏感性(emt6)肿瘤模型中均显示与抗pd-1的协同作用，tgi和小鼠存活的增加。
[0239]
如通过血清中的细胞因子诱导所确定的，对荷瘤小鼠的sna给药显示了快速的剂量依赖性固有免疫应答，这是在濒死肿瘤所释放的肿瘤相关抗原存在下联系适应性免疫应答所必需的。用tlr9激动剂sna治疗过的mc38或emt6肿瘤的荷瘤小鼠不受相同肿瘤细胞再攻击的影响，这表明sna治疗诱导了针对治疗过的肿瘤细胞的免疫记忆形成。然而，异源肿瘤细胞系ct-26或4t1的攻击导致了肿瘤生长，这证实了免疫记忆应答是肿瘤特异性的。
[0240]
从机理而言，在抗pd-1不敏感的emt6肿瘤模型中，sna治疗导致了在tme和dln两者中t效应细胞对t调节细胞的比值增加。尽管抗pd-1单独治疗增加了t调节细胞，但在与tlr9激动剂sna的联合治疗中克服了这个效应。另外，sna治疗之后在tme/dln中treg和mmdsc的降低可能支持了联合治疗组中所观察到的抗肿瘤效果增加。在瘤内、皮下或静脉内途径给药之后，sna的抗肿瘤活性在目前的肿瘤模型研究中是明显的。这些研究证实了基于纳米颗粒的sna能够通过各种给药途径在人体中进行利用。
[0241]
总之，现有结果证实，tlr9激动剂sna在小鼠和非人灵长类动物体外和体内被原代免疫细胞摄取，并且比不是sna形式的相同序列tlr9激动剂(线性寡核苷酸)在更大程度上活化tlr9。在皮下、瘤内和静脉内途径给药之后，tlr9激动剂sna作为单独治疗显示了剂量依赖性肿瘤生长抑制并延长了荷瘤小鼠的存活，增强了联合治疗中抗pd-1的效果。单独或与cpi联合的tlr9激动剂sna的作用模式是通过快速的固有免疫应答接着诱导肿瘤特异性适应性免疫应答，增加了淋巴细胞浸润，增加了效应细胞群，并减少了tme和/或dln中的treg以及mmdsc。与过去的线性tlr9激动剂用于癌症免疫治疗失败不同，本文所报道的研究强力支持了tlr9激动剂sna作为癌症治疗潜在候选的应用，其作为单独治疗及与cpi联合治疗。
[0242]
材料和方法
[0243]
dna合成和纯化
[0244]
使用缀合胆固醇的cpg和gpc寡核苷酸进行sna合成。使用β-氰乙基亚磷酰胺化学法在合适的固相载体上以5'到3'方向合成胆固醇-cpg和gpc寡核苷酸，以3'到5'方向合成线性cpg寡核苷酸。在oligopilot plus 100合成仪(ge healthcare)上进行0.2至2.2mmole规模的合成。所需的da、dc、dg、t的3'-和5'-亚磷酰胺、间隔物-18(六乙二醇)和teg-胆固醇都获自chemgenes corporation(wilmington,ma)。使用苯乙酰二硫醚(pads)作为氧化剂来获得硫代磷酸酯主链。合成之后，将寡核苷酸从固相载体中切割出来，使用氨溶
液通过标准操作方案进行脱保护，通过rp-hplc纯化，使用260nm的紫外吸光度测定浓度(cary 100bio紫外-可见光分光光度计)。通过maldi-tof质谱(brucker autoflex iii)对所合成的所有寡核苷酸的分子量进行了表征，通过ae-hplc对纯度进行了表征。研究中所使用的寡核苷酸的纯度在90％至98％之间(寡核苷酸特征数据参见表4)。使用上述操作方案合成了3
’‑
端t上带有荧光素标记的寡核苷酸。通过动态浊度测定法测试了化合物的内毒素，内毒素水平小于1个内毒素单位/mg。
[0245]
表4.研究中所使用的寡核苷酸和sna分析数据。化合物#1对应于seq id no:4，化合物#2对应于seq id no:5，化合物#3对应于seq id no:6，化合物#4对应于seq id no:7，化合物#5对应于seq id no:8。
[0246][0247]
*所有序列都包含硫代磷酸酯主链；sp18代表间隔物-18或者六乙二醇接头；teg代表四甘醇接头；下划线表示cpg。n/a——不适用。
[0248]
sna合成
[0249]
合成sna的所有步骤均在无菌环境中进行，所用试剂无内毒素。sna的合成是通过将30倍摩尔过量的缀合胆固醇的寡核苷酸添加到1
×
pbs中的21
±
2nm dopc脂质体中，在4℃过夜孵育，获得约30个寡核苷酸/脂质体。使用zetasizer nano zs(malvern instruments,malvern,uk)通过dls测定sna大小。
[0250]
荧光标记寡核苷酸合成和摄取
[0251]
如上所述进行寡核苷酸合成，但在3'-末端胸腺嘧啶上带有荧光素标记。如上所述进行sna合成，但将3'-末端胸苷上带有荧光素标记的3'-胆固醇寡核苷酸以100个寡核苷酸/脂质体的比例负载到50nm dopc脂质体上。
[0252]
报告细胞系
[0253]
hek-blue报告细胞(空1，htlr3，htlr7，htlr8，htlr9)是从invivogen(圣地亚哥，ca)获取的，并根据供应商的说明书进行培养。用tlr激动剂sna、线性寡核苷酸或对照gpc sna如文中所指示那样处理细胞24小时，除另有指示外，不改变培养基；对于较短的激动剂处理，在时间点移除细胞培养基，用完全培养基洗涤细胞，然后添加新鲜的完全培养基。作为阳性对照，用85nm低分子量多聚i:c(invivogen)处理htlr3-hek-blue细胞，用1μm r848处理htlr7-hek-blue和htlr8-hek-blue细胞，用10μg/ml pma(invivogen)处理空1-hek-blue细胞。在添加激动剂后24小时，根据供应商的说明书，使用quanti-blue
tm
报告测定法(invivogen)来定量tlr活化。
[0254]
原代细胞分离、培养和细胞因子分析
[0255]
从c57bl/6小鼠获得原代小鼠脾细胞。使用ficoll(premium medium(1.078g/ml最大密度)；ge healthcare)梯度密度离心法从zen-bio(research triangle park,nc)的健康志愿者获取的血沉棕黄层部分处理得到原代人pbmc，并在环境温度下过夜运输。小鼠脾细胞和hpbmc均新鲜使用(即未冷冻)。用tlr9激动剂化合物过夜处理原代细胞。使用小鼠或人多重细胞因子阵列(quansys,logan,ut)在细胞培养物上清中测定细胞因子水平。
[0256]
小鼠血清细胞因子分析
[0257]
根据avastus批准的iacuc操作方案，在avastus preclinical services(cambridge,ma)进行了小鼠血清细胞因子体内研究。用tlr9激动剂化合物皮下注射雌性6周龄c57bl/6小鼠。在所示时间或者未指明的话就在10小时的时候，获取全血并处理以获得血清。使用如上所述的小鼠多重细胞因子阵列(quansys)测定小鼠血清中的细胞因子水平。
[0258]
非人灵长类动物研究
[0259]
根据mpi research批准的iacuc操作方案在mpi research(mattawan,mi)进行了非人灵长类动物研究。每个治疗组由两只雄性食蟹猴和两只雌性食蟹猴组成，年龄2-4岁，体重2-4公斤。在第1天皮下给药化合物。在给药前和所示时间点抽血，通过流式细胞术、血液学和血清细胞因子分析进行分析。在收集最终血液样本之后，再监测动物≥14天，然后用另外的剂量或化合物处理。研究动物的临床监测每天至少进行两次，包括但不限于对皮肤、皮毛、眼睛、耳朵、鼻子、口腔、胸、腹部、外生殖器、肢和脚、呼吸和循环效应、诸如唾液的自主效应、包括震颤、痉挛、对训练的反应和不寻常行为在内的神经系统效应的评价。
[0260]
对于血液学，在给药前和给药后24、48、72小时抽血，一些情况下在给药后96和168小时抽血。在mpi research进行血液的血细胞计数和区分(differential)。
[0261]
对于流式细胞术，在给药前和给药后24小时抽血并新鲜使用。使用bd facs aria仪器在flowmetric(doylestown,pa)进行流式细胞术，评估cd3+t淋巴细胞、cd3+cd69+活化t淋巴细胞、cd3+cd4+辅助t淋巴细胞、cd3+cd8+细胞毒t淋巴细胞、cd3-cd16+自然杀伤(nk)细胞、cd3-cd16+cd69+活化自然杀伤(nk)细胞、cd3-cd20+b淋巴细胞、cd3-cd20+cd86+活化b淋巴细胞、cd3/8/14/20-hladr+cd11c-cd123+浆细胞样树突状细胞(pdc)、cd3/8/14/20-hladr+cd11c-cd123+cd86+活化pdc、cd3/8/14/20-hladr+cd11c-cd123+cd83+成熟pdc、cd3/8/14/20-hladr+cd11c+cd123-髓样树突状细胞(mdc)、cd3/8/14/20-hladr+cd11c+cd123-cd83+活化mdc。
[0262]
在给药前和给药后1、2、4、8、12、16、24、48、72和168小时抽血并处理以获得血清。在波士顿大学analytical instrumentation core(boston,ma)使用monkey magnetic 29-plex panel(thermofisher,waltham,ma)评估血清细胞因子水平。
[0263]
mc38肿瘤模型
[0264]
mc38肿瘤研究是根据crown biosciences批准的iacuc操作方案在crown biosciences(kannapolis,nc)进行的。在7-8周龄雌性c57bl/6小鼠右侧胁腹接种mc38肿瘤细胞(1
×
106个细胞)。当在大约第9天或第10天平均肿瘤体积达到100mm3时开始治疗。通过瘤内注射以所示剂量水平给药sna，每3天一次总共5个剂量，除了在所示研究中每周进行一次给药总共5个剂量。在sna给药同日以5mg/kg腹膜内给药抗pd-1(bio x cell,west lebanon,nh)。
[0265]
在初始肿瘤接种后第62天，将mc38肿瘤细胞(1
×
106个细胞)接种到未经实验处理小鼠(n＝6)或者先用sna3(1.6mg/kg每周两次)+抗pd-1治疗过的小鼠(n＝4)中进行腹膜内攻击。
[0266]
emt6肿瘤模型
[0267]
根据oncodesign批准的iacuc操作方案，在oncodesign(dijon,法国)进行emt6肿瘤研究。在6-7周龄雌性balb/c小鼠右侧胁腹中接种emt6肿瘤细胞(1
×
106个细胞)。治疗在肿瘤接种后3天开始，此时平均肿瘤体积约为15mm3，或者在肿瘤接种后第10天平均肿瘤体积达到100mm3时开始。在肿瘤周围(瘤周)以所示剂量水平皮下注射来给药sna，每3天一次总共5个剂量。对于联合治疗研究，抗pd-1以10mg/kg经腹膜内给药，从第5天开始，每5天一次总共3个剂量。
[0268]
在瘤内给药实验中，当肿瘤接种后第10天平均肿瘤体积达到100mm3时开始治疗。按所示剂量水平通过瘤内注射来给药sna，每7天一次总共5个剂量。
[0269]
在静脉内给药实验中，治疗在肿瘤接种后三天开始。通过静脉内弹丸式注射将1-2mg/kg的sna给药到尾静脉中，按照规定每3天一次总共5个剂量。
[0270]
对于再攻击实验，将1
×
106个emt6、ct26或4t1肿瘤细胞接种到先用sna3+抗pd-1治疗过的小鼠或者未经实验处理的小鼠的胁腹中。
[0271]
免疫组织化学
[0272]
免疫组织化学是在biodoxis laboratories(romainville，法国)进行的。在福尔马林固定的肿瘤样品的5μm厚切片上进行foxp3染色。计数每mm2肿瘤的foxp3阳性细胞数。对冷冻保存的肿瘤样品进行cd8染色。将cd8浸润评分为0-4级，零级表示每个20
×
显微镜视野的cd8细胞为0，一级表示1-5个，二级表示6-10个，三级表示11-20个，四级表示大于20个。
[0273]
流式细胞术
[0274]
流式细胞术是在oncodesign进行的。用以下抗体或同种型对照来染色新鲜分离的引流淋巴结细胞。t细胞组：pd-1，foxp3，cd4，igg2b(miltenyi biotec,san diego,ca)，igg2b，cd8a，igg2a，cd25，igg1，cd3，igg2，cd45(bd biosciences,san jose,ca)，igg1(beckman coulter,brea,ca)。mdsc组：cd274/pd-l1(acris/interchim,法国)、igg2a、cd3、igg1、igg2a、cd45、igg2、cd11b、igg2b(bd biosciences)、ly-6g、rea对照s、ly-6c、igg2a、内染色试剂盒(miltenyi biotec)、inos/nos2(ebioscience,san diego,ca)、arg1、igg(r&d systems,minneapolis,mn)。对于每个样品，使用space流式细胞仪记录10,000个cd45+事件。对活白细胞门控后，每个亚群显示为亲本群的百分比。
[0275]
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1.免疫刺激性球形核酸(is-sna)，其包括：
[0414]
具有寡核苷酸壳核和检查点抑制剂，其中所述寡核苷酸壳包含位于所述核外部的免疫刺激性寡核苷酸。
[0415]
2.实施方案1所述的is-sna，其中所述核是实心核或空心核。
[0416]
3.实施方案2所述的is-sna，其中所述核是实心核，其包含了包括金和银在内的贵金属，包括铁和钴在内的过渡金属，包括二氧化硅在内的金属氧化物，聚合物或其组合。
[0417]
4.实施方案2所述的is-sna，其中所述核是实心聚合物核，其中所述聚合物核包含了两亲性嵌段共聚物，包括聚苯乙烯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚羟基乙酸、聚己内酯在内的疏水聚合物以及其他生物相容性聚合物。
[0418]
5.实施方案2所述的is-sna，其中所述核是脂质体核。
[0419]
6.实施方案5所述的is-sna，其中所述脂质体核包含选自以下的一种或多种脂质：诸如鞘氨醇、鞘氨醇磷酸酯、甲基鞘氨醇和二氢鞘氨醇、神经酰胺、神经酰胺磷酸酯、1-0酰基神经酰胺、二氢神经酰胺、2-羟基神经酰胺、鞘磷脂、糖基化鞘脂、硫苷脂、神经节苷脂、鞘磷脂及各种长度和饱和状态的植物鞘氨醇以及它们的衍生物的鞘脂，诸如磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酸、溶血磷脂酸、环状lpa、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、肌醇磷酸酯、lpi、心磷脂、溶血心磷脂、双(单酰甘油)磷酸酯、(二酰甘油)磷酸酯、醚脂、二植烷醚脂及各种长度、饱和状态的缩醛磷脂以及它们的衍生物的磷脂，诸如胆固醇、脱氢胆固醇、豆甾醇、羊毛甾醇、烯胆烷醇、薯蓣皂苷元、谷甾醇、酵母甾醇、zymostenol、14-脱甲基羊毛甾醇、胆固醇硫酸酯、dhea、dhea硫酸盐、14-脱甲基-14-脱氢羊毛甾醇、谷甾烷醇、菜油甾醇、醚阴离子脂质、醚阳离子脂质、镧系螯合脂质、a-环取代氧化固醇、b-环取代氧化固醇、d-环取代氧化固醇、侧链取代氧化固醇、双取代氧化固醇、胆甾烷酸衍生物、氟化固醇、荧光甾醇、磺化固醇、磷酸化固醇及不同长度、饱和状态的多不饱和固醇及其衍生物的固醇。
[0420]
7.实施方案5-6中任一项所述的is-sna，其中所述脂质体核包括一种类型的脂质。
[0421]
8.实施方案5-6中任一项所述的is-sna，其中所述脂质体核包括2-10种不同脂质。
[0422]
9.实施方案5-8中任一项所述的is-sna，其中将所述的检查点抑制剂掺入所述脂质体核。
[0423]
10.实施方案1-4中任一项所述的is-sna，其中将所述检查点抑制剂与is-sna一起配制在组合物中。
[0424]
11.实施方案1-10中任一项所述的is-sna，其中所述检查点抑制剂选自单克隆抗体、人源化抗体、全人源抗体、融合蛋白或其组合或者小分子。
[0425]
12.实施方案11所述的is-sna，其中所述检查点抑制剂抑制选自ctla-4、pdl1、pdl2、pd1、b7-h3、b7-h4、btla、hvem、tim3、gal9、lag3、vista、kir、2b4、cd160、cgen-15049、chk 1、chk2、a2ar、b-7家族配体或其组合的检查点蛋白。
[0426]
13.实施方案12所述的is-sna，其中所述的检查点抑制剂是抗pd-1抗体。
[0427]
14.实施方案13所述的is-sna，其中所述的抗pd-1抗体是bms-936558(纳武单抗)。
[0428]
15.实施方案12所述的is-sna，其中所述的检查点抑制剂是抗pdl1抗体。
[0429]
16.实施方案15所述的is-sna，其中所述抗pdl1抗体是mpdl3280a(阿特朱单抗)。
[0430]
17.实施方案12所述的is-sna，其中所述检查点抑制剂是抗ctla-4抗体。
[0431]
18.实施方案17所述的is-sna，其中所述抗ctla-4抗体是伊匹单抗。
[0432]
19.实施方案1-18中任一项所述的is-sna，其中一种或多种所述的免疫刺激性寡核苷酸包含选自seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6和seq id no:7的序列。
[0433]
20.用于治疗癌症的方法，其包括：
[0434]
通过静脉内注射给予患有癌症的受试者治疗癌症有效量的免疫刺激性球形核酸(is-sna)，所述球形核酸包括核和寡核苷酸壳，所述寡核苷酸壳包含位于所述核外部的免疫刺激性寡核苷酸。
[0435]
21.实施方案20所述的方法，其中给予所述受试者所述的is-sna至少4次，每次给药间隔至少3天。
[0436]
22.实施方案20所述的方法，其中每周一次给予所述受试者所述的is-sna共4-12周。
[0437]
23.实施方案20-22中任一项所述的方法，还包括给予所述受试者检查点抑制剂。
[0438]
24.实施方案23所述的方法，其中所述is-sna和检查点抑制剂是同天给予的。
[0439]
25.实施方案23所述的方法，其中所述is-sna和检查点抑制剂是在不同天给予的。
[0440]
26.实施方案23所述的方法，其中所述检查点抑制剂是在is-sna之前给予的。
[0441]
27.实施方案25-26中任一项所述的方法，其中所述is-sna诱导细胞因子分泌。
[0442]
28.实施方案27所述的方法，其中所述is-sna诱导th1型细胞因子分泌。
[0443]
29.实施方案19-28中任一项所述的方法，其中与不连接到is-sna的线性免疫刺激性寡核苷酸相比，所述is-sna中的免疫刺激性寡核苷酸增加了效应t细胞与调节t细胞的比例。
[0444]
30.实施方案19-29中任一项所述的方法，其中所述is-sna是实施方案1-17中任一项所述的is-sna。
[0445]
31.实施方案19-30中任一项所述的方法，其中所述is-sna靶向受试者细胞中的tlr9受体。
[0446]
32.实施方案19-31中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
[0447]
33.实施方案19-31中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
[0448]
34.实施方案19-33中任一项所述的方法，其中所述癌症选自胆道癌；脑癌；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食管癌；胃癌；上皮内肿瘤；淋巴瘤；肝癌；肺癌(例如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)；黑色素瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；睾丸癌；甲状腺癌；和肾癌。
[0449]
35.用于治疗癌症的方法，其包括：
[0450]
给予患有癌症的受试者治疗癌症有效量的免疫刺激性球形核酸(is-sna)和检查点抑制剂，所述球形核酸包括核和寡核苷酸壳，所述寡核苷酸壳包含位于所述核外部的免疫刺激性寡核苷酸。
[0451]
36.实施方案35所述的方法，其中所述is-sna和检查点抑制剂的联合给药对所述受试者的存活产生了协同效应。
[0452]
37.实施方案35所述的方法，其中所述is-sna和检查点抑制剂是同天给予的。
[0453]
38.实施方案35所述的方法，其中所述is-sna和检查点抑制剂是在不同天给予的。
[0454]
39.实施方案35所述的方法，其中所述检查点抑制剂是在is-sna之前给予的。
[0455]
40.实施方案35-39中任一项所述的方法，其中所述检查点抑制剂选自单克隆抗体、人源化抗体、全人源抗体、融合蛋白或其组合或者小分子。
[0456]
41.实施方案40所述的方法，其中所述检查点抑制剂抑制选自ctla-4、pdl1、pdl2、pd1、b7-h3、b7-h4、btla、hvem、tim3、gal9、lag3、vista、kir、2b4、cd160、cgen-15049、chk 1、chk2、a2ar、b-7家族配体或其组合的检查点蛋白。
[0457]
42.实施方案41所述的方法，其中所述检查点抑制剂是抗pd-1抗体。
[0458]
43.实施方案42所述的方法，其中抗pd-1抗体是bms-936558(纳武单抗)。
[0459]
44.实施方案41所述的方法，其中所述检查点抑制剂是抗pdl1抗体。
[0460]
45.实施方案44所述的方法，其中所述抗pdl1抗体是mpdl3280a(阿特朱单抗)。
[0461]
46.实施方案41所述的方法，其中所述检查点抑制剂是抗ctla-4抗体。
[0462]
47.实施方案44所述的方法，其中所述抗ctla-4抗体是伊匹单抗。
[0463]
48.实施方案35-47中任一项所述的方法，其中所述is-sna诱导细胞因子分泌。
[0464]
49.实施方案48所述的方法，其中所述is-sna诱导th1型细胞因子分泌。
[0465]
50.实施方案35-49中任一项所述的方法，其中相对于不结合到is-sna的线性免疫刺激性寡核苷酸，所述is-sna中的免疫刺激性寡核苷酸增加了效应t细胞与调节t细胞的比例。
[0466]
51.实施方案35-50中任一项所述的方法，其中所述is-sna是实施方案1-19中任一项所述的is-sna。
[0467]
52.实施方案35-51中任一项所述的方法，其中所述is-sna靶向受试者细胞中的tlr9受体。
[0468]
53.实施方案35-52中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
[0469]
54.实施方案35-52中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
[0470]
55.用于治疗癌症的方法，其包括：
[0471]
通过瘤内或皮下注射给予患有癌症的受试者治疗癌症有效量的免疫刺激性球形核酸(is-sna)，所述球形核酸包括核和寡核苷酸壳，所述寡核苷酸壳包含位于所述核外部的免疫刺激性寡核苷酸，其中给予所述受试者所述的is-sna至少4次，每次给药间隔至少3天。
[0472]
56.实施方案20-55中任一项所述的方法，其中所述核是实心核或空心核。
[0473]
57.实施方案56所述的方法，其中所述核是实心核，其包含了包括金和银在内的贵金属，包括铁和钴在内的过渡金属，包括二氧化硅在内的金属氧化物，聚合物或其组合。
[0474]
58.实施方案56所述的方法，其中所述核是实心聚合物核，其中所述聚合物核包含了两亲性嵌段共聚物，包括聚苯乙烯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚羟基乙酸、聚己内酯在内的疏水聚合物以及其他生物相容性聚合物。
[0475]
59.实施方案56所述的方法，其中所述核是脂质体核。
[0476]
60.实施方案59所述的方法，其中所述脂质体核包含选自以下的一种或多种脂质：诸如鞘氨醇、鞘氨醇磷酸酯、甲基鞘氨醇和二氢鞘氨醇、神经酰胺、神经酰胺磷酸酯、1-0酰基神经酰胺、二氢神经酰胺、2-羟基神经酰胺、鞘磷脂、糖基化鞘脂、硫苷脂、神经节苷脂、鞘磷脂及各种长度和饱和状态的植物鞘氨醇以及它们的衍生物的鞘脂，诸如磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酸、溶血磷脂酸、环状lpa、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、肌醇磷酸酯、lpi、心磷脂、溶血心磷脂、双(单酰甘油)磷酸酯、(二酰甘油)磷酸酯、醚脂、二植烷醚脂及各种长度、饱和状态的缩醛磷脂以及它们的衍生物的磷脂，诸如胆固醇、脱氢胆固醇、豆甾醇、羊毛甾醇、烯胆烷醇、薯蓣皂苷元、谷甾醇、酵母甾醇、zymostenol、14-脱甲基羊毛甾醇、胆固醇硫酸酯、dhea、dhea硫酸盐、14-脱甲基-14-脱氢羊毛甾醇、谷甾烷醇、菜油甾醇、醚阴离子脂质、醚阳离子脂质、镧系螯合脂质、a-环取代氧化固醇、b-环取代氧化固醇、d-环取代氧化固醇、侧链取代氧化固醇、双取代氧化固醇、胆甾烷酸衍生物、氟化固醇、荧光甾醇、磺化固醇、磷酸化固醇及不同长度、饱和状态的多不饱和固醇及其衍生物的固醇。
[0477]
61.实施方案59或60所述的方法，其中所述脂质体核包括一种类型的脂质。
[0478]
62.实施方案59或60所述的方法，其中所述脂质体核包括2-10种不同脂质。
[0479]
63.实施方案20-62中任一项所述的方法，其中所述免疫刺激性寡核苷酸是cpg寡核苷酸。
[0480]
64.实施方案63所述的方法，其中所述cpg寡核苷酸是b类cpg寡核苷酸。
[0481]
65.实施方案63所述的方法，其中所述cpg寡核苷酸是c类cpg寡核苷酸。
[0482]
66.实施方案63所述的方法，其中所述cpg寡核苷酸是a类cpg寡核苷酸。
[0483]
67.实施方案63所述的方法，其中所述cpg寡核苷酸是a类cpg寡核苷酸、b类cpg寡核苷酸和c类cpg寡核苷酸的混合物。
[0484]
68.实施方案63所述的方法，其中所述cpg寡核苷酸的长度为4-100个核苷酸。
[0485]
69.实施方案63所述的方法，其中所述寡核苷酸壳的免疫刺激性寡核苷酸是放射状朝向外部的。
[0486]
70.实施方案63所述的方法，其中所述寡核苷酸壳具有5-1,000个免疫刺激性寡核苷酸/is-sna的密度。
[0487]
71.实施方案63所述的方法，其中所述寡核苷酸壳具有100-1,000个免疫刺激性寡核苷酸/is-sna的密度。
[0488]
72.实施方案63所述的方法，其中所述寡核苷酸壳具有500-1,000个免疫刺激性寡核苷酸/is-sna的密度。
[0489]
73.实施方案63所述的方法，其中所述寡核苷酸具有至少一个核苷间硫代磷酸酯连接。
[0490]
74.实施方案63所述的方法，其中所述cpg寡核苷酸的每一个核苷间连接都是硫代磷酸酯。
[0491]
75.实施方案55-74中任一项所述的方法，其中所述is-sna诱导细胞因子分泌。
[0492]
76.实施方案75所述的方法，其中所述is-sna诱导th1型细胞因子分泌。
[0493]
77.实施方案55-76中任一项所述的方法，其中相对于不结合到is-sna的线性免疫刺激性寡核苷酸，所述is-sna中的免疫刺激性寡核苷酸增加了效应t细胞与调节t细胞的比例。
[0494]
78.实施方案55-77中任一项所述的方法，其中所述is-sna是实施方案1-17中任一项所述的is-sna。
[0495]
79.实施方案55-78中任一项所述的方法，其中所述is-sna靶向所述受试者细胞中的tlr9受体。
[0496]
80.实施方案55-79中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
[0497]
81.实施方案55-79中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
[0498]
82.用于治疗病症的方法，其包括：
[0499]
经鼻或肌内给予患有病症的受试者治疗病症有效量的免疫刺激性球形核酸(is-sna)和检查点抑制剂，所述球形核酸包括核和寡核苷酸壳，所述寡核苷酸壳包括位于所述核外部的免疫刺激性寡核苷酸。
[0500]
83.实施方案82所述的方法，其中所述病症是癌症。
[0501]
等效方案
[0502]
使用不超过常规的实验，本领域技术人员就将认识到或者能够确认本文所描述的
本发明具体实施方案的许多等效方案。打算通过所附权利要求书来包括这些等效方案。
[0503]
本文所披露的包括专利文献在内的所有参考文献都通过引用以其整体并入。

技术特征：
1.免疫刺激性球形核酸(is-sna)，其包括：具有寡核苷酸壳核和检查点抑制剂，其中所述寡核苷酸壳包含位于所述核外部的免疫刺激性寡核苷酸。2.权利要求1所述的is-sna，其中所述核是实心核或空心核。3.权利要求2所述的is-sna，其中所述核是实心核，其包含了包括金和银在内的贵金属，包括铁和钴在内的过渡金属，包括二氧化硅在内的金属氧化物，聚合物或其组合。4.权利要求2所述的is-sna，其中所述核是实心聚合物核，其中所述聚合物核包含了两亲性嵌段共聚物，包括聚苯乙烯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚羟基乙酸、聚己内酯在内的疏水聚合物以及其他生物相容性聚合物。5.权利要求2所述的is-sna，其中所述核是脂质体核。6.权利要求5所述的is-sna，其中所述脂质体核包含选自以下的一种或多种脂质：诸如鞘氨醇、鞘氨醇磷酸酯、甲基鞘氨醇和二氢鞘氨醇、神经酰胺、神经酰胺磷酸酯、1-0酰基神经酰胺、二氢神经酰胺、2-羟基神经酰胺、鞘磷脂、糖基化鞘脂、硫苷脂、神经节苷脂、鞘磷脂及各种长度和饱和状态的植物鞘氨醇以及它们的衍生物的鞘脂，诸如磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酸、溶血磷脂酸、环状lpa、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、肌醇磷酸酯、lpi、心磷脂、溶血心磷脂、双(单酰甘油)磷酸酯、(二酰甘油)磷酸酯、醚脂、二植烷醚脂及各种长度、饱和状态的缩醛磷脂以及它们的衍生物的磷脂，诸如胆固醇、脱氢胆固醇、豆甾醇、羊毛甾醇、烯胆烷醇、薯蓣皂苷元、谷甾醇、酵母甾醇、zymostenol、14-脱甲基羊毛甾醇、胆固醇硫酸酯、dhea、dhea硫酸盐、14-脱甲基-14-脱氢羊毛甾醇、谷甾烷醇、菜油甾醇、醚阴离子脂质、醚阳离子脂质、镧系螯合脂质、a-环取代氧化固醇、b-环取代氧化固醇、d-环取代氧化固醇、侧链取代氧化固醇、双取代氧化固醇、胆甾烷酸衍生物、氟化固醇、荧光甾醇、磺化固醇、磷酸化固醇及不同长度、饱和状态的多不饱和固醇及其衍生物的固醇。7.权利要求5-6中任一项所述的is-sna，其中所述脂质体核包括一种类型的脂质。8.权利要求5-6中任一项所述的is-sna，其中所述脂质体核包括2-10种不同脂质。9.权利要求5-8中任一项所述的is-sna，其中将所述的检查点抑制剂掺入所述脂质体核。10.权利要求1-4中任一项所述的is-sna，其中将所述检查点抑制剂与is-sna一起配制在组合物中。

技术总结
本发明的方面涉及用于治疗诸如癌症之类病症的免疫刺激性球形核酸(IS-SNA)，其包含具有寡核苷酸壳核和检查点抑制剂，该寡核苷酸壳包含位于核外部的免疫刺激性寡核苷酸。可将该IS-SNA与检查点抑制剂一起给药。本发明的IS-SNA在通过静脉途径给药时能够有效递送免疫刺激性寡核苷酸到肿瘤。本发明发现不但免疫刺激性寡核苷酸能够通过静脉途径被递送给受试者并产生免疫应答，而且静脉内给药的寡核苷酸显示出强抗肿瘤活性，此外IS-SNA的皮下和瘤内递送显示出同样强力的抗肿瘤活性，另外IS-SNA和检查点抑制剂体内联合给药产生了协同治疗反应。应。应。


技术研发人员：S
受保护的技术使用者：埃克西奎雷运营公司
技术研发日：2017.05.05
技术公布日：2023/10/15