一种从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法与流程

一种从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法
1.本技术是申请日为2020年11月20日，申请号为cn202011310307.3，发明名称为“一种从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法”的申请的分案申请。
技术领域
2.本文涉及但不限于一种透明质酸的分离纯化的方法，尤其涉及但不限于一种从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法。


背景技术：

3.透明质酸(hyhaluronic acid,简称ha)又名玻尿酸，是一种酸性粘多糖，1934年美国哥伦比亚大学眼科教授meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。
4.目前，透明质酸有两种生产方法，一种是利用天然原料，即选用动物组织，用丙酮、乙醇、氯仿等有机溶剂提取精制而得。该方法提取率仅为1％左右，因而不仅环境污染严重，而且成产成本较高。另一种是生物发酵法制备。生物发酵法不受原料资源限制等优点，目前已得到广泛应用，已取代从动物组织中分离提取透明质酸的方法。生物发酵法所得透明质酸，已经广泛应用于医药、化妆品、保健食品、食品等领域。
5.由于透明质酸分子量大、粘度大，发酵液中的菌体残渣、蛋白质、杂多糖、色素等不易去除，目前发酵液中分离纯化透明质酸基本采用3倍以上的多次乙醇沉淀、硅藻土过滤的方法，该方法因使用大量的乙醇造成环境污染，并在产品中有乙醇残留，乙醇回收困难等问题，已不符合当前绿色生态环保的产业发展需求。


技术实现要素：

6.以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制本技术的保护范围。
7.本技术提供了一种不用乙醇等有机溶剂、适合工业放大的透明质酸的提取纯化方法，由于没有有机溶剂参与，更容易进行工业放大生产，发酵液用量可以为200吨。本技术使用膜分级纯化的方法是通过发酵液预处理，改变透明质酸在发酵液中的分散状态，进而通过陶瓷膜或离心分离实现菌体固液分离、不同孔径的超滤膜对不同分子量的透明质酸进行分级浓缩，再经过离子交换树脂去除杂蛋白、杂多糖等，不使用乙醇等有机溶剂，有较高的产业化应用价值。
8.本技术提供了一种从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法，包括以下步骤：
9.(1)对所述微生物发酵液调节ph值至酸性或中性并加入盐，形成悬浮液；
10.(2)将悬浮液固液分离后，使用微滤膜、超滤膜和纳滤膜进行浓缩，得到透明质酸浓缩液；
11.(3)将所述透明质酸浓缩液通过离子交换树脂。可选地，所述分离纯化透明质酸的
方法由以上步骤组成。
12.在一种实施方式中，所述微生物选自马疫链球菌、兽疫链球菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸乳球菌和大肠杆菌中的任意一种或更多种。
13.在一种实施方式中，步骤(2)所述固液分离为将所述悬浮液放入离心机中离心分离，获取上清液；所述上清液使用微滤膜进行过滤，获得浓缩液；
14.在一种实施方式中，所述微滤膜为陶瓷膜；
15.在一种实施方式中，所述离心机为管式离心机或蝶式离心机，所述离心分离的离心转速为4000r/min至30000r/min；
16.在一种实施方式中，所述微滤膜过滤后的浓缩液的电导率为1ms/cm至7ms/cm。
17.在一种实施方式中，调节后的所述微生物发酵液的ph值为2至7，可选地，调节后的所述发酵液的ph值为3至5；
18.在一种实施方式中，调节所述发酵液ph值使用的酸选自盐酸、硫酸、硝酸、磷酸和醋酸中的任意一种或更多种；
19.在一种实施方式中，所述酸的浓度为0.1-6n，优选地，所述酸的浓度为0.5n。
20.在一种实施方式中，所述盐的加入量使得所述微生物发酵液的电导率为75ms/cm至350ms/cm；
21.在一种实施方式中，所述盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锌、氯化镁、碳酸氢钠、硫酸钠、硫酸镁和葡萄糖酸锌中的任意一种或更多种。
22.在一种实施方式中，所述微滤膜为截留分子量在100000da至1000000da的微滤膜。
23.在一种实施方式中，所述超滤膜为截留分子量在5000da至100000da。
24.在一种实施方式中，所述微滤膜分级设置拦截不同分子量的所述透明质酸，所述微滤膜包括截留分子量在1000000da以上的微滤膜a、截留分子量在500000da至1000000da的微滤膜b、截留分子量在200000da至500000da的微滤膜c、截留分子量在100000da至200000da的微滤膜d；
25.在一种实施方式中，所述超滤膜分级设置拦截不同分子量的所述透明质酸，所述超滤膜包括截留分子量在50000da至100000da的超滤膜a、截留分子量在10000da至50000da的超滤膜b、截留分子量在5000da至20000da的超滤膜c；
26.在一种实施方式中，所述纳滤膜截留分子量在300da至5000da；
27.在一种实施方式中，所述微滤膜或超滤膜过滤后的浓缩液经纯水水洗至电导率为1ms/cm至7ms/cm。
28.在一种实施方式中，所述离子交换树脂包括阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。
29.在一种实施方式中，所述透明质酸浓缩液依次经过阳离子交换树脂和阴离子交换树脂；
30.在一种实施方式中，所述阳离子交换树脂选自d001大孔阳离子交换树脂、d61大孔强阳离子交换树脂、d62大孔强阳离子交换树脂、d72大孔强阳离子交换树脂、d113弱阳离子交换树脂、d85弱阳离子交换树脂中的任意一种或更多种；
31.在一种实施方式中，所述阴离子交换树脂选自d280强阴离子交换树脂、d301大孔弱阴离子交换树脂、d311大孔弱阴离子交换树脂、d201大孔强阴离子交换脂中的任意一种或更多种。
32.在一种实施方式中，所述阳离子交换树脂的洗脱液为纯水，所述阴离子交换树脂的洗脱液为ph值2-4的水。
33.在一种实施方式中，以设备和离子交换树脂可承受的最快速度进行洗脱。
34.在一种实施方式中，洗脱后得到的透明质酸液体进行干燥，所述干燥的方法为顶空脉冲喷雾干燥、真空干燥或冷冻干燥的方法，可选顶空脉冲喷雾干燥，即可得透明质酸粉末；顶空脉冲喷雾干燥方法，可选进风温度160℃至200℃、出风温度60℃至100℃、每间隔20分钟喷纯化水50升，即可得透明质酸干燥粉。
35.本技术方法工艺简单，在有效除渣、除杂蛋白、杂多糖、脱色素的同时，完全不使用乙醇等有机溶剂参与，解决了透明质酸行业大量使用乙醇等有机溶剂的安全问题、回收问题和环境保护等问题。本技术的提纯方法制得产品与现行业常规有机溶剂提取方法的效果持平，或优于现行业常规提取方法。
36.本技术的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本技术而了解。本技术的其他优点可通过在说明书中所描述的方案来发明实现和获得。
具体实施方式
37.为使本技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文对本技术的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
38.本技术实施例中提供了一种从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法，包括以下步骤：
39.(1)对所述微生物发酵液调节ph值至酸性或中性并加入盐，形成悬浮液；
40.(2)将悬浮液固液分离后，使用微滤膜、超滤膜和纳滤膜进行浓缩，得到透明质酸浓缩液；
41.(3)将所述透明质酸浓缩液通过离子交换树脂。可选地，所述分离纯化透明质酸的方法由以上步骤组成。
42.在本技术实施例中，所述微生物选自马疫链球菌、兽疫链球菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸乳球菌和大肠杆菌中的任意一种或更多种。
43.在本技术实施例中，步骤(2)所述固液分离为将所述悬浮液放入离心机中离心分离，获取上清液；所述上清液使用微滤膜进行过滤，获得浓缩液；
44.在本技术实施例中，所述微滤膜为陶瓷膜；
45.在本技术实施例中，所述离心机为管式离心机或蝶式离心机，所述离心分离的离心转速为4000r/min至30000r/min；
46.在本技术实施例中，所述微滤膜过滤后的浓缩液的电导率为1ms/cm至7ms/cm。
47.在本技术实施例中，调节后的所述微生物发酵液的ph值为2至7，可选地，调节后的所述发酵液的ph值为3至5；
48.在本技术实施例中，调节所述发酵液ph值使用的酸选自盐酸、硫酸、硝酸、磷酸和醋酸中的任意一种或更多种；
49.在本技术实施例中，所述酸的浓度为0.1-6n，优选地，所述酸的浓度为0.5n。
50.在本技术实施例中，所述盐的加入量使得所述微生物发酵液的电导率为75ms/cm至350ms/cm；
51.在本技术实施例中，所述盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锌、氯化镁、碳酸氢钠、硫酸钠、硫酸镁和葡萄糖酸锌中的任意一种或更多种。
52.在本技术实施例中，所述微滤膜为截留分子量在100000da至1000000da的微滤膜。
53.在本技术实施例中，所述超滤膜为截留分子量在5000da至50000da的超滤膜。
54.在本技术实施例中，所述膜分级设置拦截不同分子量的所述透明质酸，所述微滤膜包括截留分子量在1000000da以上的微滤膜a、截留分子量在500000da至1000000da的微滤膜b、截留分子量在200000da至500000da的微滤膜c、截留分子量在100000da至200000da的微滤膜d；
55.超滤膜包括截留分子量在50000da至100000da以上的超滤膜a、截留分子量在10000da至50000da的超滤膜b、截留分子量在5000da至20000da的超滤膜c；也可以设置不同截留分子量的微滤膜、超滤膜、纳滤膜组合。
56.在本技术实施例中，所述纳滤膜截留分子量在300da至5000da；
57.在本技术实施例中，所述微滤膜或超滤膜过滤后的浓缩液经纯水水洗至电导率为1ms/cm至7ms/cm。
58.在本技术实施例中，所述离子交换树脂包括阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。
59.在本技术实施例中，所述透明质酸浓缩液依次经过阳离子交换树脂和阴离子交换树脂；
60.在本技术实施例中，所述阳离子交换树脂选自d001大孔阳离子交换树脂、d61大孔强阳离子交换树脂、d62大孔强阳离子交换树脂、d72大孔强阳离子交换树脂、d113弱阳离子交换树脂、d85弱阳离子交换树脂中的任意一种或更多种；
61.在本技术实施例中，所述阴离子交换树脂选自d280强阴离子交换树脂、d301大孔弱阴离子交换树脂、d311大孔弱阴离子交换树脂、d201大孔强阴离子交换脂中的任意一种或更多种。
62.在本技术实施例中，所述阳离子交换树脂的洗脱液为纯水，所述阴离子交换树脂的洗脱液为ph值2-4的水。
63.实施例1
64.实施例1中使用的微生物发酵液的组成如下：菌种：马疫链球菌兽疫亚种(streptococcus equi subsp.zooepidemicus)sg1928，菌种保藏号cgmccno.20992保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物发酵液中添加葡萄糖15％、胰蛋白胨4％、酵母粉4％、磷酸氢二钾0.3％、磷酸二氢钾0.7％、硫酸镁0.2％、硫酸锰0.025％、谷氨酸钠0.05％，所述微生物发酵液的发酵条件为发酵温度30-35℃，ph6.0-8.0，do40-100％，得到透明质酸发酵液。
65.1)取透明质酸发酵液500l，使用浓度为0.5n的盐酸调节ph值至3.0，加入0.5wt.％的氯化钠，充分搅拌均匀，使透明质酸发酵液的电导率为75ms/cm；
66.2)用转速为6000r/min的蝶式离心机进行固液分离，获得上清液；将所述上清液用陶瓷膜进行透析并浓缩水洗，具体操作如下：
67.所述上清液用购买自厦门三达膜科技有限公司t19/60/400牌号的陶瓷膜a进行浓
缩、水洗，至电导率达到2ms/cm，收集浓缩液a备用；
68.将微滤膜a的透析液用购买自厦门三达膜科技有限公t19/60/400牌号的陶瓷膜b进行浓缩、水洗，至电导率达到2ms/cm，收集浓缩液b备用；
69.将微滤膜b的透析液用购买自厦门三达膜科技有限公t19/60/400牌号的陶瓷膜c进行浓缩、水洗，至电导率达到2ms/cm，收集浓缩液c备用；
70.将微滤膜c的透析液用购买自厦门三达膜科技有限公t19/60/400牌号的陶瓷膜d进行浓缩、水洗，至电导率达到2ms/cm，收集浓缩液d备用；
71.3)将所述陶瓷膜d的透析液用购买自ge公司，8040牌号的超滤膜a进行浓缩、水洗，至电导率达到2ms/cm，收集浓缩液1备用；
72.4)步骤3)得到的透析液用购买自ge公司，8040牌号的超滤膜b进行浓缩、水洗，至电导率达到2ms/cm，收集浓缩液2备用；
73.5)步骤4)得到的透析液用购自ge公司，8040牌号的超滤膜c进行浓缩、水洗，至电导率达到2ms/cm，收集浓缩液3备用；
74.6)步骤5)得到的透析液用购自ge公司，8040牌号的纳滤膜进行浓缩、水洗，至电导率达到2ms/cm，收集浓缩液4备用；
75.7)取浓缩液a、浓缩液b、浓缩液c、浓缩液d、浓缩液1、浓缩液2、浓缩液3和浓缩液4，分别通过d001大孔阳离子交换树脂上样(层析柱：树脂体积：700l；洗脱液：纯水；洗脱流速：600l/h；洗脱时间：2h；上样操作：取上述浓缩液1至5用进样泵抽进层析柱进行分离)，纯水洗脱，收集含有透明质酸等物质的洗脱液，备用；
76.8)步骤7)所得透明质酸液体(洗脱液)，通过d280强阴离子交换树脂上样(层析柱：树脂体积：700l；洗脱液：ph为2.5的纯水；洗脱流速：600l/h；洗脱时间：6h；上样操作：取阳离子洗脱液用进样泵抽进层析柱进行分离)，杂多糖、色素不挂柱直接流出柱子，再用ph为2.5的纯水洗脱，洗下透明质酸，收集备用；
77.9)步骤8)所得透明质酸液体，喷雾干燥(喷干负压100-110pa，入口温度185℃，塔内温度135℃，出口温度85℃)得透明质酸粉。
78.实施例2
79.与实施例1的不同之处在于，发酵液体积为1000l并调节ph值5.0。
80.实施例3
81.与实施例1的不同之处在于，发酵液调节ph值6.0，阴离子交换树脂为d301大孔弱阴离子交换树脂。
82.实施例4
83.与实施例1的不同之处在于，发酵液用氯化钠调节电导率为100ms/cm。
84.实施例5
85.与实施例1的不同之处在于，发酵液用氯化钠调节电导率为90ms/cm，阳离子交换树脂为d72大孔强阳离子交换树脂。
86.实施例6
87.与实施例5的不同之处在于，发酵液体积为4000l，阴离子交换树脂的洗脱液ph值为2.0，阴离子交换树脂为d301大孔弱阴离子交换树脂。
88.实施例7
89.与实施例5的不同之处在于，阴离子交换树脂的洗脱液ph值为3.0，阴离子交换树脂为d301大孔弱阴离子交换树脂。
90.实施例8
91.与实施例5的不同之处在于，发酵液体积为2000l，阴离子交换树脂的洗脱液ph值为4.0。
92.实施例9
93.与实施例3的不同之处在于，发酵液不调ph，维持下罐ph值7.0。
94.对比例1
95.与实施例1不同之处在于，发酵液预处理时不加入氯化钠，结果则是所有透明质酸、杂蛋白及其他杂质都被拦截，无法进行下一步处理
96.各实施例透明质酸分离纯化结果如表1：
97.表中：透明质酸平均分子量(da)为经过该滤膜后获得的浓缩液中的透明质酸的平均分子量；
98.蛋白质含量(wt.％)为经过该滤膜后获得的浓缩液中的蛋白与浓缩液重量比；
99.透明质酸含量(wt.％)为经过该滤膜后获得的浓缩液中的透明质酸与浓缩液的重量比；
100.收率(％)为经过该滤膜处理后得到的特定分子量段的透明质酸，与上一级膜的透析液(或离心机固液分离后获得的上清液)中相应分子量段的透明质酸的重量比。
101.表1：透明质酸分离纯化结果统计表
102.103.[0104][0105]
表2为本技术实施例1制备的透明质酸和申请人使用醇沉工艺制备的透明质酸取样对比所述样品的平均分子量为80000da，从表2中可以看出，本技术提供的制备方法制得的透明质酸在纯度、杂质含量等方面效果显著优于普通醇沉法制备得到的透明质酸。
[0106]
表2：透明质酸取样对比
[0107][0108][0109]
虽然本技术所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本技术而采用的实施方式，并非用以限定本技术。任何本技术所属领域内的技术人员，在不脱离本技术所揭
露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本技术的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。

技术特征：
1.一种从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法，其中，所述从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法包括以下步骤：(1)对所述微生物发酵液调节ph值至酸性或中性并加入盐，形成悬浮液；调节后的所述微生物发酵液的ph值为2至7；(2)将悬浮液固液分离后，使用微滤膜、超滤膜和纳滤膜进行浓缩，得到透明质酸浓缩液；(3)将所述透明质酸浓缩液通过离子交换树脂；所述微滤膜包括截留分子量在1000000da以上的微滤膜a、截留分子量在500000da至1000000da的微滤膜b、截留分子量在200000da至500000da的微滤膜c、截留分子量在100000da至200000da的微滤膜d；所述超滤膜包括截留分子量在50000da至100000da的超滤膜a、截留分子量在10000da至50000da的超滤膜b、截留分子量在5000da至20000da的超滤膜c；所述纳滤膜截留分子量在300da至5000da；所述微滤膜或超滤膜过滤后的浓缩液经过纯水水洗至电导率为1ms/cm至7ms/cm。2.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法，其中，所述微生物选自马疫链球菌、兽疫链球菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸乳球菌和大肠杆菌中的任意一种或更多种。3.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法，其中，步骤(2)所述固液分离为将所述悬浮液放入离心机中离心分离，获取上清液，所述上清液使用微滤膜进行过滤，获得浓缩液；可选地，所述微滤膜为陶瓷膜；可选地，所述离心分离的离心转速为4000r/min至30000r/min；可选地，所述微滤膜过滤后的浓缩液的电导率为1ms/cm至7ms/cm。4.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法，其中，调节后的所述发酵液的ph值为3至5；可选地，调节所述发酵液ph值使用的酸选自盐酸、硫酸、硝酸、磷酸和醋酸中的任意一种或更多种；可选地，所述酸的浓度为0.1-6n，优选地，所述酸的浓度为0.5n。5.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法，其中，所述盐的加入量使得所述微生物发酵液的电导率为75ms/cm至350ms/cm。6.根据权利要求5所述的从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法，其中，所述盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锌、氯化镁、碳酸氢钠、硫酸钠、硫酸镁和葡萄糖酸锌中的任意一种或更多种。7.根据权利要求1至6中任一项所述的从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法，其中，所述离子交换树脂包括阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。8.根据权利要求7所述的从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法，其中，所述透明质酸浓缩液依次经过阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。9.根据权利要求8所述的从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法，其中，所述阳离子交换树脂选自d001大孔阳离子交换树脂、d61大孔强阳离子交换树脂、d62大孔强阳离子
交换树脂、d72大孔强阳离子交换树脂、d113弱阳离子交换树脂、d85弱阳离子交换树脂中的任意一种或更多种；可选地，所述阴离子交换树脂选自d280强阴离子交换树脂、d301大孔弱阴离子交换树脂、d311大孔弱阴离子交换树脂、d201大孔强阴离子交换脂中的任意一种或更多种。10.根据权利要求9所述的从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法，其中，所述阳离子交换树脂的洗脱液为纯水，所述阴离子交换树脂的洗脱液为ph值2-4的水。

技术总结
一种从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法，包括以下步骤：(1)对所述微生物发酵液调节pH值至酸性或中性并加入盐，形成悬浮液；(2)将悬浮液固液分离后，使用微滤膜、超滤膜和纳滤膜进行浓缩，得到透明质酸浓缩液；(3)将所述透明质酸浓缩液通过离子交换树脂。本申请方法工艺简单，在有效除渣、除杂蛋白、杂多糖、脱色素的同时，完全不使用乙醇等有机溶剂参与，解决了透明质酸行业大量使用乙醇等有机溶剂的安全问题、回收问题和环境保护等问题。回收问题和环境保护等问题。


技术研发人员：陈杰鹏 段丽丽 陈煜藩 陈鸿锐 胡留松 洪琳 黄晓莹 叶红林 纪烨瑜 蔡春丽
受保护的技术使用者：广东双骏生物科技有限公司
技术研发日：2020.11.20
技术公布日：2023/10/15