一株对幽门螺旋杆菌有拮抗作用的鼠李糖乳酪杆菌的制作方法

1.本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体为一株对幽门螺旋杆菌具有拮抗作用的鼠李糖乳酪杆菌。


背景技术：

2.全球自然人群中幽门螺杆菌(helicobacter pylori，hp)感染率已超过50％，在发达国家感染率约为30％，在发展中国家则可高达80％，我国的hp感染率为40％～90％，平均为59％。幽门螺旋杆菌是一种螺旋形弯曲形状，具有鞭毛、伴有动力的革兰阴性细菌，主要通过鞭毛定植于胃黏膜，偶尔也定植于耳鼻喉、口腔、肠、胆囊等部位，被认为是消化性溃疡、慢性胃炎的主要致病菌，同时被证实是胃腺癌和胃黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤的高危因素，还与胃食管反流病、功能性消化不良等胃肠疾病有关，who和国际抗癌联盟将其列为i类致癌物。目前治疗hp引起的疾病主要有标准三联法和标准四联法两种，常用的是ppi加两种其他抗生素混合治疗。虽然治愈率提高，但是，这种治疗方案会造成机体抗生素的耐药性、而且长期不合理应用抗生素可引起胃肠功能紊乱及胃肠道菌群失调等不良反应，因此临床上建议另寻一种更为合理有效的治疗方案。。
3.益生菌属于活的微生物，涵盖了合成的抗菌物质，如细菌素、过氧化氢等，和调节宿主的免疫反应及病原体竞争微生物的附着点。常见的益生菌包括：
①
乳酸杆菌属：瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、约氏乳杆菌、鼠李糖乳酪杆菌等；
②
双歧杆菌属：长双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌等；
③
链球菌属：嗜热链球菌、粪链球菌、乳球菌、中介链球菌等；
④
酵母菌属等。益生菌对hp的作用机制可能包括调节肠道菌群、形成机械和化学生物屏障、形成抗炎性因子、调节免疫机制，有效抑制hp在胃黏膜上皮的生长与定植，抑制hp感染后的免疫反应与炎症，稳定胃黏膜屏障，从而保护患者胃黏膜。当前益生菌用于hp治疗的研究和文献也有不少，有研究认为益生菌制剂联合抗菌药物能有效缓解hp感染患者的临床症状，提高hp根治效果，降低药物不良反应发生率。有研究认为在hp根除率方面，发酵如益生菌制剂可使其提升5％～15％。临床常用的益生菌制剂有嗜酸乳杆菌、双歧杆菌三联活菌、枯草杆菌二联活菌、地衣芽孢杆菌等。
4.目前市场上各种益生菌制剂如丽珠肠乐、培菲康、美常安、乐腹康等广泛应用于临床，临床效果与所使用的的菌株有很大关系。目前已有的产品有如下缺点：益生菌在胃肠液的存活率低，只有很少一部分活着达到病灶，只能发挥微弱的作用；其次，益生菌对幽门螺旋杆菌的抑制率差等问题也亟待解决。因此，能否提供新的益生菌候选菌，增强它们对抗hp等胃病原体的能力就是本专利的方向。本研究中筛选出了一株对幽门螺旋杆菌具有显著抑制效果的鼠李糖乳酪杆菌，在胃酸，肠液中均有较强的存活能力，对胃上皮细胞和肠细胞都有较好的粘附能力，为发挥益生作用提供坚实的基础，会对由hp引起的胃肠疾病具有非常重要的应用价值。


技术实现要素：

5.本发明为解决现有技术问题，提供了一株对幽门螺旋杆菌具有拮抗作用的鼠李糖乳酪杆菌(lacticaseibacillus rhamnosus)。所述菌株对胃肠道环境耐受性强，能有效降解胆固醇，抗氧化效果显著，还能明显抑制幽门螺旋杆菌的生长和粘附作用，可广泛应用于功能性食品、保健品或药品中。
6.本发明一方面涉及一种鼠李糖乳酪杆菌，为鼠李糖乳酪杆菌(lacticaseibacillus rhamnosus)vhprobi v77株，已于2023年4月10日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctcc no：m2023500。
7.所述鼠李糖乳酪杆菌的16s rdna序列为seq id no:1。
8.所述鼠李糖乳酪杆菌的rapd指纹图谱如图3所示；其rep-pcr指纹图谱如图4所示；其maldi-tof-ms蛋白质指纹图谱如图5所示。
9.本发明一方面涉及所述鼠李糖乳酪杆菌在制备幽门螺旋杆菌抑制剂中的应用。
10.本发明一方面涉及所述鼠李糖乳酪杆菌在制备食品或保健品中的应用。
11.本发明一方面涉及所述鼠李糖乳酪杆菌在制备药品中的应用。
12.所述的药品具有预防或治疗由幽门螺旋杆菌引起的消化道疾病的功能。
13.本发明还涉及一种益生菌制剂，包含所述鼠李糖乳酪杆菌的活菌菌体、灭活菌体、发酵代谢产物或胞内提取物中的至少一种。
14.本发明还涉及所述益生菌制剂在制备食品或保健品中的应用。
15.本发明还涉及所述益生菌制剂在制备具有预防或治疗胃炎功能的药品中的应用。
16.本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77株具有较强的抗胃肠液消化能力，经胃液2h和肠液消化3h后菌量下降较小；在15℃和45℃均可以大量繁殖；在1％～8％盐浓度下均可生长，其最大耐受盐浓度为6％；不产生溶血素，不能溶解血细胞，对机体无毒害作用，对红霉素、四环素、氨苄青霉素等常见抗生素敏感，安全性良好。
17.所述鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77对两株不同种的幽门螺旋杆菌均具有显著的抑制作用，含活菌的发酵液对混合幽门螺旋杆菌的抑菌圈直径达到16.50
±
0.35mm，效果显著；其发酵上清液对幽门螺旋杆菌的抑制效果与添加量呈正相关，当添加量为15％时，对幽门螺旋杆菌的抑制率高达33.39％。该菌株与幽门螺旋杆菌具有较强的共凝集能力，为其在胃肠环境中与幽门螺旋杆菌共凝集和排出体外提供了必要的条件。该菌株还能显著抑制幽门螺旋杆菌对人胃腺癌细胞的粘附作用，粘附抑制率高达49.30％，取得了意料不到的技术效果。
18.所述鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77还对人胃腺癌细胞(bgc-823)和肠道上皮细胞(caco-2)有较强的粘附作用，为其在胃、肠粘膜中粘附和定植提供了有利条件。
19.所述鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77株对胆固醇的降解率达到21.7％，具有降低血清胆固醇的益生特性。该菌株还具有较强的抗氧化能力，其菌体对dpph自由基和hrs自由基，清除率分别达到18.66％和52.36％，其上清液对hrs自由基的清除率高达92.31％；其发酵上清液、菌体和胞内提取液的抗脂质过氧化抑制率分别为43.41
±
0.09％、40.01
±
0.21％和19.06
±
0.41％。
20.本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77株可广泛用于功能性食品或保健品的生产，还可用于制备具有预防或治疗由幽门螺旋杆菌引起的胃炎，胃溃疡等疾病的药品；
还可用于制备益生菌制剂，该制剂包括鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77的活菌菌体、死菌菌体、代谢产物或胞内提取物中的至少一种，可用于制备功能性食品、保健品或药品，前景广阔。
附图说明
21.图1为菌株v77的菌落图及革兰氏染色图；其中a为菌落图，b为革兰氏染色图；
22.图2为菌株v77的api试验结果；
23.图3为菌株v77的rapd指纹图谱；
24.图4为菌株v77的rep-pcr指纹图谱；
25.图5为菌株v77的maldi-tof-ms指纹图谱；
26.图6为菌株v77对幽门螺旋杆菌的抑菌圈图；
27.图7为菌株v77对人胃腺癌细胞的粘附效果图；
28.图8为菌株v77对幽门螺旋杆菌共凝集图。
具体实施方式
29.本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77符合法规要求，经多相分类学鉴定，鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77为一株新发现的菌株。本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77耐酸性强，能够显著抑制幽门螺旋杆菌的生长，对于防治幽门螺旋杆菌引起的消化道疾病具有重要的应用价值。
30.本发明所述筛选方法并不局限于实施例所述，已知的能够达到筛选目的的方法均可以，实施例的筛选说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
31.下面结合具体实施例，对本发明做进一步阐述。
32.实施例1鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77的分离筛选
33.1.1乳酸杆菌初筛
34.取1g柿饼，经无菌生理盐水冲洗后放入无菌样品袋中，用匀浆仪拍打混匀；取100μl混匀液梯度稀释，涂布于mrs琼脂培养基后于37℃培养48h，待平板长出单菌落镜检。根据镜检结果，申请人共筛选出78株潜在乳酸杆菌，分别命名为v1，v2，
……
，v78。
35.1.2乳酸杆菌复筛
36.配置1l的mrs液体培养基(纯化水1000ml，蛋白胨10g，牛肉浸取物10g，酵母提取物5.0g,乙酸钠5g，葡萄糖5g，磷酸二氢钾2g，吐温80 1.0ml，柠檬酸二胺2.0g,碳酸钙20g，七水硫酸镁0.58g，七水硫酸锰0.25g，调ph 6.2-6.5)，115℃高压灭菌30min，待培养基冷却后加入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h制成耐酸性培养基。将初筛获得的78株乳酸杆菌分别按6％接种量接种于上述耐酸性培养基中，37℃静置培养2h，取发酵液进行菌量计数。
37.结果显示，本发明初筛获得的乳酸杆菌中，v77菌株的耐酸能力最强，经耐酸性培养基复筛后活菌量最多，对数值高达7.78log cfu/ml，取得了意料不到的技术效果。
38.实施例2v77菌株的鉴定
39.本实施例中接种液的准备如下：取适量新鲜v77菌液，5000rpm/min离心5min，用pbs缓冲液洗2次，再用同体积pbs缓冲液重菌体，后稀释50倍，作为接种液。
40.2.1菌落、菌体形态鉴定
41.将v77菌株接种于mrs琼脂培养基上，37℃培养48h后，可见v77单菌落呈乳白色，菌落直径在1.5-2mm左右，表面湿润。v77菌落图片如图1(a)所示。
42.v77菌株的菌落涂片如图1(b)所示：革兰氏染色呈阳性，显微镜下呈短杆状，二端呈圆形。
43.2.2生理生化鉴定
44.2.2.1碳源代谢试验
45.利用api 50chl试剂验证菌株v77的碳源代谢实验。实验方法及结果分析具体参见api 50chl试剂盒说明书。结果显示菌株v77与鼠李糖乳酪杆菌的id值为99.9％，api试验结果见图2。结果可初步鉴定该菌为鼠李糖乳酪杆菌(lacticaseibacillus rhamnosus)。
46.2.2.2葡萄糖产酸产气试验
47.培养基配方如下：蛋白胨0.5g；酵母提取物0.3g；吐温80 0.1ml；盐溶液a80.5ml；盐溶液b 0.5ml；乙酸钠0.5g；葡萄糖2.5g；2％溴甲酚绿(w/v)0.05ml；蒸馏水100ml；
48.ph6.8～7.0。将配制好的培养基分装至含有倒置小试管的大试管中，3ml/管，121℃，高压灭菌15min。
49.盐溶液a9成分：kh2po
4 10g、k2hpo
4 1.0g，溶于蒸馏水，定容至100ml。
50.盐溶液b成分：mgso4·
7h2o 11.5g、mnso4·
2h2o 2.4g、feso4·
7h2o 0.68g，溶于蒸馏水，定容至100ml。
51.在无菌条件下，将接种液按10％的接种量接种培养基，不接菌的培养基作为对照，然后用2ml无菌液体石蜡封住顶部，置于37℃培养24h，观察培养基颜色有无变化。
52.结果显示：37℃培养24h后，培养基由绿色变为黄色，小倒管内无气体，说明v77菌株发酵葡萄糖产酸，不产气。
53.2.2.3盐度耐受性试验
54.无菌条件下，向96孔板中分别加入190μl盐浓度为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％的mrs液体培养基，每个盐浓度做3个平行，然后再加入10μl接种液，不接菌的孔作为对照。每孔加入50μl高压灭菌过的石蜡油以防止培养过程中水分蒸发。置于37℃恒温培养36h，观察培养基是否变浑浊。结果显示，v77菌株在1％～8％盐浓度下均可生长，其最大耐受盐浓度为6％。
55.2.2.4过氧化氢酶实验
56.取新鲜菌液，滴一滴于干净的载玻片上，然后在其上滴加一滴3％过氧化氢溶液，观察到v77菌株不产生气泡，是阴性反应。
57.2.2.5温度耐受性试验
58.将接种液按10％的接种量接种到10ml mrs液体培养基中，不接菌的5ml mrs液体培养基作为对照，分别置于15℃恒温培养箱培养7天，45℃恒温培养箱培养2天，观察菌液是否变浑浊。结果显示，v77菌株在15℃和45℃均可以大量繁殖。
59.2.3分子生物学鉴定
60.2.3.1 16s rdna基因序列分析
61.1、基因组dna提取
62.参照天根细菌基因组dna提取试剂盒(目录号：dp302)操作。
63.2、16s rdna基因扩增
64.(1)引物序列
65.27f：agagtttgatcctggctca；
66.1492r：ggttaccttgttacgactt。
67.(2)反应体系(50μl)
68.表1.16s rdna pcr扩增体系
[0069][0070]
(3)电泳验证pcr产物核酸电泳结果为1500bp左右时符合要求。
[0071]
(4)pcr产物测序
[0072]
测序结果显示，v77菌株的16s rdna序列为seq id no:1。将该序列在ncbi数据库中进行比对，初步确定v77菌株为鼠李糖乳酪杆菌(lacticaseibacillus rhamnosus)。seq id no:1序列如下：
[0073]
cggcttcgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgg
[0074]
gaacgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttcgtgtaggc
[0075]
gagttgcagcctacagtccgaactgagaatggctttaagagattagcttgacctcgcggt
[0076]
ctcgcaactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatga
[0077]
tgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcttactagagtgccca
[0078]
actaaatgctggcaactagtcataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatct
[0079]
cacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcattttgcccccgaaggggaaac
[0080]
ctgatctctcaggtgatcaaaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcga
[0081]
attaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaacctt
[0082]
gcggtcgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcggcactgaagggcggaa
[0083]
accctccaacacctagcattcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgtt
[0084]
cgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccact
[0085]
ggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctg
[0086]
cactcaagtttcccagtttccgatgcacttcctcggttaagccgagggctttcacatcag
[0087]
acttaaaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggataacgcttgccacct
[0088]
acgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttggataccgtcac
[0089]
gccgacaacagttactctgccgaccattcttctccaacaacagagttttacgacccgaaa
[0090]
gccttcttcactcacgcggcgttgctccatcagacttgcgtccattgtggaagattcccta
[0091]
ctgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgatcaacctct
[0092]
cagttcggctacgtatcattgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatacgccg
[0093]
cgggtccatccaaaagcgatagcttacgccatctttcagccaagaaccatgcggttcttg
[0094]
gatttatgcggtattagcatctgtttccaaatgttatcccccacttaagggcaggttaccca
[0095]
cgtgttactcacccgtccgccactcgttcaaaattaaatcaagatgcaagcacctttc。
[0096]
3.2rapd和rep-pcr指纹图谱鉴定
[0097]
1、rapd指纹图谱鉴定
[0098]
(1)引物序列：m13(5
’‑
gagggtggcggttct-3’)；
[0099]
(2)rapd反应体系
[0100]
表2.rapd反应体系
[0101][0102]
(3)电泳
[0103]
制备1.5％的琼脂糖凝胶板，dl2000 dna marker作为结果对照，稳压100v电泳80min，最后利用凝胶成像系统检测电泳图。v77菌株的rapd指纹图谱如3所示。
[0104]
2、rep-pcr指纹图谱
[0105]
(1)rep-pcr引物
[0106]
ctacggcaaggcgacgctgacg。
[0107]
(2)rep-pcr的反应体系
[0108]
表3.rep-pcr的反应体系
[0109][0110]
(3)电泳
[0111]
dl2000 dna marker作为结果对照。电压100v，电泳时间80min检测扩增结果。v77菌株的的rep-pcr指纹图谱如图4所示。
[0112]
2.3.3maldi-tof-ms检测菌株核糖体蛋白表达
[0113]
将v77菌株接种于新鲜mrs液体培养基中，于37℃培养24h，得v77新鲜菌液；将新鲜菌液用无菌生理盐水洗涤3次，晾干表面水分。然后取少量新鲜菌体以薄膜的形式均匀涂布于靶板上，加1μl裂解液覆盖样品，晾干后，再加1μl基质溶液覆盖样品，晾干后，将样品靶放入质谱仪进行鉴定。菌株v77主要的离子峰为：m/z 4688.509、5349.062、5887.118、7573.921、9374.886等，鉴定结果如图5所示。
[0114]
综上，综合v77菌株的菌落形态、生理生化特性结果以及分子生物学的鉴定结果，可以得出结论，v77菌株为一株新的鼠李糖乳酪杆菌，将其命名为鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77(lacticaseibacillus rhamnosus vhprobi v77)。
[0115]
实施例3鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77对胃肠液耐受性分析
[0116]
3.1人工胃液消化
[0117]
将9ml人工胃液置于37℃水浴摇床1h，以模拟人体温度。取1ml鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77新鲜菌液(108cfu/ml左右)，加入到9ml人工胃液中，置于37℃水浴摇床(200rpm)2h。分别于接种后0h和2h时取样1ml检测活菌量。
[0118]
3.2人工肠液消化
[0119]
将24ml人工肠液置于37℃水浴摇床1h，以模拟人体温度。取1ml上述消化2h后的人工胃液，加入到24ml人工肠液中，置于37℃水浴摇床(200rpm)3h。于3h时取样1ml检测活菌量。根据测定前后胃肠液活菌存活量，推测鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77的耐胃肠液消化能力。
[0120]
结果显示，鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77经胃液消化2小时，菌量仅下降了0.07log cfu/ml，经肠液消化3小时后，菌量仅下降了2.12log cfu/ml。从而说明，本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77对胃肠液具有很强的耐受性。
[0121]
实施例4鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77溶血性及抗生素耐受性实验
[0122]
鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77菌悬液制备：
[0123]
挑取纯化好的鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77菌落接种于新鲜mrs液体培养基中，于37℃培养24h；再按1％(v/v)的接种量接至mrs液体培养基中，于37℃继续培养24～48h；取
1ml鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77新鲜菌液，5000rpm离心5min，分别收集发酵上清液和菌体；将菌体用ph7.4的pbs缓冲溶液冲洗2次，再用pbs缓冲溶液调节菌的浓度至5
×
107cfu/ml(od600吸光度值约为0.4)，得菌悬液。
[0124]
tbs基础培养基：胰蛋白胨17.0g，大豆蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，磷酸二氢钾(无水)2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000.0ml。
[0125]
4.1溶血性实验
[0126]
称取tbs基础培养基的各种组分，溶解，121℃高压灭菌15min，等培养基冷却到50℃的时候加入5％的无菌脱纤维绵羊血，混匀，倒平板。将测试菌株划线接种于准备好的血细胞平板，37℃培养箱培养，24～48h观察测试菌是否有溶血现象。
[0127]
结果显示：鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77能生长，血细胞平板没有变化，说明鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77不产生溶血素，不能够溶解血细胞。
[0128]
4.2抗生素耐受性实验
[0129]
抗生素配制：氨苄青霉素、红霉素、庆大霉素、链霉素、四环素均配制成2048μg/ml的贮存液，-20℃保存备用。使用时将贮存液用mrs液体培养基进行2倍系列梯度稀释成使用液，梯度稀释浓度为1～1024μg/ml共11个梯度。
[0130]
微量肉汤稀释法测定抗生素对鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77的最小抑菌浓度mic值。
[0131]
(1)96孔板第1列次加入不含抗生素的mrs液体培养基，作为阴性对照，向第2～12列依次加入190μl含不同浓度抗生素的mrs液体培养基，然后分别接种10μl上述菌悬液，做3个平行孔，并以1个孔不加菌液作为空白。
[0132]
(2)加入50μl石蜡油覆盖防止水分蒸发。
[0133]
(3)将96孔板于37℃培养24h后取出，测定od
600
值，用24h的结果统计抗生素对菌株的mic值，具体结果见表4。
[0134]
表4鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77的抗生素mic值
[0135][0136][0137]
mic单位μg/ml。
[0138]
从表5的结果可以看出，本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77对四环素、氨苄青霉素等常见抗生素敏感，生物安全性良好。
[0139]
实施例5鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77对幽门螺旋杆菌的抑菌效果
[0140]
5.1致病菌培养：
[0141]
取冷冻保藏的甘油管(幽门螺旋杆菌atcc353909/atcc354364)，涂布至哥伦比亚血琼脂培养基(哥伦比亚血琼脂高压灭菌后，冷至50℃左右时，加入10％无菌脱纤维羊血，冷至45～50℃时倾入无菌平皿，4℃密封保存)，置于37℃、10％co2条件下，培养72h；无菌条件下刮取菌泥至脑心浸液液体培养基(脑心浸液肉汤，121℃高压灭菌15分钟，冷至50℃左
右时，加入10％胎牛血清混匀，冷却至室温)中，在微氧条件下(氧气浓度5％、二氧化碳浓度10％、氮气浓度85％的环境，该％为体积％)，37℃下培养24h，取5ml菌液，5000r/min离心5min，用生理盐水(0.8％，w/v)重悬菌体，将菌液浓度调整至约106cfu/ml。
[0142]
5.2抑菌圈试验：
[0143]
采用牛津杯双层平板法进行。
[0144]
在洁净工作台中，取无菌平板，将营养琼脂灭菌后倒入平板中，铺满平板作为下层培养基。待琼脂凝固后，将10ml哥伦比亚血琼脂培养基均匀铺在上层，作为上层培养基。待上层培养基凝固后，吸取幽门螺旋杆菌菌液0.2ml于固体培养基平板上，涂布均匀。放置1h待表面的菌液固定在平板的表面后打孔，孔的直径8mm，孔深3mm，将v77(108cfu/ml左右)加入0.1ml无菌水中，然后注入孔内，于37℃培养8h观察结果，测定抑菌圈直径。
[0145]
结果如图6所示，经测量，鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77对幽门螺旋杆菌的抑菌圈直径达到16.50
±
0.30mm，从而说明该菌株对幽门螺旋杆菌具有显著的抑制作用，取得了意料不到的技术效果。
[0146]
5.3生长抑制实验：
[0147]
(1)实验组：将幽门螺旋杆菌新鲜菌液按1％的体积比分别接种至添加了2.5％(v/v)、5％(v/v)、10％(v/v)实施例4所述鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77发酵上清液的脑心浸液液体培养基中；
[0148]
(2)对照组：将幽门螺旋杆菌新鲜菌液按1％的体积比接种至脑心浸液液体培养基。
[0149]
37℃、10％co2条件下，培养24h；在600nm波长下分别测定培养液的od值。以对照组培养液的od
600
值计100％，计算鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77无细胞发酵上清液对幽门螺旋杆菌的生长抑制率。具体结果见表5。
[0150]
生长抑制率(％)＝(对照组od
600
－实验组od
600
)/对照组od
600
×
100％。
[0151]
表5.鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77发酵上清液对幽门螺旋杆菌的抑制效果
[0152][0153]
从表5的数据可知，鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77无细胞发酵上清液能显著抑制幽门螺旋杆菌的生长，且随着发酵上清液添加量的增加，其对幽门螺旋杆菌的抑制效果也不断增强，当添加量为15％时，对幽门螺旋杆菌的抑制率高达33.39％，取得了预料不到的技术效果。
[0154]
实施例6鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77细胞毒性测试
[0155]
将实施例4所述鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77菌悬液于70℃水浴中灭活20分钟，备用。
[0156]
人胃腺癌细胞(bgc-823)细胞的培养：从液氮罐中取出人胃腺癌细胞(bgc-823)，进行复苏、传代培养，稀释细胞。将人胃腺癌细胞(bgc-823)细胞接种于内置细胞爬片的含
10％胎牛血清细胞dmem培养液的六孔培养板中，每个孔的细胞铺板个数约为2
×
106cells，将六孔板置于二氧化碳培养箱中24小时。
[0157]
细胞毒性试验：复苏人胃腺癌细胞bgc-823，接种至含10％小牛血清细胞培养液的24孔培养板中，接种密度为2
×
105cells/孔，细胞培养24h。将灭活后的鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77按moi(multiplicity of infection，感染复数)值为10的比例加入细胞中，并设置不加菌的空白对照组，培养箱中继续培养24h。在待检测的每个细胞培养孔中加入mtt溶液，终浓度为0.3mg/ml，二氧化碳培养箱中孵育3h。小心弃掉上清，在每个24孔板细胞培养孔中加入500ul的dmso，37℃下孵育30min，使紫色结晶充分溶解。检测490nm下的吸光度值。
[0158]
结果显示，鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77对人胃腺癌细胞的增殖活性无显著影响，无细胞毒性，安全性良好。
[0159]
实施例7鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77对人胃腺癌细胞的粘附实验
[0160]
六孔板中已贴壁的人胃腺癌细胞(bgc-823)单细胞层，使用pbs缓冲液洗涤3次，加入实施例4所述鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77菌悬液，放入二氧化碳培养箱中培养2h。将细胞爬片用pbs缓冲液反复洗涤3次，去除未粘附的细菌。pbs反复洗涤5次，去除未粘附的细菌，pbs沿壁缓慢添加，避免细胞层被冲起。加入500ul胰酶消化3分钟，再加入1.5ml细胞培养液终止消化，反复吹打，并将所得溶液收集至无菌ep管中，并将收集的溶液进行梯度稀释，涂板计数。同时对空白组的细胞进行计数。根据以下公式计算供试菌株的粘附能力：
[0161]
粘附能力(cfu/cells)＝每个培养孔内粘附的细菌总数/每个培养孔的总细胞数。
[0162]
统计分析结果显示，鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77对人胃腺癌细胞的粘附量为1.28
±
0.55cfu/cell，说明该菌株可以有效的粘附在人胃腺癌细胞(bgc-823)表面。
[0163]
实施例8鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77对幽门螺旋杆菌的粘附抑制实验
[0164]
在六孔板中置入无菌细胞爬片，使用pbs缓冲液洗涤3次，保留已贴壁的人胃腺癌细胞bgc-823单细胞层，使用pbs缓冲液洗涤3次，分别加入1ml实施例4所述鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77菌悬液和幽门螺旋杆菌菌悬液(106cfu/ml)，以不加菌株的细胞作为空白对照，放入二氧化碳培养箱中培养2h。将细胞爬片用pbs缓冲液反复洗涤3次，去除未粘附的细菌。用无水甲醇固定20分钟，取出细胞爬片晾干，进行革兰氏染色，于100倍油镜下镜检观察20个随机视野，共100个细胞上粘附的幽门螺旋杆菌，计算平均每个细胞上粘附的幽门螺旋杆菌的个数。比较鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77存在和不存在的条件下，幽门螺旋杆菌在人胃腺癌细胞上粘附数量的变化，以不加乳酸菌的粘附率为100％，计算鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77对幽门螺旋杆菌的粘附抑制率。
[0165]
粘附抑制率(％)＝(对照组幽门螺旋杆菌粘附数量-实验组幽门螺旋杆菌粘附数量)/对照组幽门螺旋杆菌粘附数量
×
100％。
[0166]
结果显示，鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77能显著抑制幽门螺旋杆菌对人胃腺癌细胞的粘附作用，粘附抑制率高达49.30％。从图7也可以明显看出，与对照组相比，实验组在鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77存在的情况下，人胃腺癌细胞上粘附的幽门螺旋杆菌数量明显减少，效果非常显著。
[0167]
实施例9鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77凝集吸附试验
[0168]
取实施例4所述鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77菌悬液300μl加入24孔板中，再加入
300μl幽门螺旋杆菌菌悬液(106cfu/ml)作为实验组；另取等量的鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77菌悬液和缓冲液混合作为对照组，每个对照及实验组设2个平行。将24孔板置于微孔板恒温振荡器，400rpm，室温，振荡孵育。显微地观察并拍照记录初始孔板状态及不同时间的孔板状态，观察是否有凝集现象出现。
[0169]
结果如图8所示，鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77和幽门螺旋杆菌结合出现明显的凝集物，而对照组中无凝集现象。
[0170]
实施例10鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77对人肠道上皮细胞(caco-2)的粘附实验
[0171]
1.人肠上皮细胞(caco-2)细胞的培养：
[0172]
从液氮罐中取出caco-2细胞，进行复苏、传代培养，培养细胞数量扩增至所需用量。倒置显微镜下观察细胞生长融汇接近80％时可进行后续实验。弃掉原培养基，pbs润洗两遍，加入适量胰酶。加入胰酶后将细胞放回培养箱，肉眼观察到细胞完全脱落后，加入2～3倍胰酶体积的培养液终止消化，反复吹打十次左右，镜下观察，尽量成单细胞状态。单细胞悬液吸入15ml或50ml离心管，1000转离心5分钟，后弃上清，轻弹散细胞沉淀，加入适量新培养基吹打重悬。血球计数板进行细胞计数，使用pbs适量稀释细胞悬液，建议细胞稀释至每大格20～50细胞为宜。六孔板中每个孔细胞的铺板个数为1.5
╳
106cells，每孔培养液的添加量为2ml。六孔板放置二氧化碳培养箱中24小时后，可进行后续细胞粘附实验。
[0173]
2、粘附试验：
[0174]
将六孔板中已贴壁的caco-2单细胞层，使用pbs洗涤2遍；实验组分别加入1ml无抗细胞培养液，1ml实施例4所述鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77菌悬液，放入二氧化碳培养箱中培养2h；用pbs反复洗涤5次，去除未粘附的细菌；加入500ul胰酶消化3分钟，再加入1.5ml细胞培养液终止消化，反复吹打，并将所得溶液收集至无菌ep管中，并将收集的溶液进行10倍、100倍、1000倍、10000倍梯度稀释，涂板计数菌量。
[0175]
同时，以对细胞粘附性强的鼠李糖乳杆菌lgg菌株作为对照组，参照上述步骤进行操作。
[0176]
根据以下公式计算鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77的粘附能力：
[0177]
粘附能力(cfu/cells)＝每个培养孔内粘附的细菌总数/每个培养孔的总细胞数。
[0178]
结果显示：本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77对人肠上皮细胞的粘附能力是对照组鼠李糖乳杆菌lgg的34.6倍，从而说明鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77可以更有效的粘附在人肠道内，为其在肠道中定植并发挥益生作用提供了基础。
[0179]
实施例11鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77体外胆固醇降解实验
[0180]
胆固醇胶束溶液的配制：准确称取1g胆固醇，溶于无水乙醇中，并定容至100ml，在无菌条件下用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
[0181]
称取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0ml、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.1g、硫酸锰0.05g、磷酸氢二钾2.0g、胆盐1g，蒸馏水1000ml调节ph值7.3，115℃灭菌30min，然后加入胆固醇溶液使胆固醇终浓度为0.1％。
[0182]
按照0.1％的接种量接种鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77新鲜菌液，37℃静止培养48h，然后取0.2ml菌液，加入1.8ml无水乙醇，混匀，静止10分钟，3000转离心5分钟，取上清液用于测定胆固醇含量。胆固醇测定方法按照gb/t 5009.128-2003《食品中胆固醇的测定》。具体结果见表7。
[0183]
表7.鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77对胆固醇的降解效果
[0184][0185]
从表7的结果可知，本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77对胆固醇的降解率达到21.7％，对含盐胆固醇的降解率也达到了8.4％，效果显著。
[0186]
实施例12鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77抗氧化能力的测定
[0187]
12.1菌株清除羟基自由基(hrs)能力测定
[0188]
将200ul实施例4所述鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77菌悬液，100ul 5mm的水杨酸钠-乙醇溶液，100ul 5mm的硫酸亚铁，500ul去离子水混匀后加入100ul过氧化氢溶液(3mm)，37℃水浴15min后在510nm波长处测量菌悬液的吸光度，计算菌悬液对hrs的清除率。
[0189]
另外，用同等剂量的实施例4所述鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77发酵上清液代替菌悬液进行实验，测定上清液对hrs的清除率。具体结果见表8。
[0190]
羟自由基清除率按照下列公式进行计算。
[0191]
清除率(％)＝(a
样品-a
控制
)/(a
空白-a
控制
)
×
100％。
[0192]
其中：a
控制
为硫酸亚铁、过氧化氢和水杨酸钠混合溶液的吸光度，a
空白
为硫酸亚铁和水杨酸钠混合溶液的吸光度。
[0193]
表8.鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77对hrs自由基的清除效果
[0194][0195]
12.2菌株抗脂质过氧化实验鉴定
[0196]
以实施例4所述鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77菌悬液、发酵上清液和胞内提取物作为样品，分别检测其抗脂质过氧化抑制率。其中，胞内提取物的制备方法如下：
[0197]
取实施例4所述鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77菌悬液，冰浴超声波破碎细胞(每工作2s间歇1s，输出功率300w)10min后，在4℃、10000r/min离心30min，收集上清液，即为鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77的胞内提取物。
[0198]
抗脂质过氧化实验具体步骤为：
[0199]
亚油酸乳化液的制备：0.1ml亚油酸，0.2ml tween 20，19.7ml去离子水。
[0200]
0.5ml的pbs缓冲液(ph 7.4)中加入1ml亚油酸的乳化液，1mlfeso4(1％)，再加入0.5ml样品，37℃水浴1.5h，混合液加入0.2ml tca(4％)，2ml tba(0.8％)，100℃水浴30min，迅速冷却，4000rpm/min离心15min，收集上清液在532nm下测吸光度即为a；对照组以0.5ml蒸馏水代替样品即a0。
[0201]
抗脂质过氧化抑制率按照下列公式进行计算。
[0202]
抑制率(％)＝(a0－a)/a0
×
100％。
[0203]
其中：a为样品组吸光度；a0为对照组吸光度。
[0204]
具体结果见表9。
[0205]
表9.鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77抗脂质过氧化抑制效果
[0206][0207]
12.3菌株清除dpph(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)能力测定
[0208]
取1ml实施例4所述鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77菌悬液，加入1ml 0.4mm的现配的dpph自由基溶液，混合均匀后然后置于室温温度下遮光反应30min，然后测定样品在波长517nm处的吸光度a样本，测3次平行。对照组样品以等体积pbs溶液和dpph
·
乙醇混合液，并以等体积pbs缓冲液和乙醇混合液空白调零。
[0209]
清除率按下列公式计算：
[0210]
清除率％＝[1-(a样品-a空白)/a对照]
×
100％。
[0211]
具体结果见表10。
[0212]
表10.鼠李糖乳酪杆菌vhprobi v77对dpph自由基的清除效果
[0213][0214]
综上所述，本发明分离得到的鼠李糖乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)vhprobi v77对胃肠液具有很强的耐受性，不产生溶血素，不会溶解血细胞，生物安全性良好；能够有效降解血清中的胆固醇，清除dpph自由基和hrs自由基，抑制脂质过氧化，具有较强的抗氧化功能活性。此外，该菌株的菌体和上清液均可有效抑制幽门螺旋杆菌的生长，与幽门螺旋杆菌实现共凝集，并能显著抑制幽门螺旋杆菌在胃肠细胞表面的粘附作用，可广泛用于制备食品、保健品以及用于预防或治疗由幽门螺旋杆菌引起的胃炎，胃溃疡等疾病的药品，前景广阔。

技术特征：
1.一种鼠李糖乳酪杆菌，其特征在于，所述的鼠李糖乳酪杆菌的保藏编号为cctcc no：m2023500。2.如权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌，其特征在于，所述鼠李糖乳酪杆菌的16s rdna序列为seq id no:1。3.如权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌，其特征在于，所述鼠李糖乳酪杆菌的rapd指纹图谱如图3所示；其rep-pcr指纹图谱如图4所示；其maldi-tof-ms蛋白质指纹图谱如图5所示。4.权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌在制备幽门螺旋杆菌抑制剂中的应用。5.权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌在制备食品或保健品中的应用。6.权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌在制备药品中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的药品具有预防或治疗由幽门螺旋杆菌引起的消化道疾病的功能。8.一种用于预防或治疗胃炎的药品，其特征在于，所述药品中包含权利要求1所述鼠李糖乳酪杆菌的活菌菌体、灭活菌体、发酵代谢产物或胞内提取物中的至少一种。

技术总结
本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体提供了一株对幽门螺旋杆菌具有拮抗作用的鼠李糖乳酪杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）。所述菌株对胃肠道环境耐受性强，能有效降解胆固醇，抗氧化效果显著，还能明显抑制幽门螺旋杆菌的生长和粘附作用，已于2023年4月10日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2023500。所述鼠李糖乳酪杆菌可广泛应用于功能性食品、保健品或药品中。保健品或药品中。


技术研发人员：段治 程淑敏 张景燕 崔洪昌 李凯玲
受保护的技术使用者：青岛蔚蓝生物股份有限公司
技术研发日：2023.05.23
技术公布日：2023/10/15