一种捕获外泌体的刺状纳米微球及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种捕获外泌体的刺状纳米微球及其制备方法和应用。


背景技术：

2.近年来，肿瘤的免疫治疗由于其突出的治疗效果和巨大的应用前景，已成为恶性肿瘤治疗的重要研究方向。已有免疫检查点抑制剂类药物ctla-4和pd-1/pd-l1通过阻断肿瘤细胞的免疫抑制，有效提高细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxic t lymphocytes，ctl)对肿瘤的杀伤作用。但现有检查点抑制剂治疗仅对20％患者有效，另外80％因缺乏肿瘤特异性ctl，无法从中获益。为此，通过肿瘤疫苗诱导肿瘤特异性免疫反应是剩余80％患者的希望，也是肿瘤治疗的热点。个体化肿瘤疫苗能够激活自身免疫系统，特异性杀死肿瘤细胞，并有效预防肿瘤的复发及转移，是恶性肿瘤治疗的重要研究方向。肿瘤疫苗通过肿瘤特异性抗原激活免疫反应。因此，寻找肿瘤特异性抗原，并高效诱导抗原递呈，是目前个体化肿瘤疫苗开发的关键。
3.目前常见的肿瘤疫苗包括肿瘤新抗原(neoantigen)疫苗、灭活肿瘤细胞裂解物、肿瘤细胞相关抗原、肿瘤细胞外泌体(tumor-derived exo-some，tex)等。其中，肿瘤细胞裂解物成分复杂，获取手段有限；肿瘤细胞相关抗原则存在单个抗原作用效果有限、易于脱靶等问题；肿瘤新抗原的预测准确性有限，难以应用于临床。而相比于其他种类特异性抗原，tex具有易于获得、生物安全性高的优势，作为肿瘤疫苗具有极大的潜力。
4.tex由于包含肿瘤细胞特异抗原，作为肿瘤疫苗被运用于肿瘤治疗。外泌体是一类由细胞分泌的具有磷脂双分子膜结构的小型囊泡，其直径为50-150nm。已有研究表明，tex可作为肿瘤体外检测与早期诊断的依据。tex中含有肿瘤细胞抗原成分，作为肿瘤疫苗能够活化树突状细胞(dentrict cells，dcs)并递呈抗原给t细胞，诱导机体产生抗肿瘤免疫应答。体外培养条件下，相较于肿瘤细胞裂解物，tex诱导的ctl免疫应答更加高效。证明tex可作为组织特异性高、诱导免疫反应强的个体化肿瘤疫苗。
5.尽管tex具有诸多优点，现有实验方法仍然无法实现肿瘤来源外泌体的大量分离纯化。目前常用于分离外泌体的实验方法包括：超高速离心法、纳米膜材料试剂盒分离法、二维平面纳米材料分离法、色谱法、酶连免疫磁珠吸附法、沉淀法和流式分选等，这些方法都难以获取大量tex并应用于临床治疗。肿瘤病人体内环境复杂，外周血中混杂多种细胞来源的外泌体，现有分离方法无法在体内环境下高效特异地分离肿瘤来源的外泌体。此外，不同于体外培养的肿瘤细胞，原代肿瘤细胞的体外大量培养技术要求高，难以广泛应用，因此体外条件下也无法大量制备tex。


技术实现要素：

6.本发明的一个目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种在肿瘤原位特异性捕获肿瘤外泌体(tumor-derived exo-some，tex)的新策略。
7.为了实现以上发明目的，本发明提供了一种捕获外泌体的刺状纳米微球，其包括tio2刺状纳米微球骨架以及通过mal-peg-nhs链与其共价连接的抗体。
8.优选地，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。更优选地，所述抗体是肿瘤特异性抗原的单克隆抗体。最优选地，所述抗体是肿瘤特异性抗原gpc-3的单克隆抗体。
9.另一方面，本发明还提供了所述刺状纳米微球的制备方法，包括以下步骤：
10.(1)刺状纳米微球骨架合成：称取1g tio2粉末，加入40ml 10m naoh溶液，超声15分钟使粉末分散，120℃加热24小时，洗涤去除naoh，当洗涤液ph到达10时加入1m naoh溶液，超声后加入1.5ml 30％ h2o2溶液，150℃加热12小时，用ddh2o洗涤，6000g离心5分钟收集沉淀，加入0.05m hno3溶液，400℃退火2小时，得到所述刺状纳米微球骨架；
11.(2)mal-peg-nhs链修饰：取5mg所述刺状纳米微球骨架分散于1ml无水乙腈中，加入50μl aptes进行取代反应，60℃搅拌过夜，离心去上清，用乙腈洗涤3次，将微球重新分散于1ml无水乙腈，加入0.2ml mal-peg-nhs、33μl dipea，60℃加热过夜进行缩合反应，然后用乙醇洗涤3次，去离子水洗涤2次，弃上清，4℃保存；
12.(3)单克隆抗体修饰：取20μg抗体，加入2μl的10mm dtt，37℃孵育1小时，随后对抗体进行脱盐处理，用dtnb检测自由巯基的量，按照抗体：微球＝20μg:1mg的比例，将抗体加入步骤(1)中已处理好的微球中，室温翻转混匀孵育1小时，随后加入0.2ml浓度为20mm的半胱氨酸封闭1小时，离心去上清，pbs溶液洗涤3次，最后加入100μl ph＝7.2的pbs溶液，得到所述刺状纳米微球。
13.另一方面，本发明还提供了所述刺状纳米微球在制备用于治疗和/或预防肿瘤的药物方面的应用。
14.优选地，所述肿瘤是实体瘤或非实体瘤，优选是实体瘤，包括但不限于肝癌、黑色素瘤。
15.在体外共培养条件及体内条件下靶向抗原递呈细胞的应用。
16.另一方面，本发明还提供了所述刺状纳米微球在制备用于促进肿瘤特异性免疫反应的药物方面的应用。优选地，所述肿瘤特异性免疫反应包括抗原递呈细胞激活和肿瘤特异性抗原递呈。
17.另一方面，本发明还提供了所述刺状纳米微球在制备用于促进免疫激动佐剂功效的药物方面的应用。
18.优选地，所述免疫激动佐剂是adu-s100。
19.本发明提供了一种在肿瘤原位特异性捕获肿瘤外泌体的新策略。本发明通过mal-peg-nhs链共价连接肿瘤特异性抗原gpc-3的单克隆抗体(anti-gpc-3)至tio2刺状纳米微球(spiky particle，sp)，构建能够特异性原位捕获肿瘤外泌体的刺状纳米微球(spiky microparticles for tex capture，spec)。通过以spec表面的纳米刺结构初步分离肿瘤环境中的外泌体。spec表面的纳米刺间隙能够肿瘤微环境中分离并吸附外泌体(30-150nm)，其表面修饰的mal-peg-nhs链共价连接anti-gpc-3，特异性识别结合高表达gpc-3的肿瘤来源外泌体，从而在肿瘤内或肿瘤周边特异性捕获tex。
20.本发明以小鼠肿瘤细胞系b16f10为例，通过免疫荧光染色、westrern blot检测了spec对tex的特异性结合能力。此外，本发明还提供了spec应用于肿瘤个体化免疫治疗的方案。本发明在体外共培养条件下与荷瘤小鼠模型中，通过免疫荧光染色、流式细胞术检测，
验证了spec靶向抗体递呈细胞及诱导肿瘤特异性免疫的能力。本发明以b16-ova荷瘤小鼠为示例模型进行说明，相比于sp+adu-s100对照组，spec联合免疫激动剂adu-s100治疗显著促进肿瘤特异性免疫反应，包括小鼠瘤内dc细胞及巨噬细胞比例增加，小鼠肿瘤、淋巴结及脾脏中cd8+t细胞ifnγ分泌水平显著提高。同时，在b16f10、hepa1-6、h22等多种荷瘤小鼠模型中，spec联合治疗显著延长小鼠生存时间，显著抑制给药侧肿瘤及远端肿瘤的生长。因此，spec可应用于肿瘤免疫治疗或与新辅助治疗联用，具有很好的应用前景。
附图说明
21.图1是本发明的刺状纳米微球spec制备路线示意图。
22.图2是检测spec具有捕获tex的理化特性结果图。其中：a是扫描电镜及投射电镜下spec结构图；b是统计透射电镜下测量spec纳米刺间隙宽度结果；c是扫描电镜下spec及对照sp-igg结合100、200、500nm三种不同尺寸sio
2-prog微球(模拟不同大小细胞外囊泡)的结果图；d是c对应的统计结果。
23.图3是spec在体外共培养条件下特异性结合肿瘤来源外泌体实验结果图。其中：a是荧光显微镜下观察spec及对照sp-igg结合tex实验结果，图中绿色信号标记spec及sp-igg表面抗体，红色标记小鼠黑色素瘤细胞b16f10来源tex表面mcd63蛋白；b是spec及对照sp-igg结合tex后westernblot检测裂解物中外泌体标志分子mcd63蛋白表达情况；c是超分辨显微镜stedycon下观察spec结合tex实验结果，绿色标记spec及sp-igg表面抗体，红色标记tex表面mcd63蛋白；d是荧光显微镜下观察spec及对照sp-igg选择性结合肿瘤来源外泌体实验结果，图中紫色信号为did，标记b16f10细胞外泌体tex，绿色信号为dio，标记小鼠表皮成纤维细胞外泌体exo。
24.图4是spec在体外共培养条件下靶向抗原递呈细胞bmdc的结果图。其中：a是荧光显微镜下观察spec在不同细胞中的分布，紫色信号标记dc细胞标志物mhc ii，绿色标记肿瘤细胞标志物gfp，白色为cy5信号，标记spec分子，蓝色为dapi信号，标记细胞核；b是a对应的统计结果。
25.图5是spec在小鼠b16f10移植瘤内靶向抗原递呈细胞的结果图。其中：a为肿瘤冰冻切片的免疫荧光染色结果，图中绿色信号为spec带有的bodipy标记，红色信号为小鼠cd11c+细胞(dc细胞)带有的td-tomato标记，蓝色信号为dapi，标记细胞核；b是a对应的统计结果；c为流式检测小鼠肿瘤组织中dc细胞及巨噬细胞吞噬spec的情况。
26.图6是spec微球协同免疫激动佐剂adu-s100促进抗原递呈细胞激活及肿瘤特异性抗原递呈结果。其中：a、b是体外培养条件下tex、spec-tex共孵育后获得复合物、spec-tex复合物协同adu-s100激活bmdc及促进ova抗原递呈的结果；c至e是在小鼠b16f10-ova移植瘤中spec促进dc细胞及巨噬细胞抗原递呈细胞浸润的结果；f至h是荷瘤小鼠移植瘤、淋巴结及脾脏中spec协同adu-s100促进cd8+t细胞ifnγ分泌的结果，i是移植瘤中spec协同adu-s100提高特异性表达ova257-264siinfekl的cd8+t细胞比例的结果。
27.图7是spec微球协同免疫激动佐剂在多种肿瘤中的免疫治疗效果图。其中：a是spec联合adu-s100治疗延长hepa1-6荷瘤小鼠生存时间的结果；b至c是spec联合adu-s100治疗抑制hepa1-6移植瘤及对侧肿瘤生长结果；d是spec联合adu-s100及apd-l1治疗延长b16f10荷瘤小鼠生存时间的结果；e是spec联合adu-s100及apd-l1治疗抑制b16f10移植瘤
生长结果；f是spec联合adu-s100及apd-l1治疗延长h22荷瘤小鼠生存时间的结果；g至h是spec联合adu-s100及apd-l1治疗抑制h22移植瘤及对侧肿瘤生长结果。
具体实施方式
28.以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。
29.在以下的实施例中，所有实验用到的生物化学试剂均购自商业试剂公司并且不再作进一步的处理。扫描电镜检测使用美国fei公司台式场发射电镜phenom pharos g1。透射电镜检测使用fei公司tecnai g2 spirit 120kv透射电子显微镜。超高速冷冻离心使用德国beckman公司optima xe-100超高速离心机。流式细胞术检测使用美国bd公司的bd facs lsrfortessa流式分析仪。免疫荧光观察使用德国蔡司公司zeiss lsm 880超高分辨率激光共聚焦显微镜及德国abberior公司stedycon超分辨显微镜。westernblot显影成像使用美国ge公司amersham imagequant 800多功能成像仪。
30.实施例1：spec的合成
31.本发明的刺状纳米微球spec的合成路线大体如图1所示，具体包括以下步骤：
32.1.刺状纳米微球(sp)骨架合成：
33.称取1g tio2粉末，加入40ml 10m naoh溶液，超声15分钟使粉末分散。在水热釜密封条件下120℃加热24小时。用ddh2o洗涤去除naoh，当洗涤液ph到达10时加入1m naoh溶液，超声后加入1.5ml 30％(质量浓度)h2o2溶液，在水热釜密封条件下150℃加热12小时。用ddh2o洗涤，6000g离心5分钟收集沉淀。加入0.05m hno3溶液，400℃退火2小时，得到刺状纳米微球骨架。
34.2.mal-peg-nhs链修饰：
35.取5mg上述刺状纳米微球骨架分散于1ml无水乙腈中，加入50μl aptes(氨丙基三乙氧基硅烷)进行取代反应，60℃搅拌过夜。离心去上清，用乙腈洗涤3次。将微球重新分散于1ml无水乙腈，加入0.2ml mal-peg-nhs(马来酰亚胺-聚乙二醇-活性酯)(分子量为1000da，溶于0.45m dmso溶液)、33μl dipea(n,n-二异丙基乙胺)，60℃加热过夜进行缩合反应。用乙醇洗涤3次，去离子水洗涤2次，弃上清，4℃保存。mal-peg-nhs是异双活性基团peg衍生物的一种，可以用来修饰蛋白、多肽或者其他含有巯基/氨基的小分子，马来酰亚胺可以与巯基在ph 6.5-7.5形成稳定硫醚键，活性酯(nhs)在ph 7-8.5与伯胺基团反应形成稳定的酰胺键。
36.3.单克隆抗体修饰：
37.取20μg migg(重组小鼠免疫球蛋白g，作为阴性对照)或anti-gpc-3单抗，加入2μl dtt(二硫苏糖醇)(10mm)，37℃孵育1小时，随后用离心脱盐层析柱pdspintrapg-25对抗体进行脱盐处理，用dtnb(二硫代二硝基苯甲酸)检测自由巯基的量。按照抗体：微球＝20μg:1mg的比例，将抗体加入上述已处理好的微球中，室温翻转混匀孵育1小时，随后加入0.2ml浓度为20mm的半胱氨酸封闭1小时，离心去上清，pbs溶液洗涤3次，最后加入100μl ph＝7.2的pbs溶液，储存于4℃待用。
38.实施例2：spec在体外共培养条件下特异性结合肿瘤来源外泌体(tex)
39.1.spec具有捕获tex的理化特性。
40.(1)扫描电镜下观察测量spec纳米刺间隙：
41.取20μg spec悬液，ddh2o洗涤后60℃烘干过夜。将烘干的spec干粉均匀分散于绝缘胶带，扫描电镜拍照观察spec纳米刺结构。将spec干粉使用树脂包埋切片，透射电镜拍照统计spec纳米刺结构间隙宽度。
42.(2)不同尺寸sio
2-igg微球模拟外泌体捕获：
43.随后使用100nm、200nm、500nm三种不同尺寸sio
2-igg微球模拟不同大小细胞外囊泡，按质量比10:1与spec或sp-igg(migg代替anti-gpc-3单抗加入，作为阴性对照)混合，4℃翻转孵育过夜。pbs溶液洗涤3次，弃上清，去离子水洗涤1次后60℃烘干过夜。将烘干的spec干粉均匀分散于绝缘胶带，扫描电镜拍照统计捕获微球数目。
44.(3)结果分析
45.图2是检测spec具有捕获tex的理化特性结果图。图2中，a是扫描电镜(sem)及透射电镜(tem)下spec结构图；b是统计透射电镜下测量spec纳米刺间隙宽度结果；c是扫描电镜下spec及对照sp-igg结合100、200、500nm三种不同尺寸sio
2-prog的结果图；d是c对应的统计结果。如图2所示，spec表面的纳米刺间隙80-200nm，能够满足分离肿瘤微环境中外泌体(30-150nm)的要求；此外，在使用不同尺寸sio
2-igg微球模拟外泌体捕获实验中，以100nm sio
2-igg微球模拟外泌体，结果表明，spec能够高效结合环境中tex。
46.2.spec体外条件下特异性捕获肿瘤来源外泌体
47.(1)外泌体的分离富集及标记
48.将用于配置培养基的fbs血清于100000g，4℃离心70分钟超高速冷冻离心去除外泌体，用于配置收集外泌体的培养基。使用肿瘤细胞或成纤维细胞体外培养。以20cm培养皿、1
×
108细胞数目加入20ml rpmi培养基(含10％去除外泌体fbs血清、1％青链霉素混合液、1％neaa(非必需氨基酸)溶液(invitrogen)，以上百分比均为质量体积浓度)培养48小时，收取培养上清，500g、4℃离心10分钟去除死细胞，15000g、4℃离心10分钟去除细胞碎片，100000g、4℃离心70分钟后弃上清，使用pbs溶液重悬并洗涤，用500μl pbs溶液重悬后，获得外泌体溶液。在后续选择性捕获实验中，使用did或dio染料(10μm)室温避光染色1h，加入40ml pbs溶液洗涤后于100000g、4℃离心70分钟，分别标记肿瘤来源及成纤维细胞来源外泌体。
49.(2)spec体外捕获tex
50.取20μg spec悬液，加入过量tex室温翻转混匀孵育1小时，随后使用pbs溶液洗涤3次除去未结合的tex，弃上清，按体积比1:100加入rat-anti-mcd63的抗体(购自biolend公司)进行翻转混匀孵育，4℃过夜。使用pbs溶液洗涤3次，除去未结合的一抗，按体积比1:500加入anti-mouse-igg-af488及anti-rat-igg-af555荧光二抗(购自cst公司)，避光条件下室温翻转混匀孵育1小时，使用pbs溶液洗涤3次除去未结合的二抗。使用10μl抗淬灭封片剂(购自thermo fisher公司)重悬后制片，使用zeiss lsm 880超高分辨率激光共聚焦显微镜及stedycon超分辨显微镜观察。
51.取50μg spec悬液，按上述方法捕获tex并洗涤除去未结合的tex，加入50μl ripa裂解液(购自beyotime公司)沸水浴12分钟，离心收集含有蛋白裂解物的上清，使用westernblot检测裂解物中外泌体标记蛋白mcd63。电泳前制备10％(质量体积浓度)sds-page胶，电泳条件为：浓缩胶恒流10ma，分离胶恒流20ma；转膜条件为：恒流250ma，冰浴3小
时。转膜结束后取出pvdf膜，使用含有5％(质量浓度)bsa(乙酰胺)的tbst(tbs with tween-20)溶液封闭1小时，随后加入1:1000稀释的rat-anti-mcd63的抗体(购自biolend公司)溶液，4℃孵育过夜。tbst溶液室温洗涤3次，加入anti-rat-igg-hrp二抗(购自cst公司)，室温孵育1h。tbst溶液室温洗涤3次，将膜浸泡于ecl试剂(购自beyotime公司)1min，使用ai800多功能成像仪进行成像以及分析。
52.(3)spec选择性捕获肿瘤来源外泌体
53.取20μgspec悬液，加入过量荧光标记的tex-did及小鼠皮肤成纤维细胞外泌体exo-dio(两种外泌体比例1：1)，室温翻转混匀孵育1小时，随后使用pbs溶液洗涤3次除去未结合的tex。使用10μl抗淬灭封片剂(购自thermo fisher公司)重悬后制片，使用zeiss lsm 880超高分辨率激光共聚焦显微镜观察。
54.(4)结果分析
55.图3是spec在体外共培养条件下特异性结合肿瘤来源外泌体实验结果图。图3中，a是荧光显微镜下观察spec及对照sp-igg结合tex实验结果，图中绿色信号标记spec及sp-igg表面抗体，红色标记小鼠黑色素瘤细胞b16f10来源tex表面mcd63蛋白；b是spec及对照sp-igg结合tex后westernblot检测裂解物中外泌体标志分子mcd63蛋白表达情况；c是超分辨显微镜stedycon下观察spec结合tex实验结果，绿色标记spec及sp-igg表面抗体，红色标记tex表面mcd63蛋白；d是荧光显微镜下观察spec及对照sp-igg选择性结合肿瘤来源外泌体实验结果，图中紫色信号为did，标记b16f10细胞外泌体tex，绿色信号为dio，标记小鼠表皮成纤维细胞外泌体exo。
56.如图3所示，与阴性对照sp-igg相比，体外共培养条件下spec能够特异性捕获肿瘤来源外泌体。其中，图3中a显示荧光显微镜下观察到spec结合tex的能力；b显示westernblot检测spec结合tex的能力；c显示超分辨显微镜stedycon下观察spec结合tex的能力；d显示荧光显微镜下观察spec具有特异性结合肿瘤来源外泌体的能力。
57.实施例3：spec在体外共培养条件下及体内条件下靶向抗原递呈细胞
58.1.体外共培养条件下spec靶向抗原递呈细胞
59.(1)bmdc的分离与培养
60.脱颈法处死4-5周龄的小鼠(购自中山大学实验动物中心)，解剖分离胫骨，pbs溶液冲洗收集骨髓细胞悬液，使用40μm细胞筛网过滤单细胞，ack红细胞裂解液(购自beyotime公司)去除红细胞。pbs溶液洗涤去除残留裂解液，以1
×
106/ml活细胞密度加入rpmi1640培养基(购自gibco公司，其中加入20ng/mlgm-csf，10％ fbs血清，1％青链霉素混合液，1％neaa溶液，以上百分比均为质量体积浓度)，培养2天，去除悬浮细胞，更换培养基继续培养。培养第6天取悬浮细胞重新贴壁培养，第7天重新贴壁的细胞即为bmdc细胞。
61.(2)在体外共培养条件下spec特异性靶向bmdc
62.将bmdc细胞与小鼠黑色素瘤高转移细胞b16f10-gfp按细胞数1:1贴壁培养于24孔板爬片(细胞总数1
×
105/孔)。待细胞贴壁后加入spec-cy5(10ug/孔)，培养6小时后使用pbs洗去未结合spec-cy5。加入4％(质量体积浓度)pfa(多聚甲醛)10分钟固定细胞，加入含有10％(质量体积浓度)fbs的pbs溶液室温封闭1小时，按体积比1:100加入anti-mhc ii-pe荧光一抗(购自biolend公司)，4℃孵育过夜。使用pbs溶液洗涤3次除去未结合的一抗后，使用10μl抗淬灭封片剂(购自thermo fisher公司)重悬后制片，使用zeiss lsm 880超高分辨
率激光共聚焦显微镜观察。
63.(3)结果分析
64.图4是spec在体外共培养条件下靶向抗原递呈细胞bmdc的结果图。图4中，a是荧光显微镜下观察spec在不同细胞中的分布，紫色信号标记dc细胞标志物mhc ii，绿色标记肿瘤细胞标志物gfp，白色为cy5信号，标记spec分子，蓝色为dapi信号，标记细胞核；b是a对应的统计结果。
65.如图4所示，在体外共培养条件下，spec主要分布于抗原递呈细胞bmdc中，提示体外条件下spec靶向抗原递呈细胞。
66.2.b16f10移植瘤中spec靶向抗原递呈细胞
67.(1)b16f10皮下成瘤小鼠模型构建
68.在c57bl6 cd11c-tdtomato转基因小鼠(购自赛业生物)皮下注射b16f10细胞pbs悬液(细胞数2.5
×
105/100μl/只)，构建荷瘤小鼠模型，实验组每周1次瘤内注射spec(100μg/只)，对照组注射等量sp-igg，免疫佐剂asu-s100瘤内注射每周2次(5μg/只)，持续测量小鼠肿瘤大小，记录小鼠生存时间。成瘤3周后，处死并解剖小鼠，取出肿瘤、淋巴结及脾脏进行后续实验。
69.(2)免疫组化检测b16f10移植瘤内spec分布
70.用4％(质量体积浓度)pfa溶液固定小鼠肿瘤组织，冰冻切片后进行免疫荧光染色，避光条件下dapi(500ng/ml)室温染色10分钟后使用pbs溶液洗涤，使用10μl抗淬灭封片剂进行封片。
71.(3)流式检测b16f10移植瘤内spec在抗原递呈细胞中的分布
72.取小鼠肿瘤、淋巴结及脾脏，剪碎消化研磨过300目筛网，获得组织单细胞悬液。按体积比1:100加入anti-cd11b-pe、anti-f4/80-fitc荧光一抗(购自biolend公司)，冰上孵育30分钟后pbs溶液洗去未结合抗体，4％(质量体积浓度)pfa溶液冰上固定10分钟，流式检测。
73.(4)结果分析
74.图5是spec在小鼠b16f10移植瘤内靶向抗原递呈细胞的结果图，图5中，a为肿瘤冰冻切片的免疫荧光染色结果，图中绿色信号为spec带有的bodipy标记(spec-bodipy)，红色信号为小鼠cd11c+细胞(dc细胞)带有的td-tomato标记，蓝色信号为dapi，标记细胞核；b是a对应的统计结果；c从左至右分别为流式检测小鼠肿瘤组织中dc细胞及巨噬细胞吞噬spec的情况。
75.如图5所示，在小鼠b16f10移植瘤内，spec主要富集于dc和巨噬细胞，提示spec具有运输肿瘤特异性抗原至抗原递呈细胞的作用。
76.实施例4：spec微球协同免疫激动佐剂adu-s100促进抗原递呈细胞激活及肿瘤特异性抗原递呈
77.(1)spec-tex复合物体诱导bmdc的激活
78.取20μg spec及其对照sp-igg悬液，分别加入过量tex室温翻转混匀孵育1小时，随后使用pbs溶液洗涤3次除去未结合的tex，弃上清，加入培养中的bmdc细胞，共培养24小时后pbs洗涤，收取细胞悬液，按体积比1:100分别加入anti-cd11c-fitc、anti-mhc i siinfekl complex-apc、anti-cd86-pe荧光一抗(均购自biolend公司)，冰上孵育30分钟后
pbs溶液洗去未结合抗体，用4％(质量体积浓度)pfa溶液冰上固定10分钟，流式检测。
79.(2)b16f10-ova皮下成瘤小鼠模型的构建
80.在c57bl6小鼠(购自中山大学动物实验中心)皮下注射b16f10-ova细胞pbs悬液(细胞数5
×
105/100μl/只)，构建荷瘤小鼠模型，实验组每周1次瘤内注射spec(100μg/只)，对照组注射等量sp-igg，免疫佐剂asu-s100瘤内注射每周2次(5μg/只)。成瘤3周后，处死并解剖小鼠，取出肿瘤、淋巴结及脾脏进行后续实验。
81.(3)流式检测b16f10移植瘤内免疫细胞浸润
82.取小鼠肿瘤剪碎消化研磨过300目筛网，获得组织单细胞悬液。分别按体积比1:100加入anti-cd11b-bv510、anti-cd11c-pb、anti-f4/80-fitc、anti-cd206-apc、anti-mhc ii-pe；anti-cd11b-bv510、anti-cd3-apccy7、anti-cd4-fiec、anti-cd8-apc、siinfekl-tetramer-pe荧光一抗(购自biolend公司和helixgen公司)，冰上孵育30分钟后pbs溶液洗去未结合抗体，用4％(质量体积浓度)pfa溶液冰上固定10分钟，流式检测。
83.(4)流式检抗原特异性t细胞反应
84.取小鼠肿瘤、淋巴结及脾脏，剪碎消化研磨过300目筛网，获得组织单细胞悬液。台盼蓝染色计数活细胞数目，调整各组细胞数目一致。在培养基中加入cd28(1:100)、ova257-264特异性抗原短肽siinfekl(终浓度5nm)，处理1小时后加入brefeldin a(体积比1:1000)继续培养5小时，收取细胞加入anti-cd3-apccy7、anti-cd4-fiec、anti-cd8-pe(购自biolend公司)，冰上染色30分钟。pbs溶液洗涤3次后用4％(质量体积浓度)pfa溶液冰上固定10分钟，随后使用saponin溶液(购自beyotime公司)重悬细胞，冰浴15分钟通透细胞膜后使用saponin溶液按体积比1:100稀释anti-ifnγ-apc(购自biolend公司)，冰上染色60分钟。saponin溶液洗涤后流式检测肿瘤特异性cd8+t细胞ifnγ分泌。
85.取小鼠肿瘤剪碎消化研磨过300目筛网，获得组织单细胞悬液。分别按体积比1:100加入anti-cd3-apccy7、anti-cd4-fiec、anti-cd8-apc(购自biolend公司)，按体积比1:300加入siinfekl-tetramer-pe荧光一抗(购自helixgen公司)，冰上孵育60分钟后pbs溶液洗去未结合抗体，用4％(质量体积浓度)pfa溶液冰上固定10分钟，流式检测ova257-264siin-fekl的肿瘤抗原特异性cd8+t细胞。
86.(5)结果分析
87.图6是spec微球协同免疫激动佐剂adu-s100促进抗原递呈细胞激活及肿瘤特异性抗原递呈结果。图6中，a、b依次是体外培养条件下tex、spec-tex共孵育后获得复合物(spec+tex)、spec-tex复合物协同adu-s100(spec+tex+as100)激活bmdc(a)及促进ova抗原递呈(b)的结果；c至e依次是在小鼠b16f10-ova移植瘤中spec促进dc细胞(c、d)及巨噬细胞(e)抗原递呈细胞浸润的结果；f至h依次是荷瘤小鼠移植瘤(f)、淋巴结(g)及脾脏(h)中spec协同adu-s100促进cd8+t细胞ifnγ分泌的结果；i是移植瘤中spec协同adu-s100(spec+as100)提高特异性表达ova257-264siinfekl的cd8+t细胞比例的结果。
88.如图6所示，spec微球协同免疫激动佐剂adu-s100抗原递呈细胞激活及肿瘤特异性抗原递呈。其中，a、b结果表明体外培养条件下spec-tex共孵育后获得复合物协同adu-s100激活bmdc及促进ova抗原递呈；c至e结果表明spec联合adu-s100治疗显著促进移植瘤中抗原递呈细胞浸润；f至i结果表明spec联合adu-s100治疗显著促进肿瘤特异性cd8+t细胞免疫反应。
89.实施例5：spec微球用于肿瘤个体化免疫治疗
90.(1)spec联合adu-s100治疗hepa1-6荷瘤小鼠
91.在c57bl6小鼠(购自中山大学动物实验中心)左右后肢皮下注射hepa1-6细胞pbs悬液(细胞数5
×
105/100μl/侧)，构建荷瘤小鼠模型，实验组每周1次治疗侧瘤内注射spec(100μg/只)，对照组注射等量sp-igg，免疫佐剂asu-s100瘤内注射每周2次(5μg/只)，持续测量治疗侧肿瘤及远端肿瘤大小，记录小鼠生存时间。
92.(2)spec联合adu-s100与apd-l1治疗b16f10荷瘤小鼠
93.在c57bl6小鼠(购自中山大学动物实验中心)右侧后肢皮下注射b16f10细胞pbs悬液(细胞数2.5
×
105/100μl/只)，构建荷瘤小鼠模型，实验组每周1次瘤内注射spec(100μg/只)，对照组注射等量sp-igg，免疫佐剂asu-s100瘤内注射每周2次(5μg/只)，腹腔注射apd-l1(100μg/只)，持续测量治疗侧肿瘤大小，记录小鼠生存时间。
94.(3)spec联合adu-s100治疗h22荷瘤小鼠
95.在balb/c小鼠(购自中山大学动物实验中心)左右后肢皮下注射h22细胞pbs悬液(细胞数5
×
105/100μl/侧)，构建荷瘤小鼠模型，实验组每周1次治疗侧瘤内注射spec(100μg/只)，对照组注射等量sp-igg，免疫佐剂asu-s100瘤内注射每周2次(5μg/只)，腹腔注射apd-l1(100μg/只)，持续测量治疗侧肿瘤及远端肿瘤大小，记录小鼠生存时间。
96.(4)结果分析
97.图7是spec微球协同免疫激动佐剂在多种肿瘤中的免疫治疗效果图。图7中，a是spec联合adu-s100治疗延长hepa1-6荷瘤小鼠生存时间的结果；b至c是spec联合adu-s100治疗抑制hepa1-6移植瘤及对侧肿瘤生长结果；d是spec联合adu-s100及apd-l1治疗延长b16f10荷瘤小鼠生存时间的结果；e是spec联合adu-s100及apd-l1治疗抑制b16f10移植瘤生长结果；f是spec联合adu-s100及apd-l1治疗延长h22荷瘤小鼠生存时间的结果；g至h是spec联合adu-s100及apd-l1治疗抑制h22移植瘤及对侧肿瘤生长结果。
98.如图7所示，spec微球协同免疫激动佐剂在多种肿瘤中均能显著延长小鼠生存时间，抑制肿瘤及远端肿瘤生长。其中，a至c显示spec联合adu-s100治疗延长hepa1-6荷瘤c57小鼠生存时间(a)，抑制hepa1-6移植瘤(b)及对侧肿瘤生长(c)；d至e显示spec联合adu-s100及apd-l1治疗延长b16f10荷瘤c57小鼠生存时间(d)，抑制移植瘤生长(e)；f至h显示spec联合adu-s100及apd-l1治疗延长h22荷瘤balb/c小鼠生存时间(f)，抑制h22移植瘤(g)及对侧肿瘤生长(h)。上述结果提示，spec在肿瘤原位捕获tex并作为肿瘤特异性抗原，是一种全新的个体化免疫治疗手段。
99.综上所述，spec能够在肿瘤原位有效分离富集tex。spec通过靶向抗原递呈细胞，将tex内肿瘤特异性抗原递送进入抗原递呈细胞，诱导肿瘤特异性免疫反应。这表明，通过spec在肿瘤原位捕获tex，并将其转化为肿瘤疫苗，可作为肿瘤个体化免疫治疗的新方法。
100.本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。

技术特征：
1.一种捕获外泌体的刺状纳米微球，其特征在于包括tio2刺状纳米微球骨架以及通过mal-peg-nhs链与其共价连接的抗体。2.根据权利要求1所述的刺状纳米微球，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。3.根据权利要求2所述的刺状纳米微球，其特征在于，所述抗体是肿瘤特异性抗原的单克隆抗体。4.根据权利要求2所述的刺状纳米微球，其特征在于，所述抗体是肿瘤特异性抗原gpc-3的单克隆抗体。5.根据权利要求1至4任一项所述的刺状纳米微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)刺状纳米微球骨架合成：称取1g tio2粉末，加入40ml 10m naoh溶液，超声15分钟使粉末分散，120℃加热24小时，洗涤去除naoh，当洗涤液ph到达10时加入1m naoh溶液，超声后加入1.5ml 30％h2o2溶液，150℃加热12小时，用ddh2o洗涤，6000g离心5分钟收集沉淀，加入0.05m hno3溶液，400℃退火2小时，得到所述刺状纳米微球骨架；(2)mal-peg-nhs链修饰：取5mg所述刺状纳米微球骨架分散于1ml无水乙腈中，加入50μl aptes进行取代反应，60℃搅拌过夜，离心去上清，用乙腈洗涤3次，将微球重新分散于1ml无水乙腈，加入0.2ml mal-peg-nhs、33μldipea，60℃加热过夜进行缩合反应，然后用乙醇洗涤3次，去离子水洗涤2次，弃上清，4℃保存；(3)单克隆抗体修饰：取20μg抗体，加入2μl的10mm dtt，37℃孵育1小时，随后对抗体进行脱盐处理，用dtnb检测自由巯基的量，按照抗体：微球＝20μg:1mg的比例，将抗体加入步骤(1)中已处理好的微球中，室温翻转混匀孵育1小时，随后加入0.2ml浓度为20mm的半胱氨酸封闭1小时，离心去上清，pbs溶液洗涤3次，最后加入100μl ph＝7.2的pbs溶液，得到所述刺状纳米微球。6.根据权利要求1所述的刺状纳米微球在制备用于治疗和/或预防肿瘤的药物方面的应用。7.根据权利要求1所述的刺状纳米微球在制备用于促进肿瘤特异性免疫反应的药物方面的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤特异性免疫反应包括抗原递呈细胞激活和肿瘤特异性抗原递呈。9.根据权利要求1所述的刺状纳米微球在制备用于促进免疫激动佐剂功效的药物方面的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述免疫激动佐剂是adu-s100。

技术总结
本发明公开了一种捕获外泌体的刺状纳米微球，其包括TiO2刺状纳米微球骨架以及通过MAL-PEG-NHS链与其共价连接的抗体。本发明还提供了所述刺状纳米微球的制备方法及其在制备用于治疗和/或预防肿瘤的药物方面的应用。本发明的刺状纳米微球能够特异性原位捕获肿瘤外泌体，从而在肿瘤内或肿瘤周边特异性捕获TEX，可应用于肿瘤免疫治疗或与新辅助治疗联用，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。


技术研发人员：王骥 尚丽茹 王夏峰 谢曦 陈惠琄 蒋娟 刘昕旻
受保护的技术使用者：中山大学附属第一医院
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/10/15