植酸在预防和/或治疗非洲猪瘟的药物中的用途

1.本发明属于生物化学领域，具体涉及植酸在预防和/或治疗非洲猪瘟的药物中的用途。


背景技术：

2.非洲猪瘟病毒(asfv)是一种大型双链dna病毒，该病毒首先于1921在肯尼亚发现，可感染野猪和家猪，具有极强的传染性。感染该病毒后，能够引起猪发热及全身脏器出血，死亡率高达100％。目前，针对该病毒尚无有效的疫苗及特效治疗药物，而大规模扑杀则是控制疫情爆发最有效的方法，因此对全球猪肉生产及加工产业造成了巨大经济损失。
3.研究证实，asfv进入宿主细胞后，病毒组份蛋白合成后会使胞内大量mrna降解，导致相关蛋白合成受到抑制，从而有利于病毒在宿主细胞中的复制和转录。其中，病毒基因d250r编码的蛋白：g5rp蛋白(g5r protein，即g5r蛋白，ncbi id：np_042795)具有mrna脱帽活性，能特异性水解宿主及病毒自身成熟mrna的5
′
末端m7gpppn帽子结构，而失去帽子结构保护的mrna会被宿主细胞中的核酸酶降解。即是说，g5rp蛋白具有加速宿主细胞mrna降解、调控病毒mrna表达的生物学功能的作用，是病毒感染和复制转录的关键([1]s.parrish et al.,virology 393(1)(2009)177-82；[2]j.l.cartwright et al.,j virol 76(3)(2002)1415-21；[3]a.quintas et al.,j virol 91(24)(2017).)。
[0004]
植酸(insp6)，又名肌醇六磷酸，广泛存在于农作物及农副产品中，是维生素b的一种，具有如下结构：
[0005][0006]
insp6其被认为是一种天然的抗氧化剂，已作为防腐剂添加至食品中，并且多项研究证实，insp6具有降血脂、防治肿瘤及防止肾结石等药用价值。但insp6对asfv的作用目前还未见报道。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于提供植酸的新用途。
[0008]
本发明提供了式i所示结构的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防非洲猪瘟的药物中的用途。
[0009][0010]
其中，r2、r3、r4、r6分别独立选自-oh或r1、r5分别独立选自-oh、
[0011]
进一步地，上述r1、r2、r3、r4、r5、r6均为所述化合物结构如式ii：
[0012][0013]
更进一步地，上述药学上可接受的盐包括钠盐、钾盐、锌盐、钙盐。
[0014]
更进一步地，上述药物是抗非洲猪瘟病毒的药物。
[0015]
更进一步地，上述药物是抑制非洲猪瘟病毒感染和/或复制的药物。
[0016]
更进一步地，上述药物是抑制非洲猪瘟病毒编码的g5rp蛋白活性的药物。
[0017]
更进一步地，上述药物是抑制g5rp蛋白对mrna的脱帽活性的药物。
[0018]
更进一步地，上述药物是抑制g5rp蛋白与核酸结合的药物。
[0019]
更进一步地，上述药物是抑制g5rp蛋白下调细胞内靶基因mrna表达水平的能力的药物，所述靶基因为eif4e基因。
[0020]
本发明发现，植酸(insp6)可以抑制g5rp蛋白与核酸的结合，显著抑制非洲猪瘟病毒g5rp蛋白的mrna脱帽活性，抑制非洲猪瘟病毒g5rp对细胞中靶基因mrna的降解作用。即可作为非洲猪瘟病毒g5rp蛋白的抑制剂，用于抑制asfv的感染和复制，达到预防或治疗非洲猪瘟的目的。
[0021]
本发明属于“核酸”包括单链dna或rna。
[0022]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0023]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0024]
图1：emsa检测insp6对g5rp核酸结合的抑制作用。a：insp6对g5rp与12mer ssdna结合的抑制结果图；b：insp6对g5rp与26mer ssdna结合的抑制结果图；c：insp6对g5rp与12mer ssrna结合的抑制结果图；d：insp6对g5rp与26mer ssrna结合的抑制结果图。
[0025]
图2：insp6对g5rp脱帽活性的抑制作用。a：固定底物浓度，insp6浓度梯度对g5rp脱帽活性的影响结果；b：固定insp6浓度，底物浓度梯度对g5rp脱帽活性的影响结果。
[0026]
图3：g5rp蛋白对细胞内靶基因mrna水平的影响。a-b：rt-qpcr验证g5rp蛋白对293t(a)及hela(b)细胞内靶基因eif4e的mrna的影响；c：insp6抑制g5rp蛋白在细胞内下调靶基因的mrna。
具体实施方式
[0027]
请提供本发明所用原料(植酸、g5rp蛋白、rna、dna等)及购买途径、规格
[0028][0029]
实施例1、植酸对非洲猪瘟病毒蛋白g5rp与核酸的结合作用的影响
[0030]
1、实验方法
[0031]
本实验在核酸5’端标记fam荧光基团，检测目的蛋白与核酸的相互作用。
[0032]
实验步骤：
[0033]
(1)结合溶液：20mm hepes,60mm kcl,0.5mm edta,0.1％triton-x-100,4mm dtt,2mm mgcl
2 and 5％(v/v)glycerol,ph 7.9；
[0034]
(2)电泳缓冲液：配制0.5
ⅹ
ace缓冲液，并在4℃下预冷。
[0035]
(3)配制4％page胶(13ml)
[0036][0037]
(4)固定反应体系为10μl，固定核酸浓度为0.25μm，蛋白浓度为2μm，insp6为：
0.03mm,0.06mm,0.12mm,0.25mm,0.5mm,1mm,1.50mm,2.00mm。将三者混合后冰上孵育30min。
[0038]
(5)反应结束后，按照蛋白浓度顺序依次上样，用4％的page，0.5
ⅹ
ace缓冲液，80v电泳60min。
[0039]
(6)电泳结束后，在伯乐全能型成像系统，绿光488nm下观察实验结果。
[0040]
2、实验结果
[0041]
如图1所示，从图中可以看出，植酸可以显著抑制非洲猪瘟病毒蛋白g5rp与核酸的结合，特别是植酸浓度达到0.25mm及以上时，抑制效果尤为显著。该结果证明：insp6可以有效抑制非洲猪瘟病毒g5rp与单链dna或者rna的结合。
[0042]
实施例2、植酸对非洲猪瘟病毒蛋白g5rp的脱帽活性的影响
[0043]
1、实验方法
[0044]
(1)首先进行加帽反应：使用诺唯赞t7转录试剂盒转录出5’端三磷酸rna(50μl反应体系：0.4nmol rna,12μl 3000ci/mmol[α-32
p]gtp,0.67mm腺苷甲硫氨酸,50mm tris
–
hcl ph 7.6,2mm mgcl2,6mm kcl,1mm dtt以及75u牛痘病毒加帽酶(neb)在37℃反应2h)；反应结束后，采用g-50柱(sigma)分离游离[α-32
p]gtp和m7gppprna，将m7gppprna以10μl/管分装冻于-80℃。实验时实验员除双手外皆应位于有机玻璃屏(防辐射)后，实验中所产生的废弃物投递于短半衰期放射性物质回收处。(2)其次进行脱帽反应：配制实验缓冲液(5
ⅹ
)：250mm tris-hcl(ph 7.0),10mm dtt and 10mm mncl2；将pei薄层色谱用ddh2o润湿，晾干；
[0045]
反应体系(5μl)：1μl 5
ⅹ
缓冲液，1μl蛋白，1μl m7gppprna，2μl depc水，通过设置蛋白浓度梯度和m7gppprna浓度梯度找到合适的蛋白和m7gppprna浓度；脱帽反应：37℃，反应60min。然后加入edta终浓度为25mm，放冰上5min，终止反应；
[0046]
点样：在薄层色谱距离底边3cm处点上反应产物
[0047]
展开：先将0.45m(nh4)2so4倒入层析缸中预平衡层析缸15min，待薄层色谱干透后放入层析缸中展开；
[0048]
待展开液跑到距离薄层色谱顶边5cm处，取出薄层板晾干
[0049]
将薄层板用保鲜膜包裹，在暗室中将薄层板放入暗匣，将x射线胶片覆盖住薄层板上样品所在位置，关上暗匣，静置48hr；
[0050]
取三个托盘，在暗室中，分别装入显影液、水、定影液，打开暗匣，用镊子取出胶片，放置于显影液中，轻轻晃动托盘，显影2-5min，待到能看清胶片上的图像时，用镊子取出胶片，放入水中洗去显影液，然后放入定影液中，定影1min，取出胶片，放入水中洗去定影液，晾干胶片，拍照保存结果
[0051]
2、实验结果
[0052]
如图2所示，从图中可以看出，植酸可以显著抑制非洲猪瘟病毒蛋白g5rp的脱帽活性，该结果证明：insp6可以有效抑制非洲猪瘟病毒g5rp对rna中“m7gppp帽”结构的水解作用。
[0053]
实施例3、植酸对g5rp在细胞内降解靶基因mrna水平的影响
[0054]
1、实验方法
[0055]
(1)生长至80％密度的细胞，胰酶消化，1000rpm离心3min，收集细胞；
[0056]
(2)含10％fbs和1％抗生素的dmem培养基重悬细胞，按一定比例稀释；
[0057]
(3)将重悬的细胞均匀铺入6孔板中，每孔2ml，使细胞终密度为30％左右。
[0058]
(4)在无菌的ep管中，将1.2μg的质粒加入到100μl无血清无抗生素dmem培养基中，轻轻混匀；
[0059]
(5)再加入6μl attranctane转染试剂，轻轻混匀，室温静置15min；
[0060]
(6)将(5)步配制的转染复合物滴加至细胞培养孔中，轻轻摇匀；
[0061]
(7)培养48hr后(或24hr后加入不同浓度的insp6，再次处理24hr)，收集细胞；
[0062]
(8)加入1ml trizol进行细胞总rna的提取，采用反转录试剂盒合成cdna；
[0063]
(9)将cdna加水稀释至10ng/μl，按tbpremix ex taq
tm ii(tli rnaseh plus)进行qrt-pcr检测。
[0064]
2、实验结果
[0065]
如图3所示，从图3a、3b中可以看出，g5rp蛋白能够显著下调细胞内靶基因eif4e的mrna表达水平。而从图3c可以看出，植酸可以显著抑制g5rp蛋白对靶基因eif4e的mrna表达水平的下调作用，特别是植酸浓度达到0.3mm及以上时，抑制作用尤为显著。该结果证明：insp6可以有效抑制非洲猪瘟病毒g5rp对细胞中靶基因mrna的降解作用。
[0066]
综上，本发明提供了植酸(insp6)或其盐的新用途，其可以抑制g5rp蛋白与核酸的结合，显著抑制非洲猪瘟病毒g5rp蛋白的mrna脱帽活性，抑制非洲猪瘟病毒g5rp对细胞中靶基因mrna的降解作用。即可作为非洲猪瘟病毒g5rp蛋白的抑制剂，用于抑制asfv的感染和复制，达到预防或治疗非洲猪瘟的目的。

技术特征：
1.式i所示结构的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防非洲猪瘟的药物中的用途；其中，r2、r3、r4、r6分别独立选自-oh或r1、r5分别独立选自-oh、2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述r1、r2、r3、r4、r5、r6均为所述化合物结构如式ii：3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述药学上可接受的盐包括钠盐、钾盐、锌盐、钙盐。4.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述药物是抗非洲猪瘟病毒的药物。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物是抑制非洲猪瘟病毒感染和/或复制的药物。6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述药物是抑制非洲猪瘟病毒编码的g5rp蛋白活性的药物。7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述药物是抑制g5rp蛋白对mrna的脱帽活性的药物。8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述药物是抑制g5rp蛋白与核酸结合的药物。9.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述药物是抑制g5rp蛋白下调细胞内靶基因mrna表达水平的能力的药物，所述靶基因为eif4e基因。

技术总结
本发明提供了式I所示结构的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防非洲猪瘟的药物中的用途。尤其是R1、R2、R3、R4、R5、R6均为磷酸基，即为植酸(InsP6)时，可以抑制g5Rp与核酸结合，能够显著抑制非洲猪瘟病毒g5Rp蛋白的mRNA脱帽活性，进而抑制g5Rp蛋白对宿主细胞核酸的降解，从而可作为非洲猪瘟病毒g5Rp蛋白的抑制剂，用于抑制ASFV的感染和复制，达到预防或治疗非洲猪瘟的目的。或治疗非洲猪瘟的目的。或治疗非洲猪瘟的目的。或治疗非洲猪瘟的目的。


技术研发人员：苏丹 杨焱 张倡珲 李学会 孟凡
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：2022.03.24
技术公布日：2023/10/7