一种促睾酮合成的九肽及其应用的制作方法

1.本发明涉及功能性多肽相关技术领域，具体为一种促睾酮合成的九肽及其应用。


背景技术：

2.随着不良习惯(高脂饮食、抽烟)和老龄化的加剧，睾酮缺乏现象愈发普遍。睾酮分泌不足与不育、发育迟缓、轻度贫血、肌肉体积减少、身体脂肪增加、工作表现力下降、疲劳、活力丧失、易怒或情绪低落、注意力不集中和睡眠障碍有关。目前，睾丸激素补充疗法(tst)在治疗由性腺功能减退症状引发的睾酮不足的男性中发挥了关键作用，但长期使用仍然存在抑制下丘脑-垂体-性腺轴(hpg)活动、提高心血管疾病患病风险和诱发性功能障碍等副作用。因此，寻找绿色安全、有效的食源性补充物对辅助改善睾酮缺乏症状具有重要意义。
3.生物活性肽是指由2～50个氨基酸残基组成的具有生物活性的肽类化合物，包括寡肽(2～10个氨基酸残基组成)和多肽(11～50个氨基酸残基组成)，已被广泛应用于食品、保健食品、医药、化妆品等领域。现有技术发现紫苏籽肽可通过提高促卵泡激素和促黄体激素水平、加强类固醇合成急性调节蛋白和类固醇生成因子-1基因表达等途径改善环磷酰胺造成的性功能低下。牡蛎肽能够提高雄性小鼠体内抗氧化酶的活性和睾酮水平，但未分析其发挥活性作用的具体肽段。前人研究发现，海参水解物可显著提高老年雄性大鼠的睾酮水平，但其发挥活性的肽段尚未明晰，同时也缺少调控睾酮合成的分子机制研究。因此，目前关于食源性活性肽调控睾酮合成的研究还不充分。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种促睾酮合成的九肽及其应用，用于克服现有技术中的上述缺陷。
5.本发明是通过以下技术方案来实现的。
6.本发明的一种促睾酮合成的九肽，包括：
7.所述九肽的氨基酸序列为gly-pro-tyr-gly-pro-ala-gly-pro-arg。
8.所述九肽可显著提高睾丸间质细胞分泌睾酮的能力。
9.进一步的技术方案，所述九肽可与睾丸间质细胞膜上的lhcgr结合，激活细胞内camp-pka信号通路，促进睾酮合成。
10.进一步的技术方案，所述九肽与睾丸间质细胞膜上的lhcgr结合的结合点位分别为：gly-arg636、gly-arg636、gly-arg636、pro-arg636、pro-arg636、ala-lys394、arg-leu395、arg-val397。
11.进一步的技术方案，所述九肽在有cacl2共处理时，2和5μm的九肽同样表现出显著促进睾酮合成的能力。
12.进一步的技术方案，所述九肽可由东海乌参蛋白、其他海参及水产动物蛋白经适合的酶解技术制备而成。
13.本发明还包括一种促睾酮合成的九肽的应用，包括：
arg636；pro-arg636；pro-arg636；ala-lys394；arg-leu395；arg-val397(图1)。
32.表1东海乌参肽中潜在活性肽段与lhcgr受体分子对接结果
[0033][0034]
2、九肽的细胞毒性分析
[0035]
如图2所示，采用1～225μm的九肽(gptgpagpr)干预tm3睾丸间质细胞24h和48h。在给药浓度为1～100μm时，九肽干预24h和48h对tm3睾丸间质细胞均无显著毒性影响，当培养48h时，给药浓度为175～225μm具有显著毒性。
[0036]
3、九肽对tm3睾丸间质细胞合成睾酮能力的影响
[0037]
如图3所示，0.5μm、2μm和5μm(分别换算成0.4μg/ml、1.6μg/ml、4μg/ml)的九肽干预显著提高睾酮水平(p《0.05)。同时在有cacl2共处理时，2和5μm的九肽同样表现出显著促进睾酮合成的能力。
[0038]
4、九肽的一级质谱和二级质谱图
[0039]
图4a和4b分别表示九肽的一级质谱图和二级质谱图。肽类的裂解碎片离子包括：n端碎片离子(有a、b、c型)和c端碎片离子(有x、y、z型)。a、y、z型离子侧链断裂分别形成d、v、w型离子，此外还有两端断裂形成的内部离子等，以b、y系列离子最为常见，根据肽的b或y系列碎片离子可解析推断出肽的一级结构。如图4a中m/z 809.42为九肽的[m+h]+离子信号，这与九肽的分子量为809.422相符。进一步通过源内碰撞诱导解离技术对九肽进行二级质谱分析，确定九肽的一级结构为gly-pro-tyr-gly-pro-ala-gly-pro-arg。
[0040]
5、九肽在不同批次东海乌参肽样品中的含量
[0041]
如表2所示，以专利申请号为201810961331.x中的制备方法制备得到的“东海乌参肽”为本项目研究的应用样本(编号1～12)，经hplc-ms/ms检测发现，从“东海乌参肽”中均能稳定测出gptgpagpr九肽，并且其含量在0.1mg/g左右。然而，在其他市售胶原蛋白/肽及海参肽样本中均无检测出九肽，这表明九肽在“东海乌参肽”中稳定存在且具有特异性。
[0042]
表2东海乌参肽样品中gptgpagpr的含量
[0043][0044][0045]
6、九肽与东海乌参肽促进睾酮合成的能力比较
[0046]
如图5所示，0.1mg/ml(100μg/ml)和0.2mg/ml(200μg/ml)东海乌参肽干预均显著提升tm3睾丸间质细胞合成睾酮的能力。上述研究结果表明0.5μm(即0.4μg/ml)的九肽(摩尔质量为809.422g/mol)，具有显著促进睾酮合成的能力(图3)。与东海乌参肽(100μg/ml)比较，九肽给药剂量比东海乌参肽低250倍的条件下同样具有显著促进睾酮合成的能力，表明九肽具有更强的活性。
[0047]
7、九肽对tm3睾丸间质细胞睾酮合成相关基因表达的影响
[0048]
以人绒毛促性腺激素(hcg)作为阳性对照，对gr-9的活性功能进行深入评价。在gr-9(2μm)和hcg(2u/ml)干预后，细胞中lhcgr表达显著上调，在加入ca
2+
(1mmol/l)后同样具有显著差异(图6a)，但ca
2+
不增强九肽促进睾酮合成的能力。此外，与control组比较，gr-9和gr-9+cacl2组的cacna1g、plcg、prkaca和star基因的表达均显著提高(图6b～e，p《0.05)。研究结果显示gr-9与hcg活性功能相似，可能通过与lhcgr结合，进一步激活plc/cav3/pka信号通路促进睾酮合成。
[0049]
8、九肽的应用
[0050]
本发明的九肽可以单独应用于改善睾酮合成不足的食品，也可以与其他具有调节睾酮合成的活性组分进行复配使用，还可以制备成微胶囊，以改善多肽的胃肠道消化稳定性、生物利用度和延缓保质期，使其更好的应用于食品工业和医药工业领域。
[0051]
所述调节睾酮合成活性的活性组分可以包括植物提取物(枸杞、肉苁蓉、杜仲叶、玛咖、人参、桑葚等)、维生素(例如维生素d)、多酚类、其他的蛋白肽。
[0052]
所述的药物和食品是饮料、口服液、胶囊、微胶囊粉、片剂、颗粒或者乳液。
[0053]
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种促睾酮合成的九肽，其特征在于，包括：(i)所述九肽的氨基酸序列为gly-pro-tyr-gly-pro-ala-gly-pro-arg，分子量为809.422da。(ii)所述九肽具有促进睾酮合成的潜在活性，可显著提高tm3睾丸间质细胞合成睾酮实现提高睾酮水平。2.根据权利要求1所述的一种促睾酮合成的九肽，其特征在于：所述九肽可与睾丸间质细胞膜上的lhcgr结合，激活细胞内camp-pka信号通路，促进睾酮合成。3.根据权利要求2所述的一种促睾酮合成的九肽，其特征在于：所述九肽与睾丸间质细胞膜上的lhcgr结合的结合点位分别为：gly-arg636、gly-arg636、gly-arg636、pro-arg636、pro-arg636、ala-lys394、arg-leu395、arg-val397。4.根据权利要求1所述的一种促睾酮合成的九肽，其特征在于：所述九肽在有cacl2共处理时，2和5μm的九肽同样表现出显著促进睾酮合成的能力。5.根据权利要求1所述的一种促睾酮合成的九肽，其特征在于：所述九肽可由东海乌参蛋白、其他海参及水产动物蛋白经适合的酶解技术制备而成。6.一种促睾酮合成的九肽的应用，其特征在于，包括：本发明的一种促睾酮合成的九肽既可以化学合成，也可以从东海乌参蛋白酶解产物或其他海参和水产动物蛋白酶解物中定向制备，可以单独应用于改善睾酮合成不足的食品及药品，也可以与其他具有调节睾酮合成的活性组分进行复配使用，还可以制备成微胶囊，以改善九肽的胃肠道消化稳定性、生物利用度和延缓保质期，使其更好的应用于食品工业和医药工业领域。7.根据权利要求6所述的一种促睾酮合成的九肽的应用，所述调节睾酮合成的活性组分可以包括植物提取物(枸杞、肉苁蓉、杜仲叶、玛咖、人参、桑葚等)、维生素(例如维生素d)、多酚类及其他的蛋白肽。8.根据权利要求6所述的一种促睾酮合成的九肽的应用，所述的药物和食品是饮料、口服液、胶囊、微胶囊粉、片剂、颗粒或者乳液。

技术总结
本发明涉及生物活性肽相关技术领域，公开了一种具有促进睾酮合成活性的九肽及其应用，所述九肽的一级结构氨基酸序列为Gly-Pro-Tyr-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Arg，分子量为809.422Da。本发明的九肽既可以化学合成，也可以从东海乌参蛋白酶解产物或其他海参和水产动物蛋白酶解物中定向制备。本发明的九肽具有促进睾酮合成活性，主要体现在能够显著提高TM3睾丸间质细胞合成睾酮，增加细胞Lhcgr，Cacna1g，Plcg，Prkaca，StAR的基因表达，可直接用于预防和改善睾酮分泌不足现象的食品或药物中。物中。物中。


技术研发人员：冯凤琴 骆贤亮
受保护的技术使用者：浙江诺衍生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/10/6