基因Ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株及其在制备疫苗中的应用

基因ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株及其在制备疫苗中的应用
技术领域
1.本发明涉及一株基因ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株及其在制备疫苗中的应用，本发明属于生物制品技术领域。


背景技术：

2.近年来，禽呼肠孤病毒(avian reovirus，arv)感染呈上升趋势，该病传播速度快、发病范围广，不同日龄、不同品种的鸡均可感染，该病常引起混合感染或继发感染，死亡率高达30％～50％，给我国肉鸡养殖业带来巨大经济损失。
3.arv是无囊膜的dsrna病毒，其基因组由10个节段组成，与其他基因节段相比，s1基因片段中的σc基因的非同义替换率高于同义替换率，说明σc基因及其编码蛋白的进化速率高于其他基因节段。因此，σc基因常作为arv流行毒株分型的依据，根据其遗传进化分析，arv毒株可分为6种基因型，当前市售疫苗株均来源于基因ⅰ型毒株(如s1133、1733和2408)。
4.疫苗免疫是防控该病的有效途径，然而长期的疫苗免疫压力及现行的集约化养殖密度导致arv变异株不断出现，有研究报道，当前市售疫苗并不能为这些变异毒株提供完全免疫保护。因此，亟待开展我国当前arv变异株流行情况调查，了解其生物学特征和致病特点，为arv综合防控提供指导。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一在于提供一株基因ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株；
6.本发明的目的之二在于提供该基因ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株在制备灭活疫苗中的应用。
7.为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
8.2020年，在江苏省某肉鸡企业(已接种市售arv疫苗)中，多批已产生高水平arv抗体的商品肉鸡仍出现跛行、跗关节肿胀/变形等典型arv特征症状，本发明发明人利用lmh细胞(leghorn male chicken hepatocellular carcinoma，lmh)成功分离到了一株禽呼肠孤病毒株(arv-js20-9304)，并揭示了其生物学特性和遗传特征。σc基因遗传进化分析显示，本发明分离的arv-js20-9304株为arv变异株，与已报道的基因ⅳ型参考株avs-b和k1600657同源性最高，处于同一进化分支，而与arv其它基因型毒株同源性较低；与疫苗株s1133核苷酸序列及其编码氨基酸序列同源性分别为55.5％和49.2％，提示该分离毒株与市售疫苗株之间存在较大的抗原变异。据报道，当毒株和疫苗毒株之间的氨基酸差异达到或超过5％时，交叉保护作用就会减弱。本发明鉴定的arv-js20-9304变异株与当前使用商品化疫苗毒株s1133主要保护性抗原σc基因编码的氨基酸序列同源性较低，存在明显的抗原性差异，我们通过进一步的攻毒保护试验，验证该变异株已逃逸现有疫苗的保护。lmh细胞传代培养结果表明，该变异株能够在lmh细胞上良好增殖，产生典型的细胞融合病变，病毒复制滴度较高，感染后60h可达到10
7.0
tcid
50
/100μl以上。该变异株对鸡胚和spf雏鸡均具有明显的致病性，可引起接种鸡胚在5天内全部死亡，接种1日龄spf雏鸡100％发病，爪垫红
肿呈紫红色，75％鸡只出现死亡。当前市售疫苗对于本次分离的基因ⅳ型毒株arv-js20-9304保护效果较差，不能提供完全保护。本发明将分离得到的arv-js20-9304毒株制备灭活疫苗免疫spf鸡，攻毒后连续观察10天，每日观察鸡只临床症状并记录发病情况。实验结果发现，灭活疫苗免疫组在整个观察期内，鸡只未出现任何发病状态，所有鸡只精神状态良好，爪垫也未出现任何肿胀状态；而攻毒对照组在攻毒后2天开始发病，发病持续整个观察期，发病鸡表现为精神萎靡、食欲减退以及爪垫严重肿胀等临床症状，随着感染时间延长，部分鸡出现跛行、无法站立等现象。以上结果表明，arv-js20-9304毒株制备灭活疫苗可为同基因型强毒提供完全保护，该毒株有望作为当前鸡呼肠孤病毒新基因型疫苗储备研究的候选疫苗株。
9.在上述研究的基础上，本发明提出了一株基因ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株，命名为arv-js20-9304，分类命名为禽呼肠孤病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为：cgmcc no.45564，保藏时间为：2023年4月25日。
10.进一步的，本发明还提出了所述的基因ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株在制备预防禽呼肠孤病毒病药物中的应用。
11.其中，优选的，所述的药物为禽呼肠孤病毒灭活疫苗。
12.再进一步的，本发明还提出了一种禽呼肠孤病毒灭活疫苗，所述灭活疫苗的有效成分为灭活后的本发明所述的基因ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株。
13.更进一步的，本发明还提出了一种制备所述的禽呼肠孤病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤：
14.向所述的基因ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株的f6代病毒培养液中，加入1
‰
体积比的甲醛，混合均匀，置于37℃，每1h转动混匀1次，放置24h，得到灭活病毒液；将5％吐温-80与灭活病毒液按照体积比1：20混匀，混匀后再与白油按体积比1:1.5乳化，乳化的具体操作为：先把白油加入乳化瓶中乳化30s，再沿着乳化头缓慢加入病毒混合液，注意不要产生气泡。乳化器调到6档，乳化3min/次，重复三次，乳化后的样品滴至水中，乳化滴5-10s不散开即可。
15.相较于现有技术，本发明的有益效果是：
16.本发明从我国江苏省某企业送检的病鸡关节组织中成功分离到1株禽呼肠孤病毒，将其命名为arv-js20-9304，该毒株纯净性良好。σc基因遗传进化分析结果表明，该分离病毒位于arv基因ⅳ型分支，与基因ⅳ型参考毒株k1600657和avs-b遗传距离较近，氨基酸序列同源性分别为81.7％和79.2％，而与其他基因型分离毒株遗传距离较远。该分离毒株在lmh细胞上增殖良好；对鸡胚和雏鸡均具有明显的致病性，可引起接种鸡胚100％死亡，接种1日龄spf雏鸡100％死亡，其中感染后第4d，spf鸡全部死亡，当前市售疫苗对于其保护效果较差，不能提供完全保护。将本发明分离得到的arv-js20-9304毒株制备灭活疫苗免疫spf鸡，攻毒后连续观察10天，每日观察鸡只临床症状并记录发病情况。实验结果发现，灭活疫苗免疫组在整个观察期内，鸡只未出现任何发病状态，所有鸡只精神状态良好，爪垫也未出现任何肿胀状态，表明arv-js20-9304毒株制备灭活疫苗可为同基因型强毒提供完全保护。因此，本发明的提出为当前鸡呼肠孤病毒新基因型疫苗储备研究提供了新的候选疫苗株，同时也为了解我国arv变异株的流行及遗传进化特征提供了重要的理论依据。
ttaagtatcgatgcccgtacgcacggttatg-3'，seq id no.2所示)，以上述cdna为模板，进行σc基因的扩增。pcr反应条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min，预期扩增长度为981bp。将σc基因扩增片段胶回收、连接至pmd18-t载体并转化至e.coli dh5α，筛选阳性克隆进行测序。
39.1.5分离病毒的σc基因的同源性及遗传进化分析
40.使用dnastar、mega6.0等分子生物学软件对分离毒株的σc基因核苷酸序列进行遗传进化和同源性分析。所用参考毒株及其genbank登录号见表1。
41.表1参考毒株及其genbank登录号
[0042][0043][0044]
1.6分离病毒的纯净性检测
[0045]
利用常规方法抽提分离病毒f4代病毒培养液的dna和rna，并将rna反转录为cdna。利用相应病毒的检测引物，运用pcr和pt-pcr技术检测所分离的arv中是否存在支原体和常见的禽类病毒，包括ⅰ群禽腺病毒(fadv)、血清ⅰ型马立克氏病病毒(mdv)、传染性贫血病毒(ciav)、网状内皮增生症病毒(rev)、禽偏肺病毒(ampv)、禽白血病病毒(alv)和传染性法氏囊病毒(ibdv)。
[0046]
1.7分离病毒的体外复制动力学测定
[0047]
将分离病毒f4代病毒液按10-1
～10-8
梯度进行倍比稀释，接种至铺有单层lmh细胞的96孔板中，每孔接种100μl病毒稀释液，每个稀释度做16个重复，同时设立未接毒细胞对照，随后置于37℃、5％co2培养箱中培养，5d后观察细胞病变，按照reed-muench法计算其tcid
50
。将上述病毒以10
4.0
tcid
50
剂量接种于25cm2细胞培养瓶的lmh细胞进行培养，分别在12h、24h、36h、48h、60h、和72h收集1ml细胞培养液，按照上述方法对各个时间点样品进行tcid
50
的测定，绘制一步生长曲线。
[0048]
1.8分离病毒致病性试验
[0049]
将f4代分离病毒液以10
4.0
tcid
50
剂量经卵黄囊接种10枚7日龄spf鸡胚，对照组以相同方式接种等体积pbs，接种后置于37℃培养箱培养，剔除24h内死亡的鸡胚，观察并记录每天鸡胚死亡数，并绘制鸡胚存活曲线。
[0050]
取30只1日龄spf鸡，随机分为2组，每组15只，对其中一组接种10
6.0
tcid
50
的arv分离病毒，接种方式为单侧爪垫接种，即在每只鸡左侧爪垫接种，以右侧爪垫为自身对照，对照组以同样方式接种等体积pbs。每组15只鸡均以脚号标记，每日观察记录spf雏鸡的发病和死亡情况，并绘制spf雏鸡存活曲线。
[0051]
1.9市售疫苗对分离病毒免疫保护试验
[0052]
取20只3w龄spf鸡，分为3组，1组为免疫组(10只)，2组为免疫对照组(5只)，3组为攻毒对照组(5只)。1组在3w龄时通过颈部皮下接种市售arv灭活疫苗，6w龄进行第二次免疫，2组以同样方式接种等体积pbs；9w龄时，以10
4.5
tcid
50
的arv分离病毒对1组和2组进行攻毒，接种方式为单侧爪垫接种，即在每只鸡左侧爪垫接种，以右侧爪垫为自身对照，攻毒对照组以同样方式接种等体积pbs。攻毒后连续观察10日，每日观察记录spf鸡的发病情况，并绘制spf鸡保护率曲线。
[0053]
1.10灭活疫苗的制备
[0054]
将1.3中分离病毒以10％v/v的比例接种在鸡胚成纤维细胞中，培养至84h时，待细胞病变达80％以上即可收毒，记为f1代，以同样的方式在鸡胚成纤维细胞上进行连续传代至f6代，测定其效价，并将其调整为10
6.0
tcid
50
/0.1ml。向调整好效价的f6代分离病毒的培养液中，加入1
‰
(体积比)甲醛，混合均匀，置于37℃，每1h转动混匀1次，放置24h。将5％吐温-80与灭活病毒液按照体积比1:20混匀，混匀后再与白油按体积比1:1.5的比例进行乳化。乳化的具体操作为：先把白油加入乳化瓶中乳化30s，再沿着乳化头缓慢加入病毒混合液，注意不要产生气泡。乳化器调到6档，乳化3min/次，重复三次，乳化后的样品滴至水中，乳化滴5-10s不散开即可。
[0055]
1.10.1灭活疫苗的安全性检验
[0056]
试验组用7日龄spf鸡10只，每只腿部肌肉注射1.10制备的灭活疫苗1.0ml，同时设对照5只，对照组以相同途径接种等体积不含病毒的乳化佐剂，在相同的条件下饲养，连续观察14日，观察试验鸡采食、饮水及临床情况。
[0057]
1.10.2灭活疫苗的效力检验
[0058]
将1.10制备的乳化灭活疫苗，按照1ml/只剂量，经腿部肌肉注射，接种10只3周龄spf鸡作为试验组，同时设置未免疫对照组5只，对照组以相同途径接种等体积不含病毒的乳化佐剂。分别于免疫后1w，2w，3w采血分离血清，并对抗体水平进行检测。
[0059]
1.10.3灭活疫苗的攻毒保护试验
[0060]
免疫后3w，用f6代分离病毒对效力检验中spf鸡进行攻毒保护试验，攻毒剂量为10
4.5
tcid
50
，接种方式为单侧爪垫接种，即在每只鸡左侧爪垫接种，以右侧爪垫为自身对照，未免疫对照组以同样方式攻毒相同剂量的病毒液。攻毒后连续观察10日，每日观察记录spf鸡的发病情况，统计保护率。
[0061]
2结果
[0062]
2.1病毒分离
[0063]
将过滤后的组织研磨液接种lmh细胞，f1代无明显细胞病变，从f2代开始出现细胞病变，随着培养时间的增加，细胞病变越来越明显，形成明显合胞体形态，随后细胞开始出现网格状脱落，悬浮在培养液中；培养至84h时，细胞病变可达90％以上(图1)。
[0064]
2.2分离病毒的rt-pcr鉴定
[0065]
利用1.4中设计合成的gc4f/gc4r引物进行σc基因扩增，电泳结果显示，从病毒分离液中可扩增到一条与阳性对照(arv-heb02)大小相当的特异性条带(约为1000bp)，与预期大小一致，而阴性对照无此特异性条带，初步确定病毒分离成功(图2)，将其命名为arv-js20-9304，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：cgmcc no.45564，保藏时间为：2023年4月25日。
[0066]
2.3分离病毒σc基因同源性及遗传进化分析
[0067]
利用dnastar软件，对arv-js20-9304株及arv各基因型参考毒株σc基因核苷酸及其编码氨基酸同源性进行比对。结果显示，arv-js20-9304株与基因ⅳ型代表株avs-b(2010年，匈牙利)和k1600657(2019年，美国)同源性最高，其中与avs-b株核苷酸序列及其编码氨基酸序列同源性分别为75.8％和79.2％，与k1600657株核苷酸序列及其编码氨基酸序列同源性分别为76.5％和81.7％；而与arv其它基因型毒株同源性较低，核苷酸序列同源性为54.3％～66.0％，编码氨基酸序列同源性为45.3％～64.8％；该分离毒株与疫苗株s1133核苷酸序列及其编码氨基酸序列同源性分别为55.5％和49.2％。综上，根据同源性比对结果初步判定arv-js20-9304分离株属于arv基因ⅳ型。σc基因核苷酸序列遗传进化分析结果显示，arv-js20-9304株与基因ⅳ型代表株avs-b、k1600657处于同一进化分支，遗传距离较近(图3)，而与基因ⅰ型疫苗株s1133、1733和2408遗传距离较远，处于不同的进化分支，遗传进化分析结果再次证实该分离病毒属于arv基因ⅳ型变异株。
[0068]
2.4分离病毒外源病毒检测
[0069]
利用pcr或rt-pcr方法对arv-js20-9304病毒培养液分别进行支原体、mdv、ciav、fadv、rev、ampv、alv、ibdv和arv检测，结果显示，在arv rt-pcr扩增产物中存在特异性条带，判定为阳性，而其它病原扩增产物中均无相关特异性条带(图4)，均判定为阴性，表明该分离病毒纯净性良好。
[0070]
2.5分离病毒体外复制动力学测定
[0071]
根据arv-js20-9304感染lmh后不同时间点取样的tcid
50
效价测定结果，绘制了该毒株的复制动力学曲线(图5)。从图中可以看出，随着接毒时间的推进，病毒复制滴度逐渐升高，其中，接毒后12h内为潜伏期，其病毒滴度几乎没有变化，此后，病毒开始进入对数生长期，12～24h之间复制较快，为复制对数期，在接毒后60h时，病毒复制滴度达到最高值，以上结果表明，arv-js20-9304毒株能在lmh细胞上进行良好增殖且复制滴度较高，在感染后60h时可达到10
7.0
tcid
50/
100μl以上。
[0072]
2.6分离病毒致病性试验
[0073]
将arv-js20-9304毒株接种spf鸡胚，可引起鸡胚100％死亡。感染组在感染后第3天(3dpi)开始出现鸡胚死亡，死亡鸡胚胚体发育不良，出血且蜷缩质脆；在6dpi，鸡胚全部死亡，而对照组在整个实验期中未出现鸡胚死亡(图6)。将arv-js20-9304毒株接种1日龄spf雏鸡后，可引起感染组雏鸡100％发病，在3dpi，雏鸡开始出现死亡，感染后第4d雏鸡全部死亡，对spf雏鸡的致死率为100％(图6)，对照组在整个试验期中未见雏鸡发病和死亡现象(图6)。发病鸡表现为精神萎靡、食欲减退以及爪垫严重肿胀等临床症状，随着感染时间延长，部分鸡出现跛行、无法站立等现象。感染雏鸡呈现双爪发红、肿胀等症状。
[0074]
2.7市售疫苗对分离病毒免疫保护试验
[0075]
对已免疫市售疫苗的9w龄spf鸡用arv-js20-9304毒株进行攻毒，连续观察10天,每日观察鸡只临床症状并记录发病情况。凡出现爪垫红肿、关节肿胀、跛行、精神沉郁以及食欲降低等症状，且同一只鸡连续5天出现发病症状者，记为发病。免疫组spf鸡在2dpi开始发病，在4dpi发病率达到100％，发病持续整个观察期；未免疫组spf鸡在1dpi开始出现发病现象，在2dpi发病率达到100％，发病持续整个观察期(图7)，对照组在整个试验期中未见spf鸡发病和死亡现象(图7)。发病鸡表现为精神萎靡、食欲减退以及爪垫严重肿胀等临床症状，随着感染时间延长，部分鸡出现跛行、无法站立等现象。直至观察期结束，爪垫症状仍呈现肿胀状态(图8)。结果显示，当前市售疫苗对于本次分离的基因ⅳ型毒株arv-js20-9304保护效果较差，不能为其提供完全保护。这说明当前市售疫苗和arv-js20-9304株之间的交叉保护性较差，也说明本研究中所分离到的鸡呼肠孤病毒毒株已出现明显的抗原变异，与现有市售疫苗株有着显著的差异，因此对于现阶段我国鸡呼肠孤病毒的疫苗预防中，应加快基因iv型疫苗株储备研究。
[0076]
2.8灭活疫苗的安全性检验
[0077]
将1.10制备的灭活疫苗免疫7日龄spf鸡，结果表明，试验组和对照组鸡只发育正常，精神状态良好，剖检试验组发现注射部位疫苗吸收良好，无红肿、组织坏死等炎症反应。说明试制疫苗安全无害，对动物生长无影响。
[0078]
2.9灭活疫苗的效力检验
[0079]
将1.10制备的灭活疫苗免疫spf鸡可诱导产生较好的抗体水平，随着免疫时间的推进，抗体水平逐渐升高，免疫后3周，平均抗体水平可达到6000以上；结果表明，该毒株具有良好的免疫原性，可用于制备灭活疫苗，为我国养禽场对该病的综合防控提供基础。
[0080]
2.10灭活疫苗的攻毒保护试验
[0081]
将1.10制备的灭活疫苗免疫spf鸡，攻毒后连续观察10天，每日观察鸡只临床症状并记录发病情况。凡出现爪垫红肿、关节肿胀、跛行、精神沉郁以及食欲降低等症状，且同一只鸡连续5天出现发病症状者，记为发病。灭活疫苗免疫组在整个观察期内，鸡只未出现任何发病状态，所有鸡只精神状态良好，爪垫也未出现明显肿胀状态；而攻毒对照组在攻毒后2天开始发病，发病持续整个观察期，发病鸡表现为精神萎靡、食欲减退以及爪垫严重肿胀等临床症状，随着感染时间延长，部分鸡出现跛行、无法站立等现象。以上结果表明，arv-js20-9304毒株制备灭活疫苗可为同基因型强毒提供完全保护，该毒株有望作为当前鸡呼肠孤病毒新基因型疫苗储备研究的候选疫苗株。

技术特征：
1.一株基因ⅳ型禽呼肠孤病毒(avianreovirus，arv)变异株，命名为arv-js20-9304，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：cgmccno.45564。2.权利要求1所述的基因ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株在制备预防禽呼肠孤病毒病药物中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为禽呼肠孤病毒灭活疫苗。4.一种禽呼肠孤病毒灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗的有效成分为灭活后的权利要求1所述的基因ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株。5.一种制备权利要求3所述的禽呼肠孤病毒灭活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：向权利要求1所述的基因ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株的f6代病毒培养液中，加入1
‰
体积比的甲醛，混合均匀，置于37℃，每1h转动混匀1次，放置24h，得到灭活病毒液；将5％吐温-80与灭活病毒液按照体积比1：20混匀，混匀后再与白油按体积比1:1.5进行乳化，乳化的具体操作为：先把白油加入乳化瓶中乳化30s，再沿着乳化头缓慢加入病毒混合液，注意不要产生气泡，乳化器调到6档，乳化3min/次，重复三次，乳化后的样品滴至水中，乳化滴5-10s不散开即可。

技术总结
本发明公开了一株基因Ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株及其在制备疫苗中的应用。所述的基因Ⅳ型禽呼肠孤病毒变异株，命名为ARV-JS20-9304，其保藏号为：CGMCCNO.45564。将本发明分离得到的ARV-JS20-9304毒株制备灭活疫苗免疫SPF鸡，攻毒后连续观察10天，每日观察鸡只临床症状并记录发病情况。实验结果发现，灭活疫苗免疫组在整个观察期内，鸡只未出现任何发病状态，所有鸡只精神状态良好，爪垫也未出现任何肿胀状态，表明ARV-JS20-9304毒株制备灭活疫苗可为同基因型强毒提供完全保护。本发明的提出为当前鸡呼肠孤病毒新基因型疫苗储备研究提供了新的候选疫苗株，同时也为了解我国ARV变异株的流行及遗传进化特征提供了重要的理论依据。的流行及遗传进化特征提供了重要的理论依据。的流行及遗传进化特征提供了重要的理论依据。


技术研发人员：高立 高玉龙 李凯 刘长军 祁小乐 张艳萍 崔红玉 王素艳 陈运通
受保护的技术使用者：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）
技术研发日：2023.06.21
技术公布日：2023/10/6