IFITM1基因与猪间性病相关的SNP分子标记、引物及应用

5group a member 1，nr5a1；又称类固醇合成因子1，steroidogenic factor-1，sf1)基因c.274c》t(p.arg92trp)的杂合突变导致sf1抑制雌性分化过程中关键分子的功能，如β-catenin和核受体亚家族0组b成员1基因(nuclear receptor subfamily 0group b member 1，nr0b1)由于错义突变引起人类46,xx-ot/t-dsd。在46,xx-t-dsd(sry-)患者中，发现了腺肌肉瘤相关基因1(wilms tumor associated gene 1，wt1)的一个杂合移码突变位点，通过建立晶体学模型进行分析，发现该突变为有害突变，导致wt1蛋白第四锌指区(the fourth zinc finger，zf4)失活。随后，eozenou等进一步在wt1基因发现了5个杂合突变，它们分别是p.ser478thrfs*17、p.pro481leufs*15、p.lys491glu、p.arg495gln和p.arg495gly。这些突变能使睾丸支持细胞相关的转录因子在人类卵巢细胞中上调表达，而且wt1arg495gly/arg495gly的雌性小鼠启动xx个体睾丸形成，是导致46,xx-ot/t-dsd的原因。在研究猪xx-ot/t-dsd(sry-)方面，rousseau等发现在xx-dsd猪中，包含9个snp的单倍型频率升高，与xx-dsd猪相关最显著的是位于sox9下游约148kb的snp rs81341093(m1ga0024789)。但在随后在的研究中，却发现这个位点与猪xx-ot/t-dsd并没有关联性。因此，与猪xx-ot/t-dsd紧密相关的snp标记有待进一步挖掘。
5.前人研究表明，干扰素诱导跨膜蛋白家族(interferon-inducibletransmem braneprotein families，ifitms)在抑制细胞增殖、促进同型细胞粘附和介导生殖细胞发育等方面发挥着重要作用。性腺由生殖细胞和体细胞共同形成，外胚层的原始生殖细胞通过主动迁移至由中胚层分化的性腺中，共同组成生殖嵴。原始生殖细胞属于生殖细胞谱系，其迁移对自身生存和分化起到重要的作用，原始生殖细胞迁移的缺陷可能导致不育。其中，扰素诱导的跨膜蛋白1基因(interferon-inducible transmembrane protein-1，ifitm1)具有抗增殖与促进同类型细胞粘附的作用，在胚胎发育时期能够表达能够促进器官的发育。在斑马鱼和大鼠中，ifitm最初在原肠发育和早期器官发生过程中表现出动态的时空表达模式。ifitm1在近端上胚层的表达，表达于外胚层、中胚层和原始生殖细胞，随后ifitm1只在中胚层旁表达，而不在原始生殖细胞中表达，说明小鼠ifitm1是原始生殖细胞从中胚层向内胚层迁移所必要的，在器官发生过程中起着重要作用。此外，ifitm1基因作为wnt/β-catenin信号通路的下游靶点，ifitm1干扰能造成胚胎畸形。但目前尚未有ifitm1基因与猪间性病相关研究的报道。有鉴于此，本发明对ifitm1基因展开研究，提供一种ifitm1基因的与猪间性病相关的分子标记及其引物。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记、引物及应用，该snp分子标记与猪间性病性状密切相关，通过本发明公开的引物检测snp位点，能对携带致病基因的个体进行筛选，用于种猪育种选择，预防猪间性病的传播。
7.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
8.一种ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记，该分子标记的核苷酸序列为seq id no:1，所述snp分子标记的核苷酸序列中第32个碱基y处为多态位点；在该多态位点处，基因型为tt和tc的个体表现为间性病特征，基因型为cc的个体无间性病特征；所述snp分子标记位于猪2号染色体的ifitm1基因中第2个外显子。
9.具体的，ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记的核苷酸序列seq id no:1
为：gcgagggaccggaagatggtgggagacatcay(t/c)tggggcccagagctatgcctccaccgccaagtgcctgaacatctgggctctgatcctgggcctcattctgaccatcggagccactgttcttctggtgtttgtatacataacagcctaccatatgttagagcgcgcaaagagtaacagaggctactag。
10.根据本发明的是实施例，在snp分子标记的多态位点处，基因型tt和tc的个体表现为间性病特征；在snp分子标记的多态位点处的基因型为cc的个体性别发育正常，因此，该snp分子标记与38,xx-dsd猪的发生密切关联。具体的，该snp分子标记的多态位点，突变导致碱基c突变为碱基t，即极性氨基酸苏氨酸(thr)变成非极性氨基酸异亮氨酸(iie)，则错义突变导致猪群发生异常。在种猪选育工作中，剔除该snp分子标记基因型为tt和tc的个体，预防种猪群中间性病的发生。因此，ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记用于种猪选育，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。
11.本发明还提供一种ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记的引物，该引物用于扩增上述的ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记，该引物包括上游引物和下游引物：
12.上游引物f1：5
’‑
tcacccttgggactcagacc-3’，
13.下游引物r1：5
’‑
agtgtggatggtgggggac-3’。
14.根据本发明的实施例，利用上述引物对待测种猪的dna进行pcr扩增，扩增出目的snp分子标记片段，通过凝胶电泳检验是否成功扩增。若成功则送去进行sanger测序，根据测序结果判断突变位点的基因型，有效确定该种猪是否携带致病基因。由此，用于检测上述snp分子标记的引物对，能够有效用于种猪早期筛选即种猪选育，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地筛选种猪优良品种。
15.本发明提供的技术方案可以包括以下有益效果：
16.本发明利用高通量10
×
genomics(60
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)测序技术，结合从头组装(de novo)方法进行基因组变异检测，该方法相比于重测序方法能克服多重比对问题，具有更强的特异性，对高变区检测具有更强的敏感性，因而能够捕获更多且更加可靠的snp信息，进而得到ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记。将该分子标记应用于种猪的选择育种，利用分子技术筛选剔除疑似有害个体，有助于预防猪群间性病的发生，以达到种源优化的目的，该筛选个体的不受年龄和性别的限制。
17.本发明中，以pcr-rflp鉴别snp分子标记，snp分子标记中的核苷酸的突变位点是酶切位点，根据电泳结果即可得出被检测个体的基因分型，应用于种猪育种的操作便捷、时间短、灵敏度高，检测结果更直观。
附图说明
18.图1是本发明实施例1中的测序峰图；
19.图2是本发明实施例3中的限制性内切酶的识别位点的示意图；
20.图3是本发明实施例3中的电泳结果图。
具体实施方式
21.下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文
献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
22.实施例1snp分子标记的筛选
23.对2头xx-dsd猪和1头正常母猪的耳组织dna提取及质量检测，用于检测不含sry基后进行基因组测序。然后采用10
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genomics测序技术，测序深度为60
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，对基因组进行从头组装变异解析，运用trimmomatic v0.38软件对下机数据进行过滤，利用soap-denovo对测序数据进行组装，采用busco软件对基因组的组装进行评估。将soapdenovo进行组装得到长序列片段，采用lastz软件与参考基因组(sscrofa 11.1)进行比对，获得相应snps位点。
24.按照常染色体隐性遗传模式筛选，以正常母猪为对照，与xx-dsd猪进行对比，从非同义突变中对snps位点进行筛选，所得的snp位点经go和kegg分析，并结合已有的转录组测序数据进一步分析。分析结果得到一个snp位点在猪2号染色体的ifitm1基因中第2个外显子的第32个碱基处，具有t/c多态性，从而使ifitm1基因第2个外显子的即seq id no:1所述的序列产生多态性。
25.本发明所述的snp分子标记的seq id no:1序列为：
26.gcgagggaccggaagatggtgggagacatcay(t/c)tggggcccaga gctatgcctccaccgccaagtgcctgaacatctgggctctgatcctgggcc tcattctgaccatcggagccactgttcttctggtgtttgtatacataacagc ctaccatatgttagagcgcgcaaagagtaacagaggctactag。
27.本发明所述snp分子标记的snp位点(多态位点)位于上述序列中的第32个碱基y处，具有t或c的核苷酸多态性。在xx-dsd猪中，所述snp位点为t或者杂合的tc；在正常母猪中，所述的snp位点为c。因此，基于ifitm1基因在介导生殖细胞发育方面发挥着重要作用，推测ifitm1的突变干扰了wnt/β-catenin信号或者原始生殖细胞发生迁移错误，从而导致xx-dsd猪的发育异常，进而推测所述snp位点可能与猪间性病的发生有关，可作为育种工作中预防间性病发生的snp分子标记。
28.实施例2扩大种群验证上述的snp分子标记
29.因xx-dsd猪属于罕见的先天性疾病，对随机收集32头正常母猪和32头xx-dsd，取耳组织提取dna。根据本发明snp分子标记，设计特异性引物f1和r1，进行snp标记pcr检测，pcr产物送往上海生工进行sanger测序，分析snp标记基因型在xx-dsd猪和正常母猪中的分布情况，结果为tt基因型频率为87％，tc基因型频率为13％。本实施例的具体操作步骤如下：
30.(1)引物设计：根据snp分子标记的多态性信息，设计特异性引物对，上游引物f1和下游引物r1的核苷酸序列如下：
31.上游引物f1：5
’‑
tcacccttgggactcagacc-3’，
32.下游引物r1：5
’‑
agtgtggatggtgggggac-3’。
33.(2)用前述提取xx-dsd猪和正常母猪样本dna为模板，使用上述设计的特异性引物对进行pcr扩增，pcr反应体系配制如表1，反应体系总体积为20.0μl。pcr扩增程序为：95℃预变性5min；经历35循环，每个循环包括95℃变性15s、60℃退火15s和72℃延伸1min；72℃延伸5min。
34.表1pcr反应体系
[0035][0036]
(3)扩增所得pcr产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后进行sanger测序，分析测序结果，判读在seq id no:1第32位碱基的t/c多态性和分析其基因型的分布情况。其中，测序峰图如图1所示，测序分析结果得出，seq id no:1第32位碱基处的tt和tc基因型是xx-dsd猪特有的，其中tt基因型频率为87％，tc基因型频率为13％；同时seq id no:1第32位碱基的cc基因型仅出现在正常母猪中。该snp位点的突变导致极性氨基酸的苏氨酸(thr)变为非极性氨基酸的异亮氨酸(iie)。
[0037]
根据上述扩大群验证可知，采用本发明的特异性引物对能准确对ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记进行验证，该特异性引物对可靠性高。采用本发明的特异性引物对应用于终于选育，能准确筛选出携带致病基因的种猪。具体的，在育种工作中，剔除snp位点为tt和tc基因型的种猪，不能作为亲本，而选用基因型为cc的种猪进行培育，能有效防止猪间性病的传播。
[0038]
实施例3对snp分子标记的snp位点进行检测的方法
[0039]
本发明采用pcr-rflp对snp分子标记的snp位点进行检测的方法进行检测，pcr-rflp(限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术)是用特异设计的pcr引物扩增目标材料时，由于特定位点的碱基突变、插入或缺失数很少，以至无多态出现，往往需要对相应pcr扩增片段进行酶切处理，以检测其多态性，即根据限制性内切酶识别序列的位置和数量，可以把大小相似而序列有差异dna切割成不同的片段，通过核酸电泳，将长度不等的dna片段分离而显出其片段的大小。
[0040]
本实施例中，通过snapgene软件查找seq id no:1序列找出限制性内切酶bsrⅰ，当seq id no:1第32位碱基处为c时，限制性内切酶bsrⅰ可以识别；当seq id no:1第32位碱基处为t时，限制性内切酶bsrⅰ不可以识别。bsrⅰ的识别序列如图2所示，图中的箭头为限制性内切酶bsrⅰ酶切位点，“n”代表任何脱氧核糖核苷酸。
[0041]
将实施例2中以上游引物序列f1和下游引物序列r1扩增出的片段进行酶切分析，酶切配置体系如表2所示，反应体系总体积为25.0μl。混合体系在65℃、水浴温孵1.5h后，凝胶电泳。
[0042]
表2酶切反应体系
[0043]
[0044][0045]
本实施例中对上述的酶切体系进行2.0％琼脂糖凝胶电泳，以120v电压电泳50min，电泳结果如图3所示。在电泳照片中，cc基因型个体的pcr扩增产物的酶切产物有两条带，分别为344bp和199bp；tc基因型个体的pcr扩增产物的酶切产物有三条带，分别为543bp、344bp和199bp；tt基因型个体的pcr扩增产物的酶切产物有一条带，为543bp。可见，通过电泳结果即可获得基因分型，本发明的snp分子标记及其引物应用于种猪育种的操作便捷、时间短、灵敏度高，检测结果更直观。
[0046]
根据本发明实施例的一种ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记、引物及应用的其他构成等以及操作对于本领域普通技术人员而言都是已知的，这里不再详细描述。
[0047]
在本说明书的描述中，参考术语“实施例”、“示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0048]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.一种ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记，其特征在于，该分子标记的核苷酸序列为seq id no:1，所述snp分子标记的核苷酸序列中第32个碱基y处为多态位点；在该多态位点处，基因型为tt和tc的个体表现为间性病特征，基因型为cc的个体无间性病特征；所述snp分子标记位于猪2号染色体的ifitm1基因中第2个外显子。2.权利要求1所述的ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记用于种猪选育。3.一种ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记的引物，其特征在于，该引物用于扩增权利要求1所述的ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记，该引物包括上游引物和下游引物：上游引物f1：5
’‑
tcacccttgggactcagacc-3’，下游引物r1：5
’‑
agtgtggatggtgggggac-3’。4.权利要求3所述的ifitm1基因与猪间性病相关的snp分子标记的引物用于种猪选育。

技术总结
本发明涉及猪选择育种技术领域，尤其涉及一种IFITM1基因与猪间性病相关的SNP分子标记、引物及应用。该分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，所述SNP分子标记的核苷酸序列中第32个碱基Y处为多态位点；在该多态位点处，基因型为TT和TC的个体表现为间性病特征，基因型为CC的个体无间性病特征；所述SNP分子标记位于猪2号染色体的IFITM1基因中第2个外显子。该SNP分子标记与猪间性病性状密切相关，通过本发明公开的引物检测SNP位点，能对携带致病基因的个体进行筛选，用于种猪育种选择，预防猪间性病的传播。的传播。的传播。


技术研发人员：李华 于聪颖 吴金华 钟秉洲 赵海全 于海一 裴杨莉
受保护的技术使用者：佛山科学技术学院
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/10/6