一种用于监测甲基化蛋白质组学中甲基化肽段富集过程的方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种用于监测甲基化蛋白质组学中甲基化肽段富集过程的方法。


背景技术：

2.蛋白质甲基化是众多修饰中最常见且重要的翻译后修饰之一，对细胞生命活动有重要的作用。蛋白质甲基化作为一种重要的可逆的蛋白质翻译修饰类型，他能被甲基转移酶催化并参与生物体内的许多功能和生物过程。甲基化蛋白质组学是主要的研究手段，质谱法是鉴别蛋白甲基化位点和定量甲基化变化的关键工具。甲基化肽段的富集对于成功的甲基化肽质谱分析至关重要。目前蛋白质甲基化主要检测方法有抗体富集方法、染色质免疫共沉淀(chip)、western免疫印迹(western blot)、蛋白芯片等。
3.目前，蛋白质甲基化富集的蛋白初始用量要求为蛋白浓度不少于5mg/ml，蛋白总量不少于4mg，富集后可得到约5μg肽段。由于大多数甲基化肽段富集过程中并不做质控，只在质谱上机后通过鉴定数与富集效率判断此次实验是否成功，因此无法确定是样本本身甲基化修饰蛋白量少还是富集过程导致的富集效率或鉴定数低。质控甲基化肽段富集过程变得极为必要。


技术实现要素：

4.发明目的：为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于监测甲基化蛋白质组学中，甲基化肽段富集过程的方法。
5.技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种用于监测甲基化蛋白质组学中甲基化肽段富集过程的方法，包括以下步骤：
7.1)设置至少两组外源肽段参考品，每组外源肽段参考品至少包含三种不同甲基化修饰位点的肽段，并且对于每一组中每种肽段，在其他各组中均有序列一致，但是同位素标记不同的对应肽段；
8.2)在样品处理过程中，在不同的时间点加入上述不同的外源肽段参考品，且任意两组外源肽段参考品加入的时间点之间，均包括甲基化肽段富集的步骤；
9.3)进样检测，提取处理数据，定量外源肽段参考品，将在前加入的外源肽段参考品的肽段丰度除以在后加入的外源肽段参考品的相同序列肽段的丰度，得到不同甲基化修饰肽段的得率比值，以此评价两个外源肽段参考品加入时间点之间的甲基化富集过程是否合格。
10.该方法用以评估甲基化肽段富集过程中，甲基化富集效率及实验流程是否合格。
11.优选的，步骤1)中，所述不同甲基化修饰位点选自分布在精氨酸、赖氨酸、组氨酸、脯氨酸、丙氨酸和天冬酰胺主链和侧链上的n-甲基化修饰位点，谷氨酸或异天冬氨酸羧基内部和半胱氨酸羧基末端上的o-甲基化修饰位点，半胱氨酸或甲硫氨酸上的s-甲基化修饰
位点，优选分布在赖氨酸残基上的n-甲基化修饰位点。
12.优选的，步骤1)中，所述不同甲基化修饰包括：单、双、三甲基化修饰，优选三条分别包含单甲基化、双甲基化和三甲基化修饰肽段。
13.优选的，步骤1)中，所述同位素标记不同包括：一组中肽段没有同位素标记，其他各组中肽段有同位素标记，但各组用以标记的同位素不相同；或者各组中肽段都有同位素标记，但各组用以标记的同位素不相同。
14.优选的，步骤1)中，所述同位素标记中的同位素包括：12c、13c、14c、14n、15n、16o、18o、1h、2h。
15.优选的，步骤2)中，所述外源肽段参考品加入前进行准确定量，优选加入量一致，或者按比例进行加入。
16.优选的，步骤2)中，所述样品选自细胞、组织、血浆、血清、全血、尿液、脑脊液、唾液、淋巴液、胸腔积水、乳汁、组织液、微生物或植物。
17.优选的，步骤2)中，所述外源肽段参考品加入前进行准确定量，优选加入量一致，或者按比例进行加入。
18.作为具体实施方案，所述甲基化肽段富集的步骤，包括甲基化肽段富集的所有步骤或者部分步骤。即两组外源肽段参考品加入的时间点之间，有的可以包括甲基化肽段富集的所有步骤，有的可以包括甲基化肽段富集的部分步骤。
19.优选的，步骤3)中，所述检测的方法为质谱检测，如lc-ms/ms，maldi-tof。
20.进一步的，步骤3)中，若在前加入的外源肽段参考品是在甲基化肽段富集前或者富集开始时加入，在后加入的外源肽段参考品是在甲基化肽段富集完成时或者富集完成后加入，则将在前加入的外源肽段参考品的肽段丰度除以在后加入的外源肽段参考品的相同序列肽段的丰度，得到不同甲基化修饰肽段的得率比值，以此评价整个甲基化肽段富集过程是否合格。
21.进一步的，步骤3)中，所述在前加入的外源肽段参考品和在后加入的外源肽段参考品，若两者加入时间点之间仅包括甲基化肽段富集过程的部分步骤，则将在前加入的外源肽段参考品的肽段丰度除以在后加入的外源肽段参考品的相同序列肽段的丰度，得到不同甲基化修饰肽段的得率比值，以此评价上述甲基化肽段富集过程的部分步骤是否合格。
22.优选的，步骤3)中，所述提取处理数据，可以使用软件对肽段参考品的肽段进行定性定量数据提取，可使用部分先进质谱检测软件自带的实时鉴定方法，或在获得全数据后进行定性定量数据提取。
23.优选的，步骤3)中，所述提取处理数据，使用蛋白质组分析软件如：proteome discoverer、peaks、dia-nn、spectronaut、maxquant、skyline，将所有定性定量肽段数据进行导出，对导出数据进行手动或编程软件搜索并确定相应肽段丰度。
24.作为优选方案，当外源肽段参考品设置两组时，具体的方法如下：
25.1)准备两组外源肽段参考品a和b，a组外源肽段参考品包含三条不同甲基化修饰位点的肽段，作为检测标品，b组中的三条肽段与a组中肽段序列对应相同，但同位素标记不同，作为标定标品，同位素标记为精氨酸(r)非重标(12c)与13c标记，其甲基化修饰位点为：赖氨酸残基上的n-甲基化修饰位点，在赖氨酸残基上的修饰分别为单、双、三甲基化修饰；
26.2)将两组参考品分开使用，在进行甲基化肽段富集前或富集中检测标品肽段组a
混合加入样本中，富集完成后将标定标品肽段组b混合加入样本中，进样检测；
27.3)使用蛋白质组分析软件proteome discoverer，将所有定性定量肽段数据进行导出，对导出数据进行手动或编程软件搜索并确定相应肽段丰度，根据检测标品肽段组a与标定标品肽段组b比例计算得率，以评价甲基化肽段富集过程是否合格，计算公式为：回收率＝检测标品肽段组a的肽段强度/标定标品肽段组b的肽段强度。
28.有益效果：与现有技术相比，本发明可以有效评估甲基化肽段富集流程是否合格，本方法可以直观、定量评估甲基化肽段富集流程对样本造成的影响，从而评估样本操作过程中甲基化肽段的损失情况，进一步可以指导甲基化肽段富集流程的改良，也可以用于评估不同甲基化肽段富集方法对样本中甲基化肽段富集效果。
附图说明
29.图1：为本发明评估方法的流程示意图。
30.图2：为实施例1的实验流程示意图。
具体实施方式
31.以下对本发明方案进行全面的描述，所述的实施案例是本发明中最优选实施方式，但本发明并不限于以下实施例。
32.实施例
33.1.设置一组肽段包括3个肽段：tpvisgk(me1)pyeyr，tpvisgk(me2)pyeyr，tpvisgk(me3)pyeyr，分别对应赖氨酸的单、双、三甲基化修饰，精氨酸(r)
34.非重标(12c)，命名为检测标品肽段组a；
35.2.相应的同位素标记肽段(r用13c标记)：tpvisgk(me1)pyeyr(13c6)，tpvisgk(me2)pyeyr(13c6)，tpvisgk(me3)pyeyr(13c6)，命名为标定标品肽段组b；
36.3.将检测标品肽段组a及标定标品肽段组b，各组中肽段均按照浓度1:1进行配比，检测标品肽段组a和标定标品肽段组b均稀释到浓度为20ng/μl；
37.4.在蛋白质组样品提取完成后，取4mg蛋白质组样品两组，分别加入100μg胰蛋白酶，用50mmnh4hco3溶液补齐至800μl体系，37℃酶解过夜；
38.5.取spe c18 1ml除盐柱，按如下顺序加入：甲醇1ml，0.1％甲酸1ml*2次，上样*2遍，0.1％甲酸1ml*3次，使用70％乙腈1ml洗脱样品；
39.6.将洗脱样品进行离心真空冷冻干燥；
40.7.向样品管中分别加入5μl 20ng/μl检测标品肽段组a，加入1.4ml iap缓冲液1(50mm mops/naoh ph 7.2，10mm na2hpo4，50mm nacl)混匀；
41.8.4℃10,000g离心5min后收集上清；
42.9.将抗体珠2,000g离心30s，去除珠子中的缓冲液，用1ml 1xpbs洗涤抗体珠4
43.次，每次洗涤后以2,000g离心30s，去除上清；
44.10.将步骤8的上清加入到抗体珠上，在4℃的旋转器上孵育2h；
45.11.2,000g离心30s，去除上清；
46.12.一组用iap缓冲液1，另一组用iap缓冲液2(100mm mops/naoh ph 7.2，20mmna2hpo4，100mm nacl)清洗抗体珠，分别作为样品1和样品2；
47.13.在抗体珠中加入1ml iap缓冲液，倒置管混合5次，2,000g离心30s，去除上清；14.重复步骤13，总共iap缓冲液洗两次；
48.15.向抗体珠中加入1ml 4℃预冷的质谱水，倒置管混合5次，2,000g离心30s，去除上清；
49.16.重复步骤15两次，总共水洗三次；
50.17.向抗体珠中加入55μl 0.15％ tfa，敲击管底几次，室温静置10min，每2-3min轻轻用移液器搅拌一次；
51.18.2,000g离心30s，收集上清；
52.19.向抗体珠中加入50μl 0.15％ tfa，重复步骤17的离心/洗脱步骤，将上清液与步骤
53.18收集的上清合并；
54.20.将合并后的上清使用spe c18 1ml除盐柱，按如下顺序加入：甲醇1ml，0.1％甲
55.酸1ml*2次，上样*2遍，0.1％甲酸1ml*3次，使用70％乙腈1ml洗脱样品；21.将洗脱样品进行离心真空冷冻干燥；
56.22.向样品中分别加入5μl 20ng/μl标定标品肽段组b，加入15μl 0.1％甲酸水混匀；23.分别进样15μl至液相质谱进行150min dda数据采集，液相质谱为thermou3000+hf进行检测；流动相a为2％乙腈、0.1％甲酸水溶液，流动相b为80％乙腈和0.1％甲酸水溶液；设置梯度为0-5min，3％ b，5-140min，3％-90％ b，140-150min，90％-3％ b；
57.24.本实例使用proteome discoverer软件对数据进行抽提，固定化修饰为半胱氨酸的烷基化修饰，可变修饰为赖氨酸的单、双、三甲基化修饰，导出peptide定性定量数据
58.表，快速从表中提取得到两组肽段在2个样本中丰度如下表：
59.表1.3个肽段标品的定量信息
[0060][0061][0062]
表2.样品1、2中抽提部分样品肽段定量信息
[0063][0064]
通过表1的肽段定量数据，发现样品1中赖氨酸的三种甲基化肽段定量回收率明显偏小；且通过表2，对比样品1与样品2中相同肽段定量值可知，样品1中的甲基化肽段回收比例仅为样品2的50％左右，说明在使用抗体珠进行甲基化肽段富集流程中，使用不同盐浓度的缓冲液清洗抗体珠对甲基化肽段进行富集的效果有影响，需要优化清洗缓冲液盐浓度以增加富集效果。

技术特征：
1.一种用于监测甲基化蛋白质组学中甲基化肽段富集过程的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)设置至少两组外源肽段参考品，每组外源肽段参考品至少包含三种不同甲基化修饰位点的肽段，并且对于每一组中每种肽段，在其他各组中均有序列一致，但是同位素标记不同的对应肽段；2)在样品处理过程中，在不同的时间点加入上述不同的外源肽段参考品，且任意两组外源肽段参考品加入的时间点之间，均包括甲基化肽段富集的步骤；3)进样检测，提取处理数据，定量外源肽段参考品，将在前加入的外源肽段参考品的肽段丰度除以在后加入的外源肽段参考品的相同序列肽段的丰度，得到不同甲基化修饰肽段的得率比值，以此评价两个外源肽段参考品加入时间点之间的甲基化富集过程是否合格。2.根据权利要求1所述的用于监测甲基化蛋白质组学中甲基化肽段富集过程的方法，其特征在于，步骤1)中，所述不同甲基化修饰位点选自分布在精氨酸、赖氨酸、组氨酸、脯氨酸、丙氨酸和天冬酰胺主链和侧链上的n-甲基化修饰位点，谷氨酸或异天冬氨酸羧基内部和半胱氨酸羧基末端上的o-甲基化修饰位点，半胱氨酸或甲硫氨酸上的s-甲基化修饰位点，优选分布在赖氨酸残基上的n-甲基化修饰位点。3.根据权利要求1所述的用于监测甲基化蛋白质组学中甲基化肽段富集过程的方法，其特征在于，步骤1)中，所述不同甲基化修饰包括：单、双、三甲基化修饰，优选三条分别包含单甲基化、双甲基化和三甲基化修饰肽段。4.根据权利要求1所述的用于监测甲基化蛋白质组学中甲基化肽段富集过程的方法，其特征在于，步骤1)中，所述同位素标记不同包括：一组中肽段没有同位素标记，其他各组中肽段有同位素标记，但各组用以标记的同位素不相同；或者各组中肽段都有同位素标记，但各组用以标记的同位素不相同。5.根据权利要求1所述的用于监测甲基化蛋白质组学中甲基化肽段富集过程的方法，其特征在于，步骤1)中，所述同位素标记中的同位素包括：12c、13c、14c、14n、15n、16o、18o、1h、2h。6.根据权利要求1所述的用于监测甲基化蛋白质组学中甲基化肽段富集过程的方法，其特征在于，步骤2)中，所述样品选自细胞、组织、血浆、血清、全血、尿液、脑脊液、唾液、淋巴液、胸腔积水、乳汁、组织液、微生物或植物。7.根据权利要求1所述的用于监测甲基化蛋白质组学中甲基化肽段富集过程的方法，其特征在于，步骤2)中，所述外源肽段参考品加入前进行准确定量，优选加入量一致，或者按比例进行加入；所述甲基化肽段富集的步骤，包括甲基化肽段富集的所有步骤或者部分步骤。8.根据权利要求1所述的用于监测甲基化蛋白质组学中甲基化肽段富集过程的方法，其特征在于，步骤3)中，所述检测的方法为质谱检测。9.根据权利要求1所述的用于监测甲基化蛋白质组学中甲基化肽段富集过程的方法，其特征在于，步骤3)中，若在前加入的外源肽段参考品是在甲基化肽段富集前或者富集开始时加入，在后加入的外源肽段参考品是在甲基化肽段富集完成时或者富集完成后加入，则将在前加入的外源肽段参考品的肽段丰度除以在后加入的外源肽段参考品的相同序列肽段的丰度，得到不同甲基化修饰肽段的得率比值，以此评价整个甲基化肽段富集过程是
否合格。10.根据权利要求1所述的用于监测甲基化蛋白质组学中甲基化肽段富集过程的方法，其特征在于，步骤3)中，所述在前加入的外源肽段参考品和在后加入的外源肽段参考品，若两者加入时间点之间仅包括甲基化肽段富集过程的部分步骤，则将在前加入的外源肽段参考品的肽段丰度除以在后加入的外源肽段参考品的相同序列肽段的丰度，得到不同甲基化修饰肽段的得率比值，以此评价上述甲基化肽段富集过程的部分步骤是否合格。

技术总结
本发明公开了一种用于监测甲基化蛋白质组学中甲基化肽段富集过程的方法，包括以下步骤：1)设置至少两组外源肽段参考品，每组外源肽段参考品至少包含有三种不同甲基化修饰位点的肽段，并且对于每一组中每种肽段，在其他各组中均有序列一致，但是同位素标记不同的对应肽段；2)在样品处理过程中，在不同的时间点加入上述不同的外源肽段参考品，且任意两组外源肽段参考品加入的时间点之间，均包括甲基化肽段富集的步骤；3)进样检测，提取处理数据，定量外源肽段参考品，计算不同甲基化修饰肽段的得率比值，以此评价两个外源肽段参考品加入时间点之间的甲基化富集过程是否合格。该方法能有效评价甲基化肽段富集效率。有效评价甲基化肽段富集效率。有效评价甲基化肽段富集效率。


技术研发人员：乔舰 张宝 陈亮宇 李捷
受保护的技术使用者：谱天（天津）生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/10/6