一种基于GC-IMS技术检测莲子早期霉变的方法与流程

一种基于gc-ims技术检测莲子早期霉变的方法
技术领域
1.本发明涉及农作物仓储检测技术领域，具体地，涉及一种基于gc-ims技术检测莲子早期霉变的方法。


背景技术：

2.霉变一直以来都是困扰食品安全的棘手问题之一，在莲子储藏及莲子制品生产和加工的各个环节均存在霉变风险。因莲子中含有霉菌生长所需的各种营养物，一旦温湿度等环境条件适宜，易滋生各种霉菌，导致莲子变质，造成经济损失甚至食品安全问题。因此，众多食品厂家逐渐认识到预防或控制莲子霉变的重要性，莲子霉变控制也正在受到越来越多的研究机构或食品生产企业的关注。但行业对于霉变的研究起步较晚，研究深度较浅，主要研究方向集中在霉变发生的环境因方面，对致霉微生物的分离鉴定、致霉性等不够明确，霉变防控也缺乏系统和深入的研究，难以形成有效的霉变防控技术手段。
3.近年来，随着色谱和光谱技术的不断发展，食品工业中霉菌的鉴定已转向检测诸如霉菌毒素和霉菌产生的挥发性有机化合物等霉菌生长代谢产物。微生物挥发性有机化合物(vocs)是指细菌和真菌在生长繁殖过程中产生的初级或次级代谢挥发性化合物。相比于正常莲子，莲子在霉变过程中，霉菌会消耗莲子中的营养物质，进而产生释放多种代谢挥发性产物，微生物挥发性有机化合物是广泛应用于临床诊断和环境监测中的微生物生长评价指标，逐渐成为研究微生物污染的新型有效手段。
4.目前霉变标志物筛选常用的检测方法有顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱联用仪(hs-spme-gc-ms)、气相色谱或液相色谱串联质谱法，这些方法不仅价格昂贵，实验过程耗时费力；而且只能识别一种霉变特征标志物，如hs-spme-gc-ms只针对1-辛烯-3-醇一种标志物，液相色谱串联质谱法只针对麦角甾醇，应用过程中存在一定误差。因此，利用现有技术难以有效尽早观测到莲子的霉变及预测莲子的霉变时期，进而难以有效的控制霉变。气相色谱-离子迁移谱(gc-ims)监测系统是目前研究常用的新型技术，使用该方法检测挥发性有机化合物与电子鼻和气相色谱-质谱(gc-ms)等技术相比，具有使用简单、设备便携、灵敏度高、样品无需前处理等优点。
5.目前对莲子霉变检测研究，多集中在检测黄曲霉素上，还需要开发新的检测标志物，丰富检测方法，尽早区分出霉变莲子，保证食品用莲子品质。


技术实现要素：

6.本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种基于gc-ims技术检测莲子早期霉变的方法。
7.本发明的第一个目的是提供乳酸乙酯和/或丁酸异戊酯作为分子标记物在检测莲子早期霉变中的应用。
8.本发明的第二个目的是提供一种检测莲子早期霉变的方法。
9.本发明利用gc-ims技术全面、准确地测定不同霉变时间的莲子的挥发性成分含
量，得到样本的gc-ims数据，建立相应的霉变样本gc-ims数据库。
10.通过建立pca模型区分不同霉变时间的莲子，并拍照留取若干时间段霉变样本的形态图。
11.通过聚类热图分析、相关性分析找到不同霉变时间莲子挥发性成分的主要差异物质，确定莲子霉菌侵染霉变的特定分子标记物。vocs指纹谱图中选取迁移谱特征峰对应的挥发性有机物，确定对比样本、及各霉变样本主要挥发性有机物是否存在明显差异，初步筛选出莲子霉菌侵染霉变的分子标记物；验证筛选出的分子标记物有效性：对初步筛选出的莲子霉菌侵染霉变的分子标记物，采用动态主成分pca分析对对比样本及各霉变样本进行聚类分析，进一步验证使用初步筛选出的莲子霉菌侵染霉变的分子标记物是否可准确分辨出对比样本、及各霉变样本；特定分子标记物最终确定：使用加载图分析对pca聚类影响最大的因子，找出对应24h样本、48h样本聚类影响最大的挥发性有机物，作为莲子霉菌侵染霉变的特定分子标记物。
12.为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
13.乳酸乙酯和/或丁酸异戊酯作为分子标记物在检测莲子早期霉变中的应用。
14.其中，所述霉变的霉菌菌种为溜曲霉、假灰绿曲霉、柑橘青霉和肉桂紫青霉中的一种或几种。
15.进一步地，所述莲子早期霉变为莲子感染霉菌48h内所致霉变。
16.进一步地，所述莲子早期霉变为莲子感染霉菌24～48h内所致霉变。
17.本发明还提供一种检测莲子早期霉变的方法，检测外观形态正常莲子中的乳酸乙酯和/或丁酸异戊酯。
18.莲子外观形态异常，出现明显颜色灰暗、霉斑和菌丝，则直接判断莲子样本的霉变已发生至中期或晚期，无需再做其他检测；莲子外观形态正常，没有明显颜色灰暗、霉斑和菌丝，肉眼难以判断是否感染霉菌，则进行检测。
19.在本发明中，可用气相色谱-离子迁移谱联用仪进行检测。
20.进一步地，色谱柱为mxt-5毛细管色谱柱，柱长15m，内径：0.53mm，柱温60℃；载气和漂移气为n2。
21.进一步地，用无分流模式解吸法注入样品，孵育时间：20min；孵育温度：60℃；孵化转速：500rpm；进样针温度：85℃；进样口温度：80℃。
22.进一步地，载气的流速梯度设置为：
23.0～2min，载气流速2ml/min，
24.2～6min，载气流速由2ml/min变化为100ml/min，
25.6～20min，载气流速由100ml/min变化为150ml/min。
26.进一步地，离子迁移谱检测器中漂移管的温度为45℃，载气流速为150ml/min。
27.进一步地，用正酮c4～c9作为外部参考计算乳酸乙酯和/或丁酸异戊酯的保留指数。
28.检测的莲子样本中含乳酸乙酯和/或丁酸异戊酯，则莲子样本发生霉菌侵染早期霉变；莲子样本中不含乳酸乙酯和/或丁酸异戊酯，则莲子样本没有发生霉菌侵染早期霉变。所述霉菌侵染早期霉变为莲子感染溜曲霉、假灰绿曲霉、柑橘青霉和肉桂紫青霉24～48h。
29.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
30.本发明通过建立对比样本数据库、霉变样本数据库、完整数据库。分析完整莲子gc-ims数据库，得到莲子霉菌侵染霉变早期的特定分子标记物；其分析过程包括以下步骤：样本形态观察、步分析完整莲子gc-ims数据图谱、样本差异和相似性分析、确定备选分子标记物、初步筛选分子标记物、验证筛选出的分子标记物有效性、特定分子标记物最终确定。
31.本发明用gc-ims技术，通过检测莲子中乳酸乙酯和丁酸异戊酯的含量，判断莲子是否发生早期霉变。乳酸乙酯和丁酸异戊酯在感染霉菌24h样本中含量最高，在未感染霉菌样本中几乎不存在；在感染霉菌48h样本中减弱，在感染霉菌72～120h样本中偶尔有微量出现。通过乳酸乙酯和丁酸异戊酯可以准确判断出形态未发生明显变化的，感染溜曲霉、假灰绿曲霉、柑橘青霉和肉桂紫青霉24～48h的早期霉变莲子，为莲子仓储质量控制和食品安全保障提供检测基础。
附图说明
32.图1为莲子样本形态图。
33.图2为莲子样本的gc-ims三维谱图。
34.图3为莲子样本的gc-ims二维谱图。
35.图4为莲子样本的gc-ims二维差谱图。
36.图5为莲子样本中挥发性化合物的聚类热图。
37.图6为莲子样本中挥发性成分的相似性分析图。
38.图7为对照组莲子样本的离子迁移谱图。
39.图8为莲子样本挥发性成分的指纹图谱。
40.图9为莲子样本的pca得分图。
41.图10为莲子样本的pca载荷图。
具体实施方式
42.下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
43.实施例1gc-ims检测莲子样本的挥发性物质
44.一、实验方法
45.1、获得发霉莲子菌株
46.称取发霉莲子10g于90ml无菌生理盐水中，内置玻璃珠，充分震荡30min～60min，得菌悬原液，取菌悬原液1ml梯度稀释为10-2
、10-3
、10-4
和10-5
，得稀释菌悬液，再吸取各不同浓度的稀释菌悬200μl于pda培养基中，涂布，重复三次水平；放入28℃霉菌培养箱中培养5d，选择菌落数在30～300个之间的疑似菌进行划线分离纯化，挑取单菌落进行纯化，多次划线分离镜检无杂菌后即为纯化菌种，纯化菌种转接到pda斜面培养基上4℃低温保藏。
47.用tsingke植物dna提取试剂盒(通用型)提取pda培养得到的单菌落的菌株基因组dna。
48.用真菌its序列通用引物its1(5
’‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3’)和its4(5
’‑
tcctccgcttattgatatgc-3’)对上述提取的菌株基因组dna进行pcr扩增。
49.pcr反应体系为50μl：1
×
tse101金牌mix 45μl(北京擎科)，上、下游引物各2μl，dna模板1μl。pcr扩增条件为：98℃预变性2min，98℃变性10s，56℃退火10s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸5min，扩增产物4℃保存。
50.将扩增好的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳(2μl样品+6μl溴酚蓝)，300v电压下12min，获取鉴定胶图。pcr产物进行测序，所得测序结果输入美国国家生物信息技术中心(national centerof biotechnology information，ncbi)数据库中进行blast比对，用mega11构建系统发育树。
51.2、莲子接菌
52.(1)将前述筛选鉴定纯化培养获得的单菌制成混菌孢子悬浮液。将溜曲霉、假灰绿曲霉、柑橘青霉和肉桂紫青霉分别制备成100ml孢子数浓度为105个/ml的菌悬液，再将4种菌的菌悬液混合，制备得到混菌孢子悬浮液。
53.(2)用1％次氯酸钠溶液浸泡莲子5min灭菌，再用无菌水洗涤3次。
54.(3)选取颗粒饱满，大小均一，无发霉等异味的莲子(品种“湘莲”)，将莲子进行分组(a0、l0、l1、l2、l3、l4、l5)，作为霉变样本。对于6组实验组(l0～l5)，将1ml混菌菌悬液用无菌移液枪均匀喷洒于莲子表面，无菌玻璃棒搅拌，确保真菌相对均匀分布。对于空白组a0，将混菌菌悬液替换为无菌水，按照上述接种方法处理，作为对照样本。
55.(4)将步骤(3)处理后的莲子，密封放置在琼脂培养皿中，30℃培养0h、24h、48h、72h、96h和120h，即得受霉菌侵染后霉变0h、24h、48h、72h、96h和120h的莲子样本(l0、l1、l2、l3、l4、l5)。
56.3、莲子检测
57.取样时，称取2g上述接菌后的粉末莲子样本，置于20ml顶空瓶中，80℃孵育20min后进样。每个样本做三次平行实验。
58.对各样本进行拍照，并用gc-ims技术检测样本中挥发性物质的种类和含量。
59.gc-ims检测条件：
60.gc-ims为flavour spec1h1-00053型gc-ims联用仪，德国g.a.s公司。
61.色谱柱：mxt-5毛细管色谱柱(柱长15m，内径：0.53mm)，柱温60℃；载气和漂移气：n2，分析时间：20min。
62.使用无分流模式解吸法注入样品500μl，孵化后顶空进样。孵育时间：20min；孵育温度：60℃；孵化转速500rpm；进样针温度：85℃；进样口温度：80℃。
63.载气的流速梯度设置：0～2min，载气流速2ml/min；2～6min，载气流速由2ml/min变化为100ml/min；6～20min，载气流速由100ml/min变化为150ml/min。
64.随后，将分析物推入电离室进行电离，然后，通过快门栅极将所得的驱动到漂移区中，并且最终传递到ims检测器中。ims中漂移管的温度为45℃，载气流速为150ml/min。将漂移气流的恒定流速设置为150ml/min，使用正酮c4～c9作为外部参考计算每种化合物的保留指数(ri)。
65.建立相应的gc-ims数据库，包括样本的形态图、gc-ims三维谱图、二维谱图和差异化谱图。
66.二、实验结果
67.1、如表1所示，从发霉莲子上筛选鉴定获得溜曲霉、假灰绿曲霉、柑橘青霉、肉桂紫青霉和黄曲霉。
68.表1发霉莲子菌株鉴定
[0069][0070]
2、如图1所示，为各样本的形态图，可以看出相比于a0样本，l0样本的外观及颜色无明显差异，l1样本外观颜色灰暗，肉眼可见细微菌斑；l2～l5样本明显可见菌丝，霉变严重。
[0071]
3、如图2、图3和图4所示，为各样本的gc-ims三维谱图、二维谱图和差异化谱图，可以看出，相比于a0样本，随培养时间增加，l0～l5样本的挥发性有机物含量出现增加和减少的趋势，同时有新的挥发性有机物出现，表明a0～l5样本之间的挥发性有机物存在明显差异。
[0072]
实施例2分析莲子样本的挥发性有机物的差异和相似性
[0073]
一、实验方法
[0074]
用聚类热图分析对样本之间的挥发性有机物进行差异和相似性进行分析。
[0075]
二、实验结果
[0076]
如图5所示，在整个霉变过程中，样本中挥发性有机化合物的种类逐渐增加，不同霉变阶段有其独特的挥发性有机化合物，各霉变样本之间差异很大。
[0077]
如图6所示，莲子样本中l1和l2与l3～l5的差异较大，与对照组a0、l0可以较好地区分开，此结果为莲子中霉菌污染的早期监测与预警提供可能。实施例3确定莲子霉菌侵染霉变的分子标记物
[0078]
一、实验方法
[0079]
1、分子标记物初步筛选
[0080]
从实施例1各样本的gc-ims谱图中，选取离子迁移谱特征峰位置点，确定对应的挥发性有机物，作为莲子霉菌侵染霉变的备选分子标记物。
[0081]
根据实施例1各样本的gc-ims数据库，生成voc指纹谱图，在voc指纹谱图中选取上述迁移谱特征峰对应的挥发性有机物，以初步确定各样本之间备选分子标记物的差异，确定初筛分子标记物。
[0082]
2、验证初筛分子标记物有效性
[0083]
用动态主成分pca分析各样本的初筛分子标记物，并进行voc聚类分析。
[0084]
3、优选分子标记物
[0085]
与对照组a0相比，l1样本中未观察到显著变化，而l2样品轻微发霉，l3～l5组显示出更严重的明显发霉状态。因此对霉变早期l1～l2样品聚类影响最大的挥发性有机物进行确认，将确认结果作为优选分子标记物。用载荷图分析前述pca聚类影响最大的挥发性有机物，确认优选分子标记物。
[0086]
二、实验结果
[0087]
1、如图7所示，为莲子霉菌侵染霉变的备选分子标记物。如图8所示，为voc指纹谱图中迁移谱特征峰对应的挥发性有机物，确定初筛分子标记物。a0样本和l0样本中：3-甲基丁酸、(z)-丁酸-3-己烯酯、2-甲基丙醛、2-甲基丁酸、6-甲基-5-庚烯-2-酮、未知成分2和苄醇的信号强度很强。l1和l2样本中：主要存在乳酸乙酯、丁酸异戊酯、1，3-丁二醇、丁酸和丁酸异丁酯这些挥发性有机物，并观察到其在l3～l5样本中明显减弱，因此初步筛选出乳酸乙酯、丁酸异戊酯、1，3-丁二醇、丁酸异丁酯和丁酸作为分子标记物。
[0088]
2、如图9所示，为验证筛选出的分子标记物有效性。对初步筛选出的分子标记物，采用动态主成分pca分析对对比样本及各霉变样本进行voc聚类分析，该主成分分析结果与前期聚类分析热图结果类似；结果进一步支持了聚类热图分析和样本之间相关性分析的结果，因此确定了筛选出的分子标记物的有效性。
[0089]
3、如图10所示，确定乳酸乙酯和丁酸异戊酯为优选分子标记物。
[0090]
为进一步验证乳酸乙酯和丁酸异戊酯作为莲子霉菌侵染霉变早期的特定分子标记物的合理性，结合观察voc指纹谱图进行分析。乳酸乙酯和丁酸异戊酯在l1样本中含量最高，在a0、l0样本中几乎不存在，在l1样本中乳酸乙酯和丁酸异戊酯的含量与a0、l0存在显著差异(p《0.05)；在l3～l5样本中偶尔有微量出现。再结合形态图观察对比，在l3～l5样本中已经出现明显肉眼可见外观变化，实际已经发生霉变，不需要再做霉菌侵染早期霉变的检测；因此对于霉变早期l1～l2样本检测，使用乳酸乙酯和丁酸异戊酯作为霉菌侵染霉变早期的特定分子标记物是合理且有效的。
[0091]
实施例4检测莲子早期霉变的方法
[0092]
1、观察莲子外观形态：若莲子外观形态异常，出现明显颜色灰暗、霉斑和菌丝时，则直接判断莲子库存样本的霉变已发生至中期或晚期，无需再做其他检测；若莲子外观形态正常，没有明显颜色灰暗、霉斑和菌丝，肉眼难以判断是否感染霉菌，则进行gc-ims检测。
[0093]
2、gc-ims检测：按照实施例1的方法，对莲子进行gc-ims检测，若莲子样本中含乳酸乙酯和丁酸异戊酯，则莲子样本发生霉菌侵染早期霉变；若莲子样本中不含乳酸乙酯和丁酸异戊酯，则莲子样本没有发生霉菌侵染早期霉变(感染溜曲霉、假灰绿曲霉、柑橘青霉和肉桂紫青霉24～48h)。
[0094]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

技术特征：
1.乳酸乙酯和/或丁酸异戊酯作为分子标记物在检测莲子早期霉变中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述霉变的霉菌菌种为溜曲霉、假灰绿曲霉、柑橘青霉和肉桂紫青霉中的一种或几种。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述莲子早期霉变为莲子感染霉菌48h内所致霉变。4.一种检测莲子早期霉变的方法，其特征在于，检测外观形态正常莲子中的乳酸乙酯和/或丁酸异戊酯。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，用气相色谱-离子迁移谱联用仪进行检测。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，色谱柱为mxt-5毛细管色谱柱，柱长15m，内径：0.53mm，柱温60℃；载气和漂移气为n2。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，用无分流模式解吸法注入样品，孵育时间：20min；孵育温度：60℃；孵化转速：500rpm；进样针温度：85℃；进样口温度：80℃。8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，载气的流速梯度设置为：0～2min，载气流速2ml/min，2～6min，载气流速由2ml/min变化为100ml/min，6～20min，载气流速由100ml/min变化为150ml/min。9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，离子迁移谱检测器中漂移管的温度为45℃，载气流速为150ml/min。10.用正酮c4～c9作为外部参考计算乳酸乙酯和/或丁酸异戊酯的保留指数。

技术总结
本发明公开了一种基于GC-IMS技术检测莲子早期霉变的方法。本发明公开了乳酸乙酯和/或丁酸异戊酯作为分子标记物在检测莲子早期霉变中的应用。本发明用GC-IMS技术，通过检测莲子中乳酸乙酯和丁酸异戊酯的含量，判断莲子是否发生早期霉变。乳酸乙酯和丁酸异戊酯在感染霉菌24h样本中含量最高，在未感染霉菌样本中几乎不存在；在感染霉菌48h样本中减弱，在感染霉菌72～120h样本中偶尔有微量出现。通过乳酸乙酯和/或丁酸异戊酯可以准确判断出形态未发生明显变化的，感染溜曲霉、假灰绿曲霉、柑橘青霉和肉桂紫青霉24～48h的早期霉变莲子。青霉和肉桂紫青霉24～48h的早期霉变莲子。青霉和肉桂紫青霉24～48h的早期霉变莲子。


技术研发人员：赵利平 高向阳 邓元达 谢雅曼 李玉坤 莫梅清 刘禹志 吴锦源
受保护的技术使用者：广州酒家集团利口福食品有限公司
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/10/6