一种叶酸衍生物及其制备方法和防治铁死亡中的应用

1.本发明属于医药应用技术领域，具体涉及一种叶酸衍生物及其制备方法和防治铁死亡中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.细胞铁死亡(ferroptosis)是最近发现的一种在形态学，生物化学和遗传学等方面均不同于凋亡、坏死和自噬的新的程序性细胞死亡方式。因该过程依赖于铁离子存在的、氧化性的、非凋亡的程序性细胞死亡，故称铁死亡。其发生机制为：细胞膜脂质活性氧生成与降解的平衡失调；典型特征为：线粒体变小，双层膜密度增加，同时表现为细胞膜脂质活性氧自由基增多。最近的数据还表明，一些正常的生理情况下，如肿瘤抑制、免疫和发育等与铁死亡过程密切相关。例如，cd8+t淋巴细胞通过诱导癌细胞的铁死亡作用发挥肿瘤免疫功能。值得注意的是，脂质过氧化驱动的铁死亡已经引起了相当大的关注，主要是因为它参与了大量的人类病理状态，如器官损伤、神经变性和器官缺血再灌注损伤。重要的是，在不同的临床前动物模型中，药物调控铁死亡已被证明是治疗这些疾病的一个有前途的治疗方式。
4.ferrostatin-1和liproxstatin-1是第一代小分子铁死亡抑制剂，功能为清除细胞膜脂质自由基损伤，阻断细胞铁死亡的发生。该类抑制剂具有明确的作用机理和构效关系。然而，这两种化合物分别存在半衰期短、毒性较大、保存难的不足。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种叶酸衍生物及其制备方法和应用。本发明提供了包括叶酸二酯和叶酸二酰胺的叶酸衍生物及其制备方法，在对细胞铁死亡作用机制研究基础上，通过细胞膜水平脂质自由基抑制实验，细胞活性测试和整体动物水平药理活性测定，发现并验证了叶酸衍生物为靶向细胞铁死亡的抑制剂，在治疗非酒精性脂肪肝炎，急性肝损伤，心肌病，药物所致心脏毒性，急性肾损伤，肾纤维化，肺炎，子痫前期，骨质疏松，骨关节炎，脑外伤，神经退行性疾病包括阿尔兹海默病，帕金森，癫痫等疾病中的新用途。
6.为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
7.第一方面，本发明提供了一种叶酸衍生物，包含通式(i)所示的化合物及其在药学上可接受的盐；
[0008][0009]
其中，r为烷基、环烷基、芳基中的一种或多种。
[0010]
第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的叶酸衍生物的制备方法，包括以下步骤：
[0011]
将叶酸与对甲基苯磺酸溶解于醇或胺中，加热回流反应，反应结束后冷却反应体系至室温，减压浓缩溶剂，抽滤，并用冷的醇洗涤滤饼，滤饼真空干燥，得到粗产品，粗产品进行重结晶，得到叶酸衍生物。
[0012]
第三方面，本发明提供了一种第一方面所述的叶酸衍生物在制备抑制细胞铁死亡药物中的应用。
[0013]
第四方面，本发明提供了一种第一方面所述的叶酸衍生物在制备防治细胞铁死亡相关疾病药物中的应用，所述细胞铁死亡相关疾病包括非酒精性脂肪肝炎、急性肝损伤、心肌病、药物所致心脏毒性、急性肾损伤、肾纤维化、肺炎、子痫前期、骨质疏松、骨关节炎、脑外伤、神经退行性疾病中的一种或多种，所述神经退行性疾病包括阿尔兹海默病，帕金森，癫痫中的一种或多种。
[0014]
第五方面，本发明提供了一种第一方面所述的叶酸衍生物在制备防治同型半胱氨酸升高有关疾病药物中的应用，所述疾病包括同型半胱氨酸升高的高血压，脂肪肝，骨质疏松症，子痫前期中的一种或多种。
[0015]
上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：
[0016]
本发明成功合成了具有不同取代基的叶酸酯类或叶酸酰胺类叶酸衍生物，叶酸衍生物活性较高，且能稳定存在，能够阻断膜脂质自由基的链式反应，减少自由基对细胞膜的损伤作用，防止细胞铁死亡的发生。
[0017]
本发明通过细胞毒性实验证实了在治疗剂量下的叶酸衍生物用于治疗非酒精性脂肪肝炎，急性肝损伤，心肌病，药物所致心脏毒性，急性肾损伤，肾纤维化，肺炎，子痫前期，骨质疏松，骨关节炎，脑外伤，神经退行性疾病包括阿尔兹海默病，帕金森，癫痫，也无明显的毒性。
[0018]
本发明为以铁死亡为靶点的非酒精性脂肪肝炎，急性肝损伤，心肌病，药物所致心脏毒性，急性肾损伤，肾纤维化，肺炎，子痫前期，骨质疏松，骨关节炎，脑外伤，神经退行性疾病包括阿尔兹海默病，帕金森，癫痫的治疗提供了治疗方案和理论依据。
附图说明
[0019]
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0020]
图1为实施例4中叶酸衍生物a2、b1对诱导剂诱导产生的细胞铁死亡的抑制作用数据图；
[0021]
图2为实施例4中叶酸衍生物a1、a2、a3、a4、b1、b2防止脂质过氧化的数据图，其中ctrl为仅加入rsl3组；
[0022]
图3为实施例5中叶酸衍生物a2治疗给药小鼠肾脏损伤情况，以肌酐(creatinine)和尿素(urea)作为生化检测指标；
[0023]
图4为实施例5中叶酸衍生物a2治疗给药小鼠肾脏损伤的he染色图；
[0024]
图5为实施例6中叶酸衍生物a2治疗给药小鼠肝脏损伤情况，以谷草转氨酶(alt)和谷丙转氨酶(ast)作为生化检测指标；
[0025]
图6为实施例6中叶酸衍生物a2治疗给药小鼠肝脏损伤的he染色图。
具体实施方式
[0026]
本发明的第一种典型实施方式，一种叶酸衍生物，包含通式(i)所示的化合物及其在药学上可接受的盐；
[0027][0028]
其中，r为烷基、环烷基、芳基中的一种或多种。
[0029]
该实施方式的一种或多种实施例中，所述烷基选自含c1～c20烷基，所述环烷基选自具6个原子的脂肪族环状结构，所述芳基选自烷基苯基。
[0030]
该实施方式的一种或多种实施例中，所述药学上可接受的盐包括盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐中的一种或多种。
[0031]
本发明的第二种典型实施方式，一种第一种典型实施方式所述的叶酸衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0032]
将叶酸与对催化酸溶解于醇或胺中，加热回流反应，反应结束后冷却反应体系至室温，减压浓缩溶剂，抽滤，并用冷的醇洗涤滤饼，滤饼真空干燥，得到粗产品，粗产品进行重结晶，得到叶酸衍生物。
[0033]
该实施方式的一种或多种实施例中，所述醇包括烷基醇、环烷基醇和芳基醇中的一种或多种；
[0034]
或，所述胺包括烷基胺、环烷基胺和芳基胺中的一种或多种；
[0035]
优选的，所述烷基醇的烷基选自含c1～c20烷基，所述环烷基醇的环烷基选自具6个原子的脂肪族环状结构，所述芳基醇的芳基选自烷基苯基；
[0036]
优选的，所述烷基胺的烷基选自含c1～c20烷基，所述环烷基胺的环烷基选自具6个原子的脂肪族环状结构，所述芳基胺的芳基选自烷基苯基。
[0037]
该实施方式的一种或多种实施例中，所述催化酸为对苯甲基苯磺酸或硫酸；叶酸和催化酸的摩尔比为1:0.99-1.01。
[0038]
该实施方式的一种或多种实施例中，加热回流的温度为79-81℃，反应时间为11-13h。
[0039]
本发明的第三种典型实施方式，一种第一种典型实施方式所述的叶酸衍生物在制备抑制细胞铁死亡药物中的应用。
[0040]
本发明的第四种典型实施方式，一种第一种典型实施方式所述的叶酸衍生物在制备防治细胞铁死亡相关疾病药物中的应用，所述细胞铁死亡相关疾病包括非酒精性脂肪肝炎、急性肝损伤、心肌病、药物所致心脏毒性、急性肾损伤、肾纤维化、肺炎、子痫前期、骨质疏松、骨关节炎、脑外伤、神经退行性疾病中的一种或多种，所述神经退行性疾病包括阿尔兹海默病，帕金森，癫痫中的一种或多种。
[0041]
本发明的第五种典型实施方式，一种第一种典型实施方式所述的叶酸衍生物在制备防治同型半胱氨酸升高有关疾病药物中的应用，所述疾病包括同型半胱氨酸升高的高血压，脂肪肝，骨质疏松症，子痫前期中的一种或多种。
[0042]
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
[0043]
实施例1
[0044]
目标化合物a1-a31的制备
[0045]
向圆底烧瓶中加入叶酸(440mg，1mmol)，催化酸(1mmol)，加入大过量醇作为溶剂，在80℃回流反应12h。反应结束后，待反应物冷却至室温，减压浓缩溶剂，抽滤，并用冷的对应的醇洗涤3次滤饼，滤饼真空干燥，得到粗产品，将干燥后所得到的粗产品进行重结晶，得到目标化合物。通过改变醇和催化酸的种类得到不同的目标化合物a1-a31。
[0046]
醇为甲醇，催化酸为对苯甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a1，收率80％。a1的化学式和1h nmr数据如下：
[0047][0048]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),3.61(s,3h),3.57(s,3h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h)。
[0049]
醇为乙醇，催化酸为对苯甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a2，收率75％。a2的化学式和1h nmr数据如下：
[0050][0051]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.26(d,j＝7.5hz,1h),7.65
(d,j＝8.8hz,2h),6.97(s,3h),6.64(d,j＝8.8hz,2h),4.49(s,2h),4.38(ddd,j＝9.6,7.4,5.3hz,1h),4.11
–
3.87(m,4h),2.42(t,j＝7.6hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h),1.56(tq,j＝14.0,7.1hz,4h),0.98
–
0.82(m,6h)。
[0052]
醇为正丙醇，催化酸为对苯甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a3，收率55％。a3的化学式和1h nmr数据如下：
[0053][0054]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.26(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.8hz,2h),6.97(s,3h),6.64(d,j＝8.8hz,2h),4.49(s,2h),4.38(ddd,j＝9.6,7.4,5.3hz,1h),4.11
–
3.87(m,4h),2.42(t,j＝7.6hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h),1.56(tq,j＝14.0,7.1hz,4h),0.98
–
0.82(m,6h)。
[0055]
醇为异丙醇，催化酸为硫酸时，得到黄色固体目标化合物a4，收率60％。a4的化学式和1h nmr数据如下：
[0056][0057]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.43(s,1h),8.65(s,1h),8.21(d,j＝7.4hz,1h),7.64(d,j＝8.7hz,2h),6.97(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.88(dq,j＝12.1,6.0hz,2h),4.49(d,j＝3.8hz,2h),4.36
–
4.28(m,1h),2.35(dd,j＝13.8,6.2hz,2h),2.06
–
1.91(m,2h),1.17(dd,j＝11.2,6.3hz,12h)。
[0058]
醇为正丁醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a5，收率60％。a5的化学式和1h nmr数据如下：
[0059][0060]
1h),7.64(d,j＝8.5hz,2h),6.96(s,3h),6.64(d,j＝8.6hz,2h),4.49(s,2h),4.36(dd,j＝13.5,8.3hz,1h),4.02(dt,j＝13.3,6.3hz,4h),2.41(t,j＝7.4hz,2h),2.10
–
1.93(m,2h),1.52(dd,j＝14.0,6.3hz,4h),1.36
–
1.26(m,4h),0.86(t,j＝7.3hz,6h)。
[0061]
醇为异丁醇，催化酸为硫酸时，得到黄色固体目标化合物a6，收率60％。a6的化学式和1h nmr数据如下：
[0062][0063]1hnmr(400mhz,dmso)δ11.42(s,1h),8.65(s,1h),8.27(d,j＝7.5hz,1h),7.64(d,j＝8.7hz,2h),6.97(t,j＝5.7hz,3h),6.64(d,j＝8.8hz,2h),4.48(d,j＝5.5hz,2h),4.43
–
4.35(m,1h),3.83(ddd,j＝19.3,10.7,6.6hz,4h),2.44(t,j＝7.5hz,2h),2.13
–
1.95(m,2h),1.91
–
1.79(m,2h),0.84(t,j＝10.1hz,12h)。
[0064]
醇为仲丁醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a7，收率70％。a7的化学式和1h nmr数据如下：
[0065][0066]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.52(s,1h),8.66(s,1h),8.23(d,j＝5.4hz,1h),7.65(d,j＝8.3hz,2h),6.96(s,3h),6.64(d,j＝8.5hz,2h),4.73(d,j＝5.9hz,2h),4.49(s,2h),4.34(s,1h),2.39(s,2h),2.03(dd,j＝24.7,18.5hz,2h),1.57
–
1.42(m,4h),1.14(dd,j＝9.2,6.7hz,6h),0.82(dd,j＝15.7,7.6hz,6h)。
[0067]
醇为叔丁醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a8，收率78％。a8的化学式和1h nmr数据如下：
[0068][0069]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.25(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),6.97(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h),1.42(s,18h)。
[0070]
醇为正戊醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a9，收率85％。a9的化学式和1h nmr数据如下：
[0071][0072]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.48(s,1h),8.65(s,1h),8.25(d,j＝7.4hz,1h),7.64(d,j＝8.5hz,2h),6.96(s,3h),6.64(d,j＝8.6hz,2h),4.49(s,2h),4.36(dd,j＝13.5,8.3hz,1h),4.02(dt,4h),2.41(t,j＝7.4hz,2h),2.10
–
1.93(m,2h),1.60(m,4h),1.36(m,8h),0.86(t,6h)。
[0073]
醇为2-戊醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a10，收率68％。a10的化学式和1h nmr数据如下：
[0074][0075]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.52(s,1h),8.66(s,1h),8.23(d,j＝5.4hz,1h),7.65(d,j＝8.3hz,2h),6.96(s,3h),6.64(d,j＝8.5hz,2h),4.73(d,2h),4.49(s,2h),4.34(s,1h),2.39(s,2h),2.03(dd,j＝24.7,18.5hz,2h),1.50
–
1.42(m,4h),1.30(m,4h),1.14(d,6h),0.82(dt,6h)。
[0076]
醇为3-戊醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a11，收率79％。a11的化学式和1h nmr数据如下：
[0077][0078]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.52(s,1h),8.66(s,1h),8.23(d,j＝5.4hz,1h),7.65(d,j＝8.3hz,2h),6.96(s,3h),6.64(d,j＝8.5hz,2h),4.67(m,1h),4.57(m,1h),4.49(s,2h),4.34(s,1h),2.39(s,2h),2.03(dd,j＝24.7,18.5hz,2h),1.57
–
1.42(m,8h),0.89(dt,12h)。
[0079]
醇为2-甲基-1-丁醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a12，收率73％。a12的化学式和1h nmr数据如下：
[0080][0081]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),4.18(dd,4h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h),1.55(m,4h),0.93(dt,6h),0.85(d,6h)。
[0082]
醇为2-甲基-2-丁醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a13，收率79％。a13的化学式和1h nmr数据如下：
[0083][0084]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h),1.68(q,2h),1.48(q,2h),1.33(m,12h),0.90(dt,6h)。
[0085]
醇为3-甲基-1-丁醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a14，收率65％。a14的化学式和1h nmr数据如下：
[0086][0087]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),4.10(dt,4h),1.52(dt,4h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h),0.97(s,12h)。
[0088]
醇为3-甲基-2-丁醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a15，收率78％。a15的化学式和1h nmr数据如下：
[0089][0090]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),4.34(m,2h),2.51(m,2h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h),1.32(s,6h),0.98(s,12h)。
[0091]
醇为2,2-二甲基-1-丙醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a16，收率78％。a16的化学式和1h nmr数据如下：
[0092][0093]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),3.97(s,2h),3.81(s,2h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h),1.25(s,18h)。
[0094]
醇为环己醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a17，收率84％。a17的化学式和1h nmr数据如下：
[0095][0096]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.60
–
4.53(m,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h),1.63(m,8h),1.53(m,8h),1.46(m,4h)。
[0097]
醇为环戊基甲醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a18，收率77％。a18的化学式和1h nmr数据如下：
[0098][0099]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),4.29(d,2h),3.85(d,2h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h),1.76(m,8h),1.68
–
1.47(m,10h)。
[0100]
醇为2-甲基环戊醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a19，收率84％。a19的化学式和1h nmr数据如下：
[0101][0102]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.94(m,1h),4.58(m,1h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h),1.76
–
1.62(m,13h),1.39(m,1h),0.90(dd,6h)。
[0103]
醇为3-甲基环戊醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a20，收率82％。a20的化学式和1h nmr数据如下：
[0104][0105]1hnmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),5.15(m,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h),1.85
–
1.65(m,14h),0.86(s,6h)。
[0106]
醇为环丁基乙醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a21，收率85％。a21的化学式和1h nmr数据如下：
[0107][0108]1hnmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),4.13
–
4.06(m,4h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.14
–
1.77(m,16h),1.52(m,4h)。
[0109]
醇为(2-甲基环丁基)甲醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a22，收率90％。a22的化学式和1h nmr数据如下：
[0110][0111]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),4.24(dd,4h),2.63(m,2h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,4h),1.72
–
1.47(m,8h),0.88(dd,6h)。
[0112]
醇为(3-甲基环丁基)甲醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a23，收率80％。a23的化学式和1h nmr数据如下：
[0113][0114]1hnmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),4.29(d,2h),3.84(m,2h),2.73(m,2h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.24(m,2h),2.12
–
1.93(m,2h),1.66
–
1.41(m,8h),0.86(d,6h)。
[0115]
醇为2,3-二甲基环丁醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a24，收率89％。a24的化学式和1h nmr数据如下：
[0116][0117]1hnmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),4.23(m,2h),2.88(m,2h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.29(m,2h),2.12
–
1.86(m,6h),0.88(d,12h)。
[0118]
醇为2,4-二甲基环丁醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a25，收率83％。a25的化学式和1h nmr数据如下：
[0119][0120]1hnmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),4.23(s,2h),2.98(m,4h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h),1.80
–
1.55(m,4h),0.88(d,12h)。
[0121]
醇为苯甲醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a26，收率67％。a26的化学式和1h nmr数据如下：
[0122][0123]1hnmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),7.33(d,10h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),5.34(s,2h),5.20(s,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h)。
[0124]
醇为1-苯基乙醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a27，收率73％。a27的化学式和1h nmr数据如下：
[0125][0126]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),7.32
–
7.25(m,10h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),6.05(m,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h),1.68(dd,6h)。
[0127]
醇为2-苯基乙醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a28，收率66％。a28的化学式和1h nmr数据如下：
[0128][0129]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),7.23
–
7.19(m,10h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.41(dt,4h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),2.96(dt,4h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h)。
[0130]
醇为2-甲基苯甲醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a29，收率87％。a29的化学式和1h nmr数据如下：
[0131][0132]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),7.32(d,2h),7.23(m,4h),7.12(m,2h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),5.34(s,2h),5.05(s,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.29(s,6h),2.12
–
1.93(m,2h)。
[0133]
醇为2-甲基苯甲醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a30，收率66％。a30的化学式和1h nmr数据如下：
[0134][0135]1hnmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),7.51(dt,2h),7.37(dd,2h),7.19(s,2h),7.05(dd,2h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),5.34(s,2h),5.20(s,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.31(s,6h),2.12
–
1.93(m,2h)。
[0136]
醇为4-甲基苯甲醇，催化酸为对甲基苯磺酸时，得到黄色固体目标化合物a31，收率65％。a31的化学式和1h nmr数据如下：
[0137][0138]1hnmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),7.13(t,4h),7.09(t,4h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),5.34(s,2h),5.20(s,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.19(s,6h),2.12
–
1.93(m,2h)。
[0139]
实施例2
[0140]
向圆底烧瓶中加入叶酸二酯(1mmol)，加入大过量对应的胺类作为溶剂，在80℃回流反应12h。反应结束后，待反应物冷却至室温，减压浓缩溶剂，抽滤，并用冷的对应的胺洗涤3次滤饼，滤饼真空干燥，得到粗产品，将干燥后所得到的粗产品进行重结晶，得到黄色固体产物。通过使用不同的取代胺类制得目标化合物b1-b10。
[0141]
当使用的胺为乙胺的水溶液，产物为黄色固体目标化合物b1，收率75％。b1的化学式和和1h nmr数据如下：
[0142][0143]
1h nmr(400mhz,dmso)δ11.45(s,1h),8.65(s,1h),8.25(d,j＝7.5hz,1h),8.01
(s,2h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),6.97(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(s,2h),4.36(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),3.24
–
3.11(m,4h),2.40(t,j＝7.5hz,2h),2.11
–
1.90(m,2h),0.99(q,6h)。
[0144]
使用的胺为异丙胺时，产物为黄色固体目标化合物b2，收率83％。b2的化学式和和1h nmr数据如下：
[0145][0146]
1hnmr(400mhz,dmso)δ11.43(s,1h),8.65(s,1h),8.21(d,j＝7.4hz,1h),8.14(s,2h),7.64(d,j＝8.7hz,2h),6.97(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),3.81(dq,2h),4.49(d,j＝3.8hz,2h),4.36
–
4.28(m,1h),2.35(dd,j＝13.8,6.2hz,2h),2.06
–
1.91(m,2h),1.00(dd,12h)。
[0147]
使用的胺为正丙胺时，产物为黄色固体b3，收率90％。b3的化学式和和1hnmr数据如下：
[0148][0149]
1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.26(d,j＝7.5hz,1h),8.01(s,1h),7.75(s,1h),7.65(d,j＝8.8hz,2h),6.97(s,3h),6.64(d,j＝8.8hz,2h),4.49(s,2h),4.38(ddd,j＝9.6,7.4,5.3hz,1h),3.42
–
3.18(m,4h),2.42(t,j＝7.6hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h),1.56(tq,4h),0.98
–
0.82(m,6h)。
[0150]
使用的胺为3-戊胺时，产物为黄色固体b4，收率75％。b4的化学式和和1hnmr数据如下：
[0151][0152]
1h nmr(400mhz,dmso)δ11.52(s,1h),8.66(s,1h),8.23(d,j＝5.4hz,1h),8.14(s,2h),7.65(d,j＝8.3hz,2h),6.96(s,3h),6.64(d,j＝8.5hz,2h),4.49(s,2h),4.34(ddd,1h),3.40(m,2h),2.39(s,2h),2.03(dd,j＝24.7,18.5hz,2h),1.57
–
1.42(m,8h),
0.89(dt,12h)。
[0153]
使用的胺为叔丁胺时，产物为黄色固体b5，收率65％。b5的化学式和和1hnmr数据如下：
[0154][0155]
1hnmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.25(d,j＝7.5hz,1h),8.18(s,2h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),6.97(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h),1.37(s,18h)。
[0156]
使用的胺为苯甲胺时，产物为黄色固体b6，收率73％。b6的化学式和和1hnmr数据如下：
[0157][0158]
1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),7.31
–
7.23(m,10h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.44(s,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),4.24(s,2h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h)。
[0159]
使用的胺为环戊基甲胺时，产物为黄色固体b7，收率78％。b7的化学式和和1h nmr数据如下：
[0160][0161]
1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),8.09(s,2h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),3.12(dd,4h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h),1.76(m,8h),1.68
–
1.47(m,10h)。
[0162]
使用的胺为新戊基时，产物为黄色固体b8，收率82％。b8的化学式和和1hnmr数据如下：
[0163][0164]
1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),8.01(s,2h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),3.06(s,4h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h),0.94(s,18h)。
[0165]
使用的胺为3-甲基苯甲胺时，产物为黄色固体b9，收率90％。b9的化学式和和1h nmr数据如下：
[0166][0167]
1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.87(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),8.18(s,1h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),7.51(dt,2h),7.37(dd,2h),7.19(s,2h),7.05(dd,2h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),4.34(s,2h),4.24(s,2h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.31(s,6h),2.12
–
1.93(m,2h)。
[0168]
使用的胺为2-苯乙胺，产物为黄色固体b10，收率81％。b10的化学式和和1h nmr数据如下：
[0169][0170]
1h nmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),8.65(s,1h),8.29(d,j＝7.5hz,1h),8.01(s,2h),7.65(d,j＝8.7hz,2h),7.23
–
7.19(m,10h),6.98(s,3h),6.64(d,j＝8.7hz,2h),4.49(d,j＝3.9hz,2h),4.38(ddd,j＝9.5,7.4,5.4hz,1h),3.37(d,2h),3.21(d,2h),2.74(dt,4h),2.42(t,j＝7.4hz,2h),2.12
–
1.93(m,2h).
[0171]
实施例3
[0172]
叶酸衍生物的铁死亡抑制作用
[0173]
铁死亡诱导剂：rsl3；铁死亡抑制剂(对照药)：ferrostatin-1(fer-1)，购自sigma公司。叶酸衍生物a1-a32，b1-b10。所有试剂均用二甲基亚砜dmso配制成10mm的母液，按照需要采用细胞培养基配置成所需浓度。
[0174]
人绒毛膜滋养层细胞htr-8/svneo的培养条件：含10％fbs(gibco)的dmem高糖型培养基(gibco)，37℃，5％co2饱和湿度培养箱。待细胞贴壁后，在培养基中分别加入dmso，rsl3(3μm，终浓度)，rsl3(3μm)+叶酸衍生物梯度浓度，1000、500、250、125、62.5nm，rsl3(3μm)+ferrostatin-1梯度浓度1000、500、250、125、62.5nm。加药处理24小时的ht-1080细胞通过cck8比色法检测细胞活力，cck8试剂盒购自贝博生物，计算半数有效浓度(ec
50
值)，实验重复3次。
[0175]
结果如表1所示，叶酸衍生物均具有显著抑制细胞铁死亡作用，其抑制铁死亡作用的活性与阳性对照药物fer-1相当。其中a2叶酸二乙基酯的半数有效浓度为57.7nm，显著优于fer-1。
[0176]
表1叶酸衍生物对rsl3诱导铁死亡的抑制作用的ec
50
值
[0177][0178]
实施例4
[0179]
叶酸衍生物对其余铁死亡诱导剂的抑制作用及其作用机制
[0180]
铁死亡诱导剂：fin56,sulfasalazine购自阿拉丁试剂公司，fino2购自selleck公司，ml162，ml210，dl-buthionine-(s,r)-sulfoximine(bso)购自mce公司，erastin购自adamas公司。所有试剂及叶酸衍生物均用二甲基亚砜dmso配制成10mm的母液，按照需要采用细胞培养基配置成所需浓度。
[0181]
人绒毛膜滋养层细胞htr-8/svneo的培养条件：含10％fbs(gibco)的dmem高糖型培养基(gibco)，37℃，5％co2饱和湿度培养箱。
[0182]
在上述培养条件下培养htr-8/svneo，待细胞贴壁后，在培养基中分别加入dmso，诱导剂，诱导剂+叶酸衍生物a2(300nm)，诱导剂+叶酸衍生物b1(300nm)。其中诱导剂浓度确
定依据：细胞存活率在30～40％的诱导剂浓度。本实验选择的诱导剂浓度分别为，fin56为8μm；sulfasalazine为250μm；fino2为20μm；ml162为10μm；ml210为90μm；dl-buthionine-(s,r)-sulfoximine(bso)为800μm；erastin为10μm。加药处理24小时的ht-1080细胞通过cck8比色法检测细胞活力，cck8试剂盒购自贝博生物，实验重复3次。如图1所示，叶酸衍生物可以有效地抑制由不同诱导剂引发的铁死亡，提高了细胞的存活率。
[0183]
在上述培养条件下培养htr-8/svneo，待细胞贴壁后，在培养基中分别加入dmso，rsl3，rsl3+叶酸衍生物(300nm)，加药处理6小时后的hrt细胞用胰酶消化成单细胞悬液。叶酸衍生物选择a1，a2，a3，a4，b1，b2。c11-bodipy(10μm)室温避光孵育30分钟，pbs洗3次，流式细胞仪检测细胞膜脂质过氧化水平。如图2所示，叶酸衍生物均可以有效降低细胞膜脂质过氧化水平，能够阻断膜脂质自由基的链式反应，减少自由基对细胞膜的损伤作用，防止细胞铁死亡的发生。
[0184]
实施例5
[0185]
叶酸衍生物对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用
[0186]
8至12周的雄性c57bl/6n小鼠，喂食标准饮食，并进行肾脏缺血再灌注损伤，获得小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型。通过腹部中线切口进行双侧肾柄夹闭，持续36分钟。在整个手术过程中，体温保持在36和37℃之间。移除夹子后，腹部被关闭，允许恢复血流。假手术的小鼠经历了相同的手术过程，除了夹住肾脏梗阻。所有小鼠在再灌注48小时后被杀死。所有缺血再灌注实验均以双盲方式进行。在缺血开始前1小时腹腔注射叶酸衍生物a2(10mg kg-1
)或药物。血清肌酐和尿素在的临床化学研究所测量。组织用he染色，用光镜确定肾衰竭的形态学特征。
[0187]
图3、4结果表明，与肾脏缺血再灌注模型处理组相比，a2处理组坏死区域有明显的减少，a2处理组血清中肌酐、尿素氮的含量有明显的降低(图3)，因此a2对小鼠急性肾脏急性缺血再灌注损伤的具有显著的缓解作用(图4)。
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实施例6
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叶酸二乙基酯对非酒精性脂肪肝损伤的保护作用
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将40只动物按照随机数字表法分为4组，对照组10只给予正常饲料，a2组10只，每日早晨灌胃给予a2(2ml/kg)；高脂组10只给予高脂饲料；治疗组10只，给予高脂饲料且每日早晨灌胃a2(2ml/kg)，所有动物饲养8周后进行肝脏血液生化和病理学检查
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图5、6结果表明，与造模组相比，a2处理组坏死区域有明显的减少，a2处理组血清中alt、ast的含量有明显的降低(图5)，因此a2对高脂的大鼠急性药物性肝损伤的缓解作用(图6)。
[0192]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种叶酸衍生物，其特征在于，包含通式(i)所示的化合物及其在药学上可接受的盐；其中，r为烷基、环烷基、芳基中的一种或多种。2.如权利要求1所述的叶酸衍生物，其特征在于，所述烷基选自含c1～c20烷基，所述环烷基选自具6个原子的脂肪族环状结构，所述芳基选自烷基苯基。3.如权利要求1所述的叶酸衍生物，其特征在于，所述药学上可接受的盐包括盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐中的一种或多种。4.一种权利要求1-3任一项所述的叶酸衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将叶酸与对催化酸溶解于醇或胺中，加热回流反应，反应结束后冷却反应体系至室温，减压浓缩溶剂，抽滤，并用冷的醇或胺洗涤滤饼，滤饼真空干燥，得到粗产品，粗产品进行重结晶，得到叶酸衍生物。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述醇包括烷基醇、环烷基醇和芳基醇中的一种或多种；或，所述胺包括烷基胺、环烷基胺和芳基胺中的一种或多种；优选的，所述烷基醇的烷基选自含c1～c20烷基，所述环烷基醇的环烷基选自具6个原子的脂肪族环状结构，所述芳基醇的芳基选自烷基苯基；优选的，所述烷基胺的烷基选自含c1～c20烷基，所述环烷基胺的环烷基选自具6个原子的脂肪族环状结构，所述芳基胺的芳基选自烷基苯基。6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述催化酸为对苯甲基苯磺酸或硫酸；叶酸和催化酸的摩尔比为1:0.99-1.01。7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，加热回流的温度为79-81℃，反应时间为11-13h。8.一种权利要求1-3任一项所述的叶酸衍生物在制备抑制细胞铁死亡药物中的应用。9.一种权利要求1-3任一项所述的叶酸衍生物在制备防治细胞铁死亡相关疾病药物中的应用，其特征在于，所述细胞铁死亡相关疾病包括非酒精性脂肪肝炎、急性肝损伤、心肌病、药物所致心脏毒性、急性肾损伤、动脉粥样硬化，肾纤维化、肺炎、子痫前期、骨质疏松、骨关节炎、脑外伤、神经退行性疾病中的一种或多种，所述神经退行性疾病包括阿尔兹海默病，帕金森，癫痫中的一种或多种。10.一种权利要求1-3任一项所述的叶酸衍生物在制备防治同型半胱氨酸升高有关疾病药物中的应用，其特征在于，所述疾病包括同型半胱氨酸升高的高血压，脂肪肝，骨质疏松症，子痫前期中的一种或多种。

技术总结
本发明属于医药应用技术领域，具体涉及一种叶酸衍生物及其制备方法和防治铁死亡中的应用。本发明所述叶酸衍生物包含通式(I)所示的化合物及其在药学上可接受的盐，本发明提供的叶酸类化合物通过在R位置上引入亲酯性基团，或特定基团，得到的化合物具有较好的铁死亡抑制活性，可用于治疗非酒精性脂肪肝炎，急性肝损伤，心肌病，药物所致心脏毒性，动脉粥样硬化，急性肾损伤，肾纤维化，肺炎，子痫前期，骨质疏松，骨关节炎，脑外伤，神经退行性疾病包括阿尔兹海默病，帕金森，癫痫等疾病。癫痫等疾病。癫痫等疾病。


技术研发人员：马建平 盛卸晃 韩立聪 张磊 于豆 朱昊 马小杰 郝梦珠 宫傲
受保护的技术使用者：山东师范大学
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/10/6