一种新型冠状病毒样本预处理方法与流程

1.本技术属于生物样本检测领域，尤其涉及一种新型冠状病毒样本预处理方法。


背景技术：

2.在体外诊断领域，特别是在床旁检测(poct)领域中，能够简单、快速、低成本地获取准确的检验结果，是医学检验领域及医疗器械厂商的追求，在此过程中涌现了许多优秀的产品，各厂商也对其产品进行更新迭代。然而，厂商在提高优化产品性能时，常常仅对样本检测试剂进行优化，忽略了检测前的样本前处理步骤。
3.当前，基于金标准的实验室的诊断方法有很多，包括elisa测试、核酸扩增测试或细胞培养方法等，但都不适用于poc筛查。原因在于，以上诊断方法存在对操作人员要求高、仪器设备成本高以及耗时长等问题。
4.相反，基于侧向层析试剂快速诊断技术，具有进行大规模筛，检测试剂无需冷藏储存、操作简便、检测耗时短等优势，并且不需要额外的处理，也不需要检测设备的支持。
5.新冠病毒以胶体金/乳胶微球为示踪物的lfa诊断试剂灵敏度仍低于金标准实验室分析。尤其是当待测样本浓度较低的情况下，检测结果易出现假阴性，导致患者错过最佳治疗时间。
6.对于免疫层析方法检测病原体抗原检测试剂，常常使用鼻咽拭子、口咽拭子等作为采样器，取样后通常使用0.4～1ml的提取洗脱液进行拭子中标志物的洗脱，最后从洗脱液中吸取约3～4滴(体积约70-100微升)进行上样检测。
7.由于这种常规的样本前处理操作步骤常常受到采样不规范导致拭子头含标志物的浓度过少，甚至未采集到足够浓度的标记物，导致临床检测低丰度的抗原未能检出，普遍存在灵敏度低，假阴性高的现实问题。
8.厂商希望通过对下游的检测试剂进行优化进而提升系统整体检测性能往往事倍功半。具体地，针对鼻咽拭子类型的免疫层析技术路线，由于各种类型拭子具有一定程度的吸水性，采用小体积进行洗脱时，常常造成洗脱不完全或因为采样头的吸水性导致标志物的损失。而进行大体积洗脱时，虽然避免了不完全洗脱和吸水性的损失，但又因增大洗脱体积而造成的稀释，降低了标志物的浓度，因而造成了样本前处理的两难境地。除此之外，样本洗脱前处理完成后，还需从洗脱液中吸取更小体积的液体进行样本上样检测最终获得测试结果。
9.针对如前所述的洗脱困境及其衍生的检测上样体积问题，免疫层析、酶联免疫、分子诊断、技术路径的检测试剂常常因此应用受限，为改进试剂性能、提高检测能力，试剂生产厂家常常通过改进下游的试纸条或试剂工艺、选用更高成本的优质原料进行分析检测能力的提升，或进行更高效的标记载体，如大颗粒的胶体金60nm、100nm，甚至150nm大颗粒提高检测灵敏度、胶体碳、彩色乳胶微球等信号放大，引入链霉亲和素-生物素提高检测灵敏度。但相对而言，由此将产品性能提升一倍或几倍几乎不可能。
10.同理，针对其他不同的样本类型如血液、尿液、灌洗液样本类型也常常因为上样体
积较小，样本检测目标物含量、纯度不高而存在检测能力受限、检测场景受限的问题。
11.有文献中提到，通过大颗粒金连接链霉亲和素与生物素化ssdna标记小颗粒金偶联抗体对抗原进行检测，虽然，该方法实现了更高的检测灵敏度，然而在实际使用中，该试纸条容易出现假阳性结果。分析认为，文献报道的这种信号放大系统是一个极不稳定的反应体系。理论上，只要样本中有一个分子就能被这种方法检出。但事实上，免疫学反应中不可能是绝对特异的，背景信号或多或少存在。此时，这种背景信号同样会被放大，进而导致假阳性结果。
12.申请内容为了解决上述至少一种技术问题，开发一种成本低、快速、操作简便、灵敏度高的新型冠状病毒检测方法，本技术提供一种新型冠状病毒样本预处理方法。
13.第一方面，本技术提供一种新型冠状病毒样本预处理方法，所述预处理方法包括如下步骤：s1、将聚乙二醇与pbs缓冲液混合，制备萃取剂a；s2、将pbs缓冲液、磷酸盐和/或硫酸盐混合，制备萃取剂b；s3、将萃取剂a和萃取剂b按体积1～9：1混匀，得到预处理液；s4、提取待测样本，用灭菌拭子蘸取待测样本，加入到提取液内进行混匀，获得待测样本混合液；s5、往预处理液中加入待测样本混合液，进行混匀处理后，进行离心处理，获得萃取剂a和萃取剂b完成分层的浓缩样本；步骤s1所述萃取剂a中，乙二醇与pbs缓冲液的质量比为2～3：2；步骤s2所述萃取剂b中，所述盐在萃取剂b中的质量百分比为1％～40％。
14.可选的，步骤s1所述萃取剂a中，乙二醇与pbs缓冲液的质量比为5～6：4。
15.优选的，步骤s1所述萃取剂a中，乙二醇与pbs缓冲液的质量比为3：2。
16.可选的，步骤s2所述萃取剂b中，所述盐在萃取剂b中的质量百分比为10％～40％。
17.优选的，步骤s2所述萃取剂b中，所述盐在萃取剂b中的质量百分比为20％～40％。
18.优选的，步骤s2所述萃取剂b中，所述盐在萃取剂b中的质量百分比为30％～40％。
19.可选的，步骤s3中萃取剂a和萃取剂b按体积5～9：1混匀，得到预处理液。
20.优选的，步骤s3中萃取剂a和萃取剂b按体积9：1混匀，得到预处理液。
21.可选的，步骤s5所述离心处理中离心处理频率为5000～6000rpm，离心处理时间为2～3min。
22.可选的，步骤s1所述pbs缓冲液浓度为10mol/ml；步骤s2所述pbs缓冲液浓度为10mol/ml。
23.综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：本技术所述一种新型冠状病毒样本预处理方法具有成本低、检测精确度高、灵敏度高、操作简便等优势，可适用于床旁检测(poct)领域中。
附图说明
24.图1本技术制备例1步骤s3获得的预处理液图；图2制备例18步骤s3获得的预处理液图；
图3实施例1步骤s3的完成分相的样本溶液图；图4实施例18步骤s3的完成分相的样本溶液图。
具体实施方式
25.以下结合附图以及实施例对本技术作进一步详细说明。
26.本技术提供一种新型冠状病毒样本预处理方法，所述预处理方法包括如下步骤：s1、将聚乙二醇与pbs缓冲液混合，制备萃取剂a；s2、将pbs缓冲液、磷酸盐和/或硫酸盐混合，制备萃取剂b；s3、将萃取剂a和萃取剂b按体积1～9：1混匀，得到预处理液；s4、提取待测样本，用灭菌拭子蘸取待测样本，加入到提取液内进行混匀，获得待测样本混合液；s5、往预处理液中加入待测样本混合液，进行混匀处理后，进行离心处理，获得萃取剂a和萃取剂b完成分层的浓缩样本；步骤s1所述萃取剂a中，乙二醇与pbs缓冲液的质量比为2～3：2；步骤s2所述萃取剂b中，所述盐在萃取剂b中的质量百分比为1％～40％。
27.通过采用上述技术方案，本技术通过上述预处理方法，能够对新型冠状病毒样本的洗脱液进行浓缩，并且将含病原体抗原的标志物富集至萃取剂b中，再把完成富集的萃取剂b作为检测样本，添加到免疫层析试剂卡上进行显色反应，即可实现对新型冠状病毒的检测，并且实验检测灵敏度最大可以提高约8～10倍左右。
28.由此可知，本技术所述一种新型冠状病毒样本预处理方法与现有技术中的elisa测试、核酸扩增测试或细胞培养方法等相比，解决了以上诊断方法存在的对操作人员要求高、仪器设备成本高、以及耗时长等问题。同时，本技术所述一种新型冠状病毒样本预处理方法，与现有技术中的通过大颗粒金连接链霉亲和素与生物素化ssdna标记小颗粒金偶联抗体，对抗原进行检测的方法相比，解决了低浓度新型冠状病毒样本的抗原检测结果容易出现假阴性的问题。因此，本技术所述一种新型冠状病毒样本预处理方法具有成本低、检测精确度高、操作简便等优势，可适用于床旁检测(poct)领域中。
29.申请人在对新型冠状病毒进行检测时发现，现有技术中存在的新型冠状病毒检测试剂盒虽然具有成本低、快速等优势，但是与作为金标准的诊断方法：elisa测试、核酸扩增测试或细胞培养方法相比，仍存在一些检测结果不精确等现象，尤其是针对低浓度新型冠状病毒进行检测时，出现假阴性的现象较为明显，因此，需要一种不仅快速、成本低、并且能够精确检测低浓度新型冠状病毒样本的检测方法。
30.因此，申请人经过研究，在本技术中提供了一种新型冠状病毒样本预处理方法。本技术通过此方法，能够对新型冠状病毒样本的洗脱液进行浓缩，并且将含病原体抗原的标志物富集至萃取剂b中，再把完成富集的萃取剂b作为检测样本，添加到免疫层析试剂卡上进行显色反应，显色结果显示，实验检测灵敏度与现有技术中的抗原检测试剂盒精确度相比，最大可以提高约8～10倍左右。
31.以下为本技术具体实施例制备例1本制备例提供一种新型冠状病毒样本预处理液，所述预处理液包括萃取剂a和萃
取剂b；本制备例中萃取剂a的总质量为100g。萃取剂b的总质量为24g。
32.s1、萃取剂a的制备：将聚乙二醇与浓度为10mol/ml的pbs缓冲液混合，获得萃取剂a；聚乙二醇和pbs缓冲液的质量比为5：4；s2、萃取剂b的制备：将磷酸二氢钾和浓度为10mol/ml的pbs溶液混匀，获得萃取剂b；在萃取剂b中磷酸二氢钾的浓度为15％；s3、预处理液的制备：将萃取剂a与萃取剂b按体积1：1混匀，得到预处理液；本制备例预处理液图参见图1。
33.制备例2～5制备例2～5与制备例1的区别在于，在制备萃取剂a时，聚乙二醇和pbs缓冲液的混匀比例与制备例1不同，区别部分参见表1；表1-制备例2～5与制备例1的区别部分汇总表制备例6～14制备例6～14与制备例4的区别在于，在制备萃取剂b时，所述磷酸二氢钾在萃取剂b中的浓度与制备例4不同，区别部分参见表2；表2-制备例6～14与制备例4的区别部分汇总表制备例15～18制备例15～18与制备例14的区别在于，在步骤s3制备预处理液时，萃取剂a和萃取剂b的混匀体积比例与制备例14不同，区别部分参见表3；表3-制备例15～18与制备例14的区别部分汇总表
制备例18将萃取剂a与萃取剂b按体积9：1混匀后获得的预处理液图参见图2；制备例19～22制备例19～22与制备例18的区别在于，在制备萃取剂b时，所使用的盐不同。制备例19～22与制备例18的区别部分参见表4；表4-制备例19～22与制备例18的区别部分汇总表实施例1本实施例提供一种新型冠状病毒样本预处理方法，所述预处理方法包括如下步骤：s1、将已灭活新冠病毒(sars-cov-2)培养液(购自nibsc)，在生理盐水中分别稀释至400倍、800倍、1600倍、3200倍、6400倍、9600倍、12800倍、16000倍、19200倍、22400倍、25600倍、28800倍、32000倍，混匀，制得待测样本；s2、用灭菌拭子蘸取待测样本，并加入到样本提取液内进行混匀至少20次，进行洗脱处理，获得待测样本混合液；s3、往由制备例1获得的预处理液中，加入待测样本混合液，混匀后进行离心处理，离心处理完成后获得萃取剂a和萃取剂b完成分层的浓缩样本，并将获得的浓缩样本作为待检测样本备用；
步骤s3中离心处理时，所使用的离心机型号为如下：迷你离心机，型号：cf0201001，离心频率为5000rpm，时间3min。
34.本实施例步骤s3中，稀释浓度为12800倍完成分层的待测样本混合液图，参见图3；实施例2～22实施例2～22与实施例1的区别在于，在步骤s3中使用的预处理液与实施例1不同，区别部分参见表5；表5-实施例2～22与实施例1的区别部分汇总表；每个实施例步骤s4中，已灭活新冠病毒(sars-cov-2)培养液，在生理盐水中依次稀释400倍、800倍、1600倍、3200倍、6400倍、9600倍、12800倍、16000倍、19200倍、22400倍、25600倍、28800倍、32000倍后的病毒载量参见表6和表9。
35.实施例18步骤s3中稀释浓度为12800倍，完成分层的待测样本混合液图，参见图4；实施例23本实施例与实施例18的区别在于，本实施例步骤s3中离心处理频率为6000rpm，时间为2min。
36.以下为本技术对比例对比例1本对比例与实施例1的区别在于，本对比例对已灭活新冠病毒(sars-cov-2)培养液的预处理方法包括如下步骤：s1、将已灭活新冠病毒(sars-cov-2)培养液(购自nibsc)，在生理盐水中分别稀释至400倍、800倍、1600倍、3200倍、6400倍、9600倍、12800倍、16000倍、19200倍、22400倍、25600倍、28800倍、32000倍，混匀，制得待测样本；s2、用灭菌拭子蘸取待测样本，并加入到样本提取液内进行混匀至少20次，进行洗
脱处理，获得待测样本混合液，作为待检测样本备用。
37.性能检测、显色实验本实验对由实施例1～23以及对比例1获得的待检测样本，进行免疫层析显色实验，包括如下步骤：往新型冠状病毒抗原检测试剂卡中，分别加入75ml完成分层的浓缩样本待测样本混合液，等待15～20min，待显色，每份样本重复3次，显色完成后观察显色情况，显色结束后，参考试剂盒产品说明书进行判断和使用标准比色卡判定结果。
38.本实验中新型冠状病毒抗原检测试剂购自厂家为如下：深圳市科瑞康实业有限公司。产品名称为：新冠抗原检测试剂盒本实验稀释倍数为400～6400倍的样本的显色结果参见表6～8；表6-实施例1～5中稀释倍数为400～6400倍的样本显色结果汇总表表7
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实施例6～14中稀释倍数为400～6400倍的样本显色结果汇总表
表8-实施例15～23以及对比例1中稀释倍数为400～6400倍的样本显色结果汇总表
结果分析：从表6～8提供的显色结果可知，样本经过实施例1～23提供的预处理方法预处理后，稀释400～6400倍，均能通过免疫层析试剂卡能够对其进行精确的检测。
39.而经过对比例1提供的预处理方法预处理的样本，稀释400～6400倍时，免疫层析试剂卡只能检测释倍数为3200倍及3200倍以下的样本。由此可知，样本经过本技术提供的预处理方法预处理后，检测精确度比对比例提高了2倍。
40.以下表9～11为稀释倍数为9600～32000倍的样本的显色结果。
41.表9-实施例1～5中稀释倍数为9600～32000倍的样本的显色结果汇总表
结果分析：实施例2～5与实施例1的区别在于，在制备萃取剂a时，聚乙二醇和pbs缓冲液的混匀比例与制备例1不同，从表9提供的显色结果可知，当样本经过实施例1、实施例3、实施例4提供的预处理方法预处理后，稀释400～9600倍时，均能通过免疫层析试剂卡能够对其进行精确的检测。
42.而经过实施列2，实施例5提供的预处理方法预处理后的样本，稀释倍数为400～9600倍时，免疫层析试剂卡只能检测释倍数为6400倍及以下的样本。
43.由此可知，在制备萃取剂a时，聚乙二醇和pbs缓冲液的混匀比例会影响检测精确度，当聚乙二醇和pbs缓冲液的比例为3：2时检测精确度较佳。
44.表10-实施例6～14稀释倍数为9600～32000倍的样本的显色结果汇总表
结果分析：实施例6～14与实施例4的区别在于，在制备萃取剂b时，所述磷酸二氢钾在萃取剂b中的浓度与制备例4不同。
45.从表10提供的显色结果可知，当磷酸二氢钾在萃取剂b中的浓度为30％～40％左右时，样本经过本技术提供的预处理方法预处理后，本实验的检测精确度与对比例1相比，可提高5倍。
46.表11-实施例15～23稀释倍数为9600～32000倍的样本的显色结果汇总表
结果分析：由表11可知，实施例15～18与实施例14的区别在于，在制备预处理液时，萃取剂a和萃取剂b的混匀体积比例与实施例14不同，从表11提供的显色结果可知，萃取剂a和萃取剂b的混匀比例会影响显色精确度。当萃取剂a和萃取剂b的混匀比例为9:1时，检测精确度是对比例1的9倍。由此可知，本技术提供的预处理方法能够提高对新型冠状病毒的检测精确度。
47.参见图1可知，在制备例1步骤s3中，萃取剂a和萃取剂b以体积比为1:1混匀时，未出现分层。
48.参见图2可知，在制备例18步骤s3中，萃取剂a和萃取剂b以体积比为9:1混匀时，未出现分层。
49.参见图3可知，在实施例1步骤s3中，往预处理液中加入稀释12800倍的待测样本混合液，混匀后离心处理，离心处理后获得的预处理液分离形成两个等体积相，分别为高peg富相和低peg贫相。参见图3可知，底部peg贫相中的新冠病毒培养液浓度显著增加，由此可知，本技术通过一种新型冠状病毒样本预处理方法能够有效提高新型冠状病毒抗原检测试剂的检测限。
50.参见图4可知，在实施例18步骤s3中，往预处理液中加入稀释12800倍的待测样本混合液，混匀后离心处理，离心处理后获得的预处理液分离形成两个相，高peg富相和低peg
贫相。底部peg贫相中的新冠病毒培养液浓度显著增加，从而提高新型冠状病毒抗原检测试剂的检测限。
51.综上所述，本技术的检测方法具有快速，灵敏(检测限与定量限分别提高了9倍)，安全有效，操作简单能广泛应用于各种新型冠状病毒(covid19)的场景中的优势。甚至可以在同一管洗脱液中增加采样拭子数或其他采样器数目进行多人混检，以进行社区病例快速筛查并降低成本。
52.以上均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种新型冠状病毒样本预处理方法，其特征在于，所述预处理方法包括如下步骤：s1、将聚乙二醇与pbs缓冲液混合，制备萃取剂a；s2、将pbs缓冲液、磷酸盐和/或硫酸盐混合，制备萃取剂b；s3、将萃取剂a和萃取剂b按体积1~9：1混匀，得到预处理液；s4、提取待测样本，用灭菌拭子蘸取待测样本，加入到提取液内进行混匀，获得待测样本混合液；s5、往预处理液中加入待测样本混合液，进行混匀处理后，进行离心处理，获得萃取剂a和萃取剂b完成分层的浓缩样本；步骤s1所述萃取剂a中，乙二醇与pbs缓冲液的质量比为2~3：2；步骤s2所述萃取剂b中，所述盐在萃取剂b中的质量百分比为1%~40%。2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒样本预处理方法，其特征在于，步骤s1所述萃取剂a中，乙二醇与pbs缓冲液的质量比为5~6：4。3.根据权利要求2所述的一种新型冠状病毒样本预处理方法，其特征在于，步骤s1所述萃取剂a中，乙二醇与pbs缓冲液的质量比为3：2。4.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒样本预处理方法，其特征在于，步骤s2所述萃取剂b中，所述盐在萃取剂b中的质量百分比为10%~40%。5.根据权利要求4所述的一种新型冠状病毒样本预处理方法，其特征在于，步骤s2所述萃取剂b中，所述盐在萃取剂b中的质量百分比为20%~40%。6.根据权利要求5所述的一种新型冠状病毒样本预处理方法，其特征在于，步骤s2所述萃取剂b中，所述盐在萃取剂b中的质量百分比为30%~40%。7.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒样本预处理方法，其特征在于，步骤s3中萃取剂a和萃取剂b按体积5~9：1混匀，得到预处理液。8.根据权利要求7所述的一种新型冠状病毒样本预处理方法，其特征在于，步骤s3中萃取剂a和萃取剂b按体积9：1混匀，得到预处理液。9.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒样本预处理方法，其特征在于，步骤s5所述离心处理中离心处理频率为5000~6000rpm，离心处理时间为2~3min。10.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒样本预处理方法，其特征在于，步骤s1所述pbs缓冲液浓度为10mol/ml；步骤s2所述pbs缓冲液浓度为10mol/ml。

技术总结
本申请公开了一种新型冠状病毒样本预处理方法，本申请所述一种新型冠状病毒样本预处理方法的优点在于，所述预处理方法能够对新型冠状病毒样本进行快速地富集、浓缩及纯化，从而提高检测精确度，因此，本申请所述一种新型冠状病毒样本预处理方法具有检测灵敏度高、精确度高、成本低、操作简便等优势。操作简便等优势。操作简便等优势。


技术研发人员：王琦 肖宇强 陈粤秀 曹尹亮 刘时宇 李君秀
受保护的技术使用者：相达生物科技（深圳）有限公司
技术研发日：2023.07.01
技术公布日：2023/10/6