利用CRISPR基因编辑敲入超长DNA技术同时表达多种酶的方法与流程

利用crispr基因编辑敲入超长dna技术同时表达多种酶的方法
技术领域
1.本发明涉及利用crispr基因编辑敲入超长dna技术同时表达多种酶的方法。


背景技术：

2.传统技术是每次将一个基因克隆至毕赤酵母表达载体，每次发酵只能生产一种酶。想要多表达几种酶时，需要分多次构建、多次转化、多次筛选、多次发酵产酶、多次检测，然后混合使用，效率非常低下。现有较先进技术一次表达多种酶时，需要事先对毕赤酵母进行基因改造，将毕赤酵母中的ku70基因敲除掉以减弱细胞的非同源末端修复机制(nhej)，增强同源重组修复机制(dhr)，基因改造过程繁琐，耗费时间。插入位点为在启动子ptef1-a、pfld1、paox1、pgap上游100bp或终止子aoxtt下游100b，此位点的选择没有跟减弱细胞的非同源末端修复机制结合起来，导致步骤繁琐，效率低下。能够敲入的dna长度较短，达不到超长dna的水平；表达的酶的数量也较少，一般不超过5种酶。而且由于表达多个酶，细胞负担较重，却没有增强表达的元件，每种酶的表达量都比较低，不适应生产需要。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种利用crispr基因编辑敲入超长dna技术同时表达多种酶的方法，以解决上述背景技术中遇到的问题。
4.为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
5.一种利用crispr基因编辑敲入超长dna技术同时表达多种酶的方法，其特征在于其步骤包括：
6.(1)设计超长dna
7.设计超长dna，包括g418抗性表达序列-his表达序列-ku70基因上游同源臂-增强子-aox1启动子-α因子-基因1-增强子-aox1启动子-α因子-基因2
…
增强子-aox1启动子-α因子-基因n-aox1tt-ku70基因下游同源臂，在该超长dna的两端含有酶切位点；
8.(2)利用生物信息学拆分超长dna
9.利用生物信息学将超长dna拆分成5-10个分片段，相邻分片段间含有同源臂，同源臂避开与其它无关片段同源性高的部位；将分片段拆分成5-10个小片段，相邻小片段间含有同源臂，同源臂避开与其它无关片段同源性高的部位；把小片段拆分为若干100nt左右的长引物，相邻长引物间含有同源臂，同源臂避开与其它无关长引物同源性高的部位；
10.(3)组装超长dna
11.利用pcr方法将若干长引物组装成小片段；将小片段和酶切后的组装载体在重组酶的作用下组装成分片段；将分片段和酶切后的组装载体在重组酶的作用下组装成超长dna；
12.(4)设计并合成ku70基因的sgrna
13.设计并合成若干条ku70基因的sgrna，均位于ku70基因的靠近中间位置，且不与
ku70基因上游及下游同源臂匹配，通常设计3条sgrna；
14.(5)构建基因编辑质粒
15.将ku70基因的sgrna构建入可同时表达sgrna和cas9蛋白的毕赤酵母基因编辑质粒中；
16.(6)超长dna线性化
17.超长dna经酶切线性化；
18.(7)转化毕赤酵母
19.将构建好的基因编辑质粒与线性化的超长dna混合后一同转化入毕赤酵母gs115感受态细胞中；
20.(8)筛选含有超长dna的阳性克隆菌株
21.通过his缺陷和g418抗性进行初步筛选，然后通过pcr方法验证阳性克隆菌株，得到能够一次发酵在同一菌株中同时表达n种酶的毕赤酵母。
22.优选的，所述增强子的序列如seq id no.6所示。
23.优选的，所述n为10。
24.优选的，所述ku70基因前端的序列如seq id no.7所示，ku70基因后端的序列如seq id no.8所示。
25.优选的，所述sgrna的序列分别如seq id no.9、seq id no.10和seq id no.11所示。
26.优选的，超长dna两端的酶切位点为ecori和noti。
27.本发明提供了一种利用crispr基因编辑技术敲入超长dna同时表达多种酶的方法，只需一次构建一次发酵就能表达多种酶；无需事先对毕赤酵母进行基因改造，超长dna的插入位点选择的是gs115的ku70基因内部，在利用crispr基因编辑技术敲入超长dna的同时完成敲除gs115的ku70基因的菌株改造，节省时间的同时，与减弱细胞的非同源末端修复机制增强同源重组修复机制结合起来，可以减弱细胞的非同源末端修复机制(nhej)，增强同源重组修复机制(dhr)，效率更高；每个基因启动子前加个增强子，可以增强基因的表达，每种基因的表达量均较高高；能够敲入的dna长度更长，达到超长dna的水平；基因数量更多，能表达的酶的数量更多，可以一次发酵在同一菌株中表达10种酶。
附图说明
28.图1为本发明与现有技术相比的流程对照图；
29.图2为本发明与现有技术相比的产酶数量对比图，图中a：protein ladder，b：使用本发明实施例1的方法同时表达10种酶，包括基因1、基因2...基因10，c-l：使用传统方法一次只表达一种酶，分别为基因1、基因2...基因10；
30.图3为实施例1构建的超长dna的图谱；
31.图4为含有10个基因超长dna表达框的质粒图谱。
具体实施方式
32.下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明，图1展示了本发明与现有技术相比的流程对照。
33.实施例1利用crispr基因编辑敲入超长dna的技术同时表达多种酶的方法，包括如下步骤：
34.(1)设计超长dna
35.设计超长dna，包括g418抗性表达序列-his表达序列-ku70基因上游同源臂-增强子-aox1启动子-α因子-基因1-增强子-aox1启动子-α因子-基因2
…
增强子-aox1启动子-α因子-基因10-aox1tt-ku70基因下游同源臂，在该超长dna的两端含有酶切位点；
36.(2)利用生物信息学拆分超长dna
37.利用生物信息学将超长dna拆分成8个分片段，相邻分片段间含有同源臂，同源臂避开与其它无关片段同源性高的部位；将分片段拆分成8个小片段，相邻小片段间含有同源臂，同源臂避开与其它无关片段同源性高的部位；把小片段拆分为若干100nt左右的长引物，相邻长引物间含有同源臂，同源臂避开与其它无关长引物同源性高的部位；
38.(3)超长dna的组装。
39.利用pcr的方法将若干长引物合成小片段，相邻小片段间带有同源臂；
40.利用重组酶将8个小片段与线性化的组装载体进行组装成分片段，分片段两端加入酶切位点，优选的，酶切位点为bamh1和kpn1；
41.载体线性化酶切体系：
[0042][0043][0044]
37℃下反应2h；
[0045]
将分片段从载体上酶切下来；
[0046]
分片段酶切体系：
[0047][0048]
37℃下反应2h；
[0049]
利用重组酶将8个分片段与在线性化的组装载体上构建超长dna，此超长dna包括：g418抗性表达序列-his表达序列-ku70基因上游同源臂-增强子-aox1启动子-α因子-基因1-增强子-aox1启动子-α因子-基因2
…
增强子-aox1启动子-α因子-基因10-aox1tt-ku70基
因下游同源臂，超长dna两端含有酶切位点，优选的，酶切位点为ecori和noti；
[0050]
重组体系：
[0051][0052]
50℃下反应1h；
[0053]
超长dna序列为seq id no.1-5顺序串联起来的序列。超长dna序列长达46542bp，将其拆分成seq id no.1-5来显示。
[0054]
超长dna的图谱如图3；
[0055]
含有超长dna的质粒图谱如图4；
[0056]
增强子序列如seq id no.6所示；
[0057]
ku70基因前端500bp序列如seq id no.7所示；
[0058]
ku70基因后端500bp序列如seq id no.8所示；
[0059]
(4)设计ku70基因的sgrna
[0060]
在靠近ku70基因中间序列的位置设计3条sgrna；
[0061]
所述sgrna靶向靠近ku70基因中间序列的靶点，所述sgrna靶点位于ku70基因序列3条sgrna序列分别如seq id no.9、seq id no.10和seq id no.11所示；
[0062]
(5)构建基因编辑质粒
[0063]
将3条ku70基因的sgrna构建入可同时表达sgrna和cas9蛋白的毕赤酵母基因编辑质粒ppp-hcas9-sgrna中；
[0064]
(6)超长dna线性化
[0065]
将步骤(1)构建的超长dna经ecori和noti酶切线性化；线性化的超长dna包含g418抗性表达序列-his表达序列-ku70基因上游同源臂-增强子-aox1启动子-α因子-基因1-增强子-aox1启动子-α因子-基因2
…
增强子-aox1启动子-α因子-基因10-aox1tt-ku70基因下游同源臂，n＝10，ku70基因上游同源臂和ku70基因下游同源臂作为同源重组的同源臂，优选的，同源臂长度为500bp；
[0066]
酶切体系如下：
[0067]
[0068]
(7)转化毕赤酵母
[0069]
将步骤(3)构建好的基因编辑质粒与步骤(4)线性化的超长dna混合后一同转化入毕赤酵母gs115感受态细胞中；
[0070]
(8)筛选含有超长dna的阳性克隆菌株
[0071]
通过his缺陷和g418抗性进行初步筛选，然后用2对pcr引物通过pcr方法验证阳性克隆菌株，得到基因组中含有多种酶基因的毕赤酵母；所述2对pcr引物为：pf1：aaacaaataggggttccgcg(seq id no.15)，pr1：tggtacaattgtttcatcatttcca(seq id no.16)；pf2：aagaagccaaagacccccac(seq id no.17)，pr2：ggacagtgctccgagaacg(seq id no.18)；
[0072]
(9)将含有超长dna的毕赤酵母工程菌转接入含有10ml bmgy培养基带透气塞的50ml离心管，在30℃，200-260rpm条件下进行摇床培养至od600＝1-7；
[0073]
(10)5000rpm离心5min收集菌体；
[0074]
(11)菌体重悬于bmm培养基，200-260rpm条件下进行摇床培养，每24h加0.5％甲醇诱导，培养5-7天；
[0075]
(12)5000rpm离心1min收集发酵液，得到粗酶液；
[0076]
(13)跑sds
–
page胶鉴定分泌蛋白，评估是否在同一菌株中表达10种酶，结果如图2所示。
[0077]
对比例1多次构建多次发酵生产多酶制剂的方法
[0078]
包括如下步骤：
[0079]
(1)化学合成10个基因序列，分别为基因1、基因2...基因10，各序列两端包含ecori和not1酶切位点序列；
[0080]
(2)片段和载体ppic9k均经ecori和not1双酶切，酶切体系如下：
[0081][0082]
(3)将酶切后的序列分别与酶切后的ppic9k载体连接，得到10个表达质粒，连接体系如下：
[0083]
[0084]
(4)将10个连接产物分别转化入大肠杆菌top10感受态细胞；
[0085]
(5)涂布含氨苄青霉素的平板；
[0086]
(6)pcr检测阳性克隆；
[0087]
(7)扩大培养并用质粒小提试剂盒抽提质粒，得到10种目的质粒；
[0088]
(8)10种质粒均用saci酶切线性化，酶切体系如下：
[0089][0090]
(9)跑1％的agarose琼脂糖凝胶确认重组质粒完全线性化；
[0091]
(10)将10个线性化的质粒分别电转化入毕赤酵母感受态细胞中，200-260rpm条件下进行摇床培养1h，5000rpm离心5min收集菌体；
[0092]
(11)将10种菌体涂布在his缺陷平板上培养2-3天，挑选阳性单菌落；
[0093]
(12)通过4mg/ml g418的平板筛选出10种阳性毕赤酵母菌；
[0094]
(13)将10种阳性毕赤酵母菌转接入含有10ml bmgy培养基带透气塞的50ml离心管，在30℃，200-260rpm条件下进行摇床培养至od600＝1-7；
[0095]
(14)5000rpm离心5min收集菌体；
[0096]
(15)10种阳性毕赤酵母菌重悬于bmm培养基，200-260rpm条件下进行摇床培养，每24h加0.5％甲醇诱导，培养5-7天；
[0097]
(16)5000rpm离心1min收集10种发酵液，得到10种粗酶液；
[0098]
(17)跑sds
–
page胶鉴定10种分泌蛋白，评估10种蛋白的表达水平，结果如图2所示。
[0099]
对比例2需预先菌株改造的多启动子的酶种较少的多酶制备方法，包括如下步骤：
[0100]
(1)构建ku70基因敲除的毕赤酵母菌株；
[0101]
(2)含有基因数目较少(≤5个基因)的dna的合成。
[0102]
利用pcr的方法合成分片段，分片段间带有同源臂；
[0103]
利用重组酶将分片段与线性化的组装载体进行组装；
[0104]
此含基因数目较少(≤5个基因)的dna包括：aox1启动子上游100bp前同源臂-aox1启动子-α因子-基因1...aox1启动子-α因子-基因n-aox1tt-aox1启动子上游100bp后同源臂，n＝1-5，超长dna两端含有酶切位点，优选的，酶切位点为ecori和noti；
[0105]
(3)设计aox1启动子上游100bp处的sgrna
[0106]
在靠近aox1启动子上游100bp处设计3条sgrna；
[0107]
3条sgrna序列分别如seq id no.12、seq id no.13和seq id no.14所示；
[0108]
(4)构建基因编辑质粒
[0109]
将在靠近aox1启动子上游100bp处设计的3条sgrna构建入毕赤酵母基因编辑质粒ppp-hcas9-sgrna中；
[0110]
(5)超长dna线性化
[0111]
将步骤(1)构建的超长dna经ecori和noti酶切线性化；
[0112]
酶切体系如下：
[0113][0114]
(6)转化毕赤酵母
[0115]
将步骤(3)构建好的基因编辑质粒与步骤(4)线性化的超长dna混合后一同转化入毕赤酵母gs115感受态细胞中；
[0116]
(7)筛选含有5个插入基因的阳性克隆菌株
[0117]
通过his缺陷和g418抗性进行初步筛选，然后通过pcr方法验证阳性克隆菌株，得到基因组中含有多种酶基因的毕赤酵母；
[0118]
(8)将含有5个插入基因的毕赤酵母工程菌转接入含有10ml bmgy培养基带透气塞的50ml离心管，在30℃，200-260rpm条件下进行摇床培养至od600＝1-7；
[0119]
(9)5000rpm离心5min收集菌体；
[0120]
(10)菌体重悬于bmm培养基，200-260rpm条件下进行摇床培养，每24h加0.5％甲醇诱导，培养5-7天；
[0121]
(11)5000rpm离心1min收集发酵液，得到粗酶液；
[0122]
(12)跑sds
–
page胶鉴定分泌蛋白，评估是否在同一菌株中表达5种酶。
[0123]
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式，并不用于限定本发明保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种利用crispr基因编辑敲入超长dna技术同时表达多种酶的方法，其特征在于其步骤包括：(1)设计超长dna设计超长dna，包括g418抗性表达序列-his表达序列-ku70基因上游同源臂-增强子-aox1启动子-α因子-基因1-增强子-aox1启动子-α因子-基因2
…
增强子-aox1启动子-α因子-基因n-aox1tt-ku70基因下游同源臂，在该超长dna的两端含有酶切位点；(2)利用生物信息学拆分超长dna利用生物信息学将超长dna拆分成5-10个分片段，相邻分片段间含有同源臂，同源臂避开与其它无关片段同源性高的部位；将分片段拆分成5-10个小片段，相邻小片段间含有同源臂，同源臂避开与其它无关片段同源性高的部位；把小片段拆分为若干100nt左右的长引物，相邻长引物间含有同源臂，同源臂避开与其它无关长引物同源性高的部位；(3)组装超长dna利用pcr方法将若干长引物组装成小片段；将小片段和酶切后的组装载体在重组酶的作用下组装成分片段；将分片段和酶切后的组装载体在重组酶的作用下组装成超长dna；(4)设计并合成ku70基因的sgrna设计并合成若干条ku70基因的sgrna，均位于ku70基因的靠近中间位置，不与ku70基因上游及下游同源臂匹配；(5)构建基因编辑质粒将ku70基因的sgrna构建入可以同时表达sgrna和cas9蛋白的毕赤酵母基因编辑质粒中；(6)超长dna线性化超长dna经酶切线性化；(7)转化毕赤酵母将构建好的基因编辑质粒与线性化的超长dna混合后一同转化入毕赤酵母gs115感受态细胞中；(8)筛选含有超长dna的阳性克隆菌株通过his缺陷和g418抗性进行初步筛选，然后通过pcr方法验证阳性克隆菌株，得到能够一次发酵在同一菌株中同时表达n种酶的毕赤酵母。2.根据权利要求1所述的利用crispr基因编辑敲入超长dna技术同时表达多种酶的方法，其特征在于所述增强子的序列如seq id no.6所示。3.根据权利要求1所述的利用crispr基因编辑敲入超长dna技术同时表达多种酶的方法，其特征在于所述n为5-20的自然数。4.根据权利要求1所述的利用crispr基因编辑敲入超长dna技术同时表达多种酶的方法，其特征在于所述ku70基因上游同源臂的序列如seq id no.7所示，ku70基因下游同源臂的序列如seq id no.8所示。5.根据权利要求1所述的利用crispr基因编辑敲入超长dna技术同时表达多种酶的方法，其特征在于所述sgrna有三条，其序列分别如seq id no.9、seq id no.10和seq id no.11所示。6.根据权利要求1所述的利用crispr基因编辑敲入超长dna技术同时表达多种酶的方
法，其特征在于超长dna两端的酶切位点为ecori和noti。

技术总结
本发明公开了一种利用CRISPR基因编辑敲入超长DNA技术同时表达多种酶的方法，只需一次构建一次发酵就能表达多种酶；使用合成生物学对超长DNA进行从头设计合成；无需事先对毕赤酵母进行基因改造，超长DNA的插入位点选择的是GS115的KU70基因内部，在利用CRISPR基因编辑技术敲入超长DNA的同时完成敲除GS115的KU70基因的菌株改造，节省时间的同时，与减弱细胞的非同源末端修复机制增强同源重组修复机制结合起来，可以减弱细胞的非同源末端修复机制(NHEJ)，增强同源重组修复机制(DHR)，效率更高；每个基因启动子前加个增强子，可以增强基因的表达，每个基因的表达量均较高。每个基因的表达量均较高。每个基因的表达量均较高。


技术研发人员：朱佑民
受保护的技术使用者：上海国龙生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.04
技术公布日：2023/10/6