一种指导帕金森病用药的基因多态性快速检测引物组及试剂盒的制作方法

1.本发明应用于基因检测技术领域，具体涉及一种指导帕金森病用药的基因多态性快速检测引物组及试剂盒。


背景技术：

2.帕金森病(pd)是我国第二大常见的神经系统退行性疾病，一旦患病则需终身治疗，药物治疗仍是目前最主要的治疗手段。左旋多巴是治疗帕金森病的标准疗法，是帕金森病药物治疗中最有效的对症治疗药物。虽然左旋多巴治疗可改善患者的运动症状，但并非所有患者都能达到满意的治疗效果，帕金森病患者的临床特征、病程以及药物治疗反应存在显著的个体化差异。许多患者长期服药后可能出现以剂末现象和异动症为代表的运动并发症，还可能诱发胃肠道反应、神经精神症状、自主神经功能障碍。遗传学和药物基因组学在个体化治疗的研究和开发中发挥了核心作用，个体化治疗可以帮助临床医生迅速确定最适药物、药物剂量和给药时间，从而达到最好的治疗效果并减少长期服用多巴胺能药物导致的并发症。
3.多巴胺受体d3(dopamine receptor d3，drd3)是帕金森病药物基因组学的主要研究基因。多巴胺受体基因的遗传变异是决定多巴胺能药物产生不同药物效应的重要因素。drd3基因位于3q13.3染色体，带有大量单核苷酸多态性(single-nucleotidepolymorphisms，snps)，其中drd3ser9gly(rs6280)是drd3基因关联研究中最热门的多态位点。该drd3 ser9gly位点在9号密码子丝氨酸(ser)变为甘氨酸(gly)，gly等位基因携带者对内源性多巴胺的亲和力比ser等位基因携带者高达4～5倍，因此对多巴胺能的药物反应更好。研究报道，与基因型ser/ser相比，基因型ser/gly和gly/gly与帕金森病患者因左旋多巴而产生幻觉的可能性增加有关；与基因型ser/ser和ser/gly相比，基因型gly/gly患者胃肠道毒性风险增加。
4.儿茶酚-o-甲基转移酶(catechol-o-methyltransferase，comt)基因是帕金森病药物遗传基因组学研究中最热门的基因之一。comt是将儿茶酚胺o-甲基化的酶，在外周降解左旋多巴为3-o-甲基多巴(3-o-methylevodopa，3-omd)。在人体组织中comt的活性水平与基因多态性相关。comt基因型频率在不同种群之间不同，约25％高加索人群是纯合的低活性基因型，约10％的亚洲人群是纯合的低活性基因型。met等位基因使comt酶活性降低从而增加突触内的多巴胺水平，通过突触传递，增加了神经元突触后膜的多巴胺刺激。因此，comt基因型也可以影响左旋多巴的治疗效果，低活性的comt基因型携带者表现出对多左旋多巴较好的治疗反应。目前已有许多关于comt基因多态性与帕金森病患者对左旋多巴药物疗效的研究报道。功能性comt基因单倍型(低《中《高)与平均左旋多巴剂量增加有关，所以高活性单倍型携带者的用药剂量比非携带者的用药剂量显著增高。此外，研究还报道携带comt基因met/met等位基因会增加左旋多巴诱导异动症风险。
5.homer1基因编码的蛋白质属树突蛋白homer家族的成员，是一种在谷氨酸传递中
起关键作用的蛋白质，与帕金森病并发症的发病机制有关，且homer1基因启动子区域的多态性与左旋多巴治疗慢性并发症的发生有关，研究表明携带homer1 rs4704559位点aa基因型的患者在接受左旋多巴治疗时发生不良反应((包括幻觉和运动障碍))的风险可能增加。
6.有机阳离子转运体1(organic cation transporters 1，oct1/slc22a1)是一类特异性有机阳离子转运体，属于slc转运体超家族，与多巴胺的转运相关。研究发现，抗帕金森病药物剂量与slc22a1/oct1的rs622342多态位点的相关性，带有c等位基因的患者使用的抗帕金森药物剂量更高；与ac或cc基因型患者相比，aa基因型可以降低死亡风险。此外，在其他抗帕金森药中，例如抗胆碱能药(苯海索)、抗谷氨酸能药物(金刚烷胺)，等位基因c患者用药剂量也增加。
7.药物代谢酶相关基因多态性影响许多药物的代谢率，不仅影响治疗效果，而且会增加不良反应的危险性。因此，根据个体与药物治疗相关的代谢酶转运体和受体的遗传变异制定不同的治疗方案，对于帕金森病人实现药物治疗个体化具有重大的临床意义。
8.目前检测基因多态性(snp)的方法主要有直接测序法、芯片法、质谱法、taqman法、高分辨率熔解曲线法等。测序法和基因芯片法对检测结果具有很高的精度，其依赖大型精密仪器设备、固定实验室以及专业操作人员，因此，这两种检测方法成本高，步骤繁琐并且耗时长，在临床上很难进行推广。taqman法和高分辨率熔解曲线法均是基于荧光定量pcr技术，操作简单，但taqman实时荧光pcr法的通量低，一般一个反应只能检测一个snp位点；高分辨率熔解曲线通过对pcr产物的熔解峰进行分析，通量高，但对设备的要求也较高。因此，改进taqman法和高分辨率熔解曲线法，提供一种简单、快速、准确、成本低廉的用于左旋多巴用药基因多态性检测的引物组合及试剂盒就成为该技术领域急需解决的技术难题。


技术实现要素：

9.为了弥补现有技术的不足，本发明提供一种指导帕金森病用药的基因多态性快速检测引物组及试剂盒。本发明可快速对帕金森病治疗药物的drd3、comt、homer1和slc22a1四种基因多态性进行检测，为医生提供用药依据，从而避免患者用药错误，提高用药的性价比。
10.本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：
11.本发明的第一个目的在于提供一种指导帕金森病用药的基因多态性快速检测引物组，其特征在于，包括用于检测rs6280位点多态性的引物和探针组合、用于检测rs4680位点多态性的引物和探针组合、用于检测rs4704559位点多态性的引物和探针组合以及用于检测位点多态性的引物和探针组合；所述引物组的核苷酸序列为：
12.comt rs4680的上游引物如序列seq iq no.1所示，
13.comt rs4680的下游引物如序列seq iq no.2所示，
14.comt rs4680的野生型探针如序列seq iq no.3所示，
15.comt rs4680的突变型探针如序列seq iq no.4所示，
16.homer1 rs4704559的上游引物如序列seq iq no.5所示，
17.homer1 rs4704559的下游引物如序列seq iq no.6所示，
18.homer1 rs4704559的野生型探针如序列seq iq no.7所示，
19.homer1 rs4704559的突变型探针如序列seq iq no.8所示，
20.ddr3 rs6280的上游引物如序列seq iq no.9所示，
21.ddr3 rs6280的下游引物如序列seq iq no.10所示，
22.ddr3 rs6280的野生型探针如序列seq iq no.11所示，
23.ddr3 rs6280的突变型探针如序列seq iq no.12所示，
24.slc22a1 rs622342的上游引物如序列seq iq no.13所示，
25.slc22a1 rs622342的下游引物如序列seq iq no.14所示，
26.slc22a1 rs622342的野生型探针如序列seq iq no.15所示，
27.slc22a1 rs622342的突变型探针如序列seq iq no.16所示。
28.进一步的，所述comt rs4680、ddr3 rs6280两个基因位点的检测需引入媒介序列，所述媒介序列如seq iq no.17所示。
29.进一步的，所述comt rs4680、ddr3 rs6280探针核苷酸序列3，端经过双脱氧修饰。
30.进一步的，所述homer1 rs4704559、slc22a1 rs622342探针寡核苷酸序列的5
′
端标记荧光报告基团为fam或texasred，3
′
端标记荧光淬灭基团为bhq1、bhq2或mgb，中间修饰基团为lna。
31.本发明的第二个目的在于提供一种指导帕金森病用药的基因多态性快速检测试剂盒，其特征在于，包括上述所述的引物组。
32.进一步的，所述试剂盒还包括：内参基因、pcr反应液、阳性质控品。
33.进一步的，所述内参基因的引物、探针的核苷酸序列为：
34.内参基因β-actin的上游引物如序列seq iq no.18所示，
35.内参基因β-actin的下游引物如序列seq iq no.19所示，
36.内参基因β-actin的探针如序列seq iq no.20所示。
37.进一步的，所述内参基因β-actin探针核苷酸序列3，端经过双脱氧修饰。
38.进一步的，所述阳性质控品包括阳性质控品1和阳性质控品2，所述阳性质控品1为含有comt rs4680、homer1 rs4704559野生型质粒、突变型质粒和β-actin质粒的重组质粒，所述阳性质控品2为含有ddr3 rs6280、slc22a1 rs622342野生型质粒、突变型质粒和β-actin质粒的重组质粒。
39.进一步的，所述pcr反应液包括缓冲液、mgcl2、dntps、taq酶、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚、媒介序列(sstarget-probe)、引物组和超纯水。
40.进一步的，所述dntps包括相同体积浓度的datp、dgtp、dttp、dctp。
41.进一步的，所述pcr反应液包括pcr反应液1和pcr反应液2，所述pcr反应液1中引物组为comt rs4680、homer1 rs4704559与内参基因引物组，所述pcr反应液2中引物组为ddr3 rs6280、slc22a1 rs622342与内参基因引物组。
42.进一步的，pcr反应液1的配方为：
[0043][0044][0045]
进一步的，pcr反应液2的配方为：
[0046][0047]
进一步的，所述帕金森病用药为左旋多巴、恩他卡朋、金刚烷胺、抗胆碱能药、多巴胺激动剂或司来吉兰。
[0048]
本发明的第三个目的在于提供一种指导帕金森病用药的基因多态性快速检测试剂盒的应用，用于检测待测基因的待测位点是否存在突变。本用途是药物的安全性检测，所述的检测是非疾病诊断性的检测。
[0049]
进一步的，所述试剂盒通过实时荧光pcr法与媒介序列荧光pcr熔解曲线法同时对目标基因进行检测。
[0050]
本发明涉及的常用药物、药物代谢基因及snp位点分别为：
[0051]
[0052][0053]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0054]
(1)本发明可快速对帕金森病治疗药物的drd3、comt、homer1和slc22a1四种基因多态性进行检测，为医生提供用药依据，从而避免患者用药错误，提高用药的性价比。
[0055]
(2)本发明单管可同时检测三个基因，实现了高通量检测，降低了检测成本；分型的熔解峰tm相差5℃及以上，降低了对温度精密度要求，从而降低了高通量所需的设备要求。本试剂盒反应液为预混液形式，采集口腔黏膜脱落细胞样本后可直接一步法加样检测，整个反应过程密闭，减少污染，操作便捷，准确率达到99％以上。检测周期短，整个试验完成时间在2小时内。
附图说明
[0056]
图1为本发明一种指导帕金森病用药的基因多态性快速检测引物组及试剂盒中反应液2ddr3 rs6280杂合型检测熔解曲线图及slc22a1 rs622342杂合型检测扩增曲线图。(其中a为ddr3 rs6280杂合型检测熔解曲线图，b为slc22a1 rs622342杂合型检测扩增曲线图)
[0057]
图2为本发明一种指导帕金森病用药的基因多态性快速检测引物组及试剂盒中反应液1comt rs4680野生型检测熔解曲线图。
[0058]
图3为本发明一种指导帕金森病用药的基因多态性快速检测引物组及试剂盒中反应液1homer1 rs4704559野生型检测扩增曲线图。
具体实施方式
[0059]
以下结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
[0060]
另外，除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买获得或现有方法制备得到。
[0061]
发明人通过对帕金森病用药相意义较大的drd3、comt、homer1和slc22a1四个基因位点进行联合检测，有效指导帕金森病的用药。
[0062]
实施例1：引物和探针组合设计
[0063]
从ncbi在线数据库调出drd3、comt、homer1和slc22a1的rs码进行序列信息查询，选取snp位点附近左右200bp序列通过软件进行常规引物和探针设计，确保引物及探针的特异性。引物序列及探针序列如表1所示。
[0064]
媒介序列，指公用taqman分子信标结构探针(sstarget-probe)，是人工设计的供媒介引物停靠的靶序列，序列两端分别连接有荧光基团和淬灭基团。
[0065]
表1各基因位点引物对序列及退火温度
[0066][0067][0068]
实施例2：基因检测试剂盒的组成
[0069]
本发明基因检测试剂盒包括实施例1的引物组，还包括pcr反应液、阳性质控品。
[0070]
阳性质控品包括阳性质控品1和阳性质控品2，根据查询到的snp序列信息，选取snp位点附近左右200bp序列进行合成，连接到puc57载体上后转化入top10细菌体中进行克隆，最终提取纯化后得到质粒。将分别得到的comt rs4680、homer1 rs4704559野生型质粒、突变型质粒和β-actin质粒稀释至6.0
×
106copies/ml，然后进行等体积混合，最终按照30μl规格进行分装，得到阳性质控品1；将分别得到的ddr3 rs6280、slc22a1 rs622342野生型质粒、突变型质粒和β-actin质粒稀释至6.0
×
106copies/ml，然后进行等体积混合，最终按
照30μl规格进行分装，得到阳性质控品2。
[0071]
pcr反应液包括pcr反应液1和pcr反应液2，pcr反应液1与pcr反应液2的体系组成见表2、表3。其中，dntps包括相同体积浓度的datp、dgtp、dttp、dctp。
[0072]
表2pcr反应液1配方
[0073]
成分体系终浓度4
×
omni iii buffer1.0～1.2
×
dntps(10mm)0.1～0.3mmmgcl2(100mm)4.0～6.0mm十二烷基硫酸钠0.00064％w/v聚乙二醇辛基苯基醚0.00013％w/vcomt rs4680上游引物0.4～0.7μmcomt rs4680下游引物0.4～0.7μmcomt rs4680野生型探针0.3～0.4μmcomt rs4680突变型探针0.15～0.25μmhomer1 rs4704559上游引物0.4～0.7μmhomer1 rs4704559下游引物0.4～0.7μmhomer1 rs4704559野生型探针0.1～0.3μmhomer1 rs4704559突变型探针0.1～0.3μmsstarget-probe0.1～0.2μmβ-actin上游引物0.3～0.5μmβ-actin下游引物0.3～0.5μmβ-actin探针0.05～0.1μmrobustart taq0.05～0.1u/μl超纯水补充至23μl
[0074]
表3pcr反应液2配方
[0075]
成分体系终浓度4
×
omni iii buffer1.0～1.2
×
dntps(10mm)0.1～0.3mmmgcl2(100mm)4.0～6.0mm十二烷基硫酸钠0.00064％w/v聚乙二醇辛基苯基醚0.00013％w/vddr3 rs6280上游引物0.4～0.7μmddr3 rs6280下游引物0.4～0.7μmddr3 rs6280野生型探针0.3～0.4μmddr3 rs6280突变型探针0.15～0.25μmslc22a1 rs622342上游引物0.4～0.7μmslc22a1 rs622342下游引物0.4～0.7μmslc22a1 rs622342野生型探针0.1～0.3μmslc22a1 rs622342突变型探针0.1～0.3μm
sstarget-probe0.1～0.2μmβ-actin上游引物0.3～0.5μmβ-actin下游引物0.3～0.5μmβ-actin探针0.05～0.1μmrobustart taq0.05～0.1u/μl超纯水补充至23μl
[0076]
实施例3：基因检测试剂盒的使用
[0077]
1、样本收集
[0078]
本实施例采集患者口腔黏膜脱落细胞，取样前患者用清水漱口2次，每次不少于5秒，漱口后吞咽2-3次，尽量避免口腔内壁残留唾液。取样者须穿戴手套、口罩。待上述准备完成后，方可进行取样。从拭子包装袋中取出拭子与反应液，取下拭子端盖，该过程中注意勿接触试剂塞，使拭子端部近90
°
接触口腔内腮壁，均匀刮拭5次(上下为1次)，力度以腮部微突为宜；取样后，立即将拭子插入反应液中并盖上试剂塞，上机检测。本发明中采用重庆京因生物核酸扩增分析仪进行检测。
[0079]
2、阳性质控品、反应体系配制
[0080]
阳性质控品按照实施例2中方法进行配制，反应体系的配制按照表4、5进行。
[0081]
表4pcr反应液1配方
[0082][0083][0084]
表5pcr反应液2配方
[0085]
成分体系终浓度4×
omni iii buffer1
×
dntps(10mm)0.2mmmgcl2(100mm)4.0mm十二烷基硫酸钠0.00064％w/v聚乙二醇辛基苯基醚0.00013％w/vddr3 rs6280上游引物0.6μmddr3 rs6280下游引物0.6μmddr3 rs6280野生型探针0.3μmddr3 rs6280突变型探针0.15μmslc22a1 rs622342上游引物0.6μmslc22a1 rs622342下游引物0.6μmslc22a1 rs622342野生型探针0.3μmslc22a1 rs622342突变型探针0.3μmsstarget-probe0.25μmβ-actin上游引物0.4μmβ-actin下游引物0.4μmβ-actin探针0.1μmrobustart taq0.065u超纯水补充至23μl
[0086]
3、加样及扩增
[0087]
指导帕金森病用药的基因多态性快速检测试剂盒，包括实施例1的引物组、实施例3的pcr反应液、阳性质控品。
[0088]
配制完成后，向实施例3配制的反应液1、反应液2中分别加入实施例2的阳性质控品1、阳性质控品2，得到阳性对照1、阳性对照2。
[0089]
分别向反应液1与反应液2中加入提纯的dna样本或采样的口腔黏膜脱落细胞。将加好样本的反应液1、反应液2、阳性对照1和阳性对照2放在重庆京因生物配套的核酸扩增分析仪上上机检测，检测pcr反应程序见表6。
[0090]
表6pcr反应程序
[0091][0092]
4、结果判读
[0093]
pcr反应完成后，通过分析系统的扩增曲线和熔解曲线对检测结果进行分别分析，参见附图1-3。先判读texasred通道的内参基因信号，即在77℃
±
1℃处是否有明显的熔解峰信号。若有，再按照下表7进行其它等位基因结果判读；若没有，则检测失败，需分析完原因后再进行检测。反应液1与反应液2在各基因位点的检测结果如表7所示，样品检测时至少出现一个熔解峰，若未出现熔解峰，即为检测失败，需重新检测。
[0094]
表7试剂盒测试结果统计表
[0095][0096]
[0097]
实施例4：准确性测试
[0098]
采用实施例3中的检测试剂盒和检测方法，检测准确性样品来验证本发明试剂盒的检测准确性，最终每个位点的三种型别(野生型、杂合突变型、纯合突变型)均被检测至少一次，选取8个准确性检测样本，分别记为p1-p8，如表8所示。
[0099]
表8准确性样本信息表
[0100][0101]
对表8中的各准确性样本进行检测，并以实施例3制备的阳性质控品，与表8得到的样本信息作对比，可以看出检测结果与预先确认的结果完全一致，证明本检测体系的检测准确性好，检测结果如下表9所示：
[0102]
表9试剂盒准确性检测结果统计表
[0103]
[0104][0105]
实施例5：灵敏度测试
[0106]
选取实施例3中检测试剂盒和检测方法，检测试剂盒灵敏度可验证试剂对扩增模板量的最低要求，在模板量少的情况下，可以保证分型准确率，其中每个位点主要选取杂合突变型进行测试验证。选取样本为实施例4中的p2、p4和p7样本，通过稀释至400cells/μl、300cells/μl、200cells/μl、100cells/μl和50cells/μl五个不同浓度梯度进行检测，每个样本重复20次，灵敏度样本见表10。
[0107]
表10灵敏度样本
[0108][0109]
[0110]
对表10中灵敏度不同浓度样本进行测试，测试结果如下表11、12、13所示。
[0111]
表11p2样本不同浓度检测结果统计表
[0112][0113]
表12p4样本不同浓度检测结果统计表
[0114][0115]
表13p7样本不同浓度浓度检测结果统计表
[0116][0117]
从样品检测以上五个样本浓度结果可以看出，在浓度为400cells/μl、300cells/μl、200cells/μl三个细胞浓度检测下，其中分型正确率均达到100％，在细胞数为100cells/μl时，存在个别样本正确率降低为95％，细胞浓度为50cells/μl时，正确率下降5％～10％，已经低于最低检测限要求；表明在细胞浓度过少，分型正确率会有所降低，为保证试剂的分型正确率，需保证最低浓度为100cells/μl。
[0118]
实施例6：抗干扰测试
[0119]
试剂盒采用口腔黏膜脱落细胞进行取样测试，其中以膳食后30min取样为标准。以进食30min后取样为对照组，在膳食、喝茶、抽烟后立即取样作为处理组，进行前后对照(每组干扰项目前后对照为同一批人)，采用实施例3中的检测试剂盒和检测方法，进行试剂盒干扰测试；每个基因位点每个干扰项目检测人数均为120人，最终每个位点三个基因型别(野生型、杂合突变型、纯合突变型)至少检测一次。测试结果如表14-17所示：
[0120]
表14comt基因型抗干扰样本检测信息表
[0121][0122]
表15homer1基因型抗干扰样本检测信息表
[0123][0124]
表16ddr3基因型抗干扰样本检测信息表
[0125][0126]
表17slc22a1基因型抗干扰样本检测信息表
[0127][0128]
从以上测试结果可以看出，喝茶取样测试结果正确率可以达到100％，膳食取样测试中，只有comt基因型检测出现检测失败样本，正确率为99.16％；在抽烟取样检测中，四个基因位点的分型均有检测失败，但正确率均在99.16％。以上测试结果表明，膳食和抽烟后对分型正确率有所影响，为保证试剂盒的分型正确率，需在进行膳食和抽烟等活动30min后进行取样检测。
[0129]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术构思前提下所作任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
rs4680、homer1 rs4704559野生型质粒、突变型质粒和β-actin质粒的重组质粒，所述阳性质控品2为含有ddr3 rs6280、slc22a1 rs622342野生型质粒、突变型质粒和β-actin质粒的重组质粒。9.如权利要求6所述一种指导帕金森病用药的基因多态性快速检测试剂盒，其特征在于：所述pcr反应液包括缓冲液、mgcl2、dntps、taq酶、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚、媒介序列(sstarget-probe)、引物组和超纯水。10.一种根据权利要求5-9中任一项所述指导帕金森病用药的基因多态性快速检测试剂盒的应用，其特征在于：用于检测待测基因的待测位点是否存在突变。

技术总结
本发明提供一种指导帕金森病用药的基因多态性快速检测引物组及试剂盒，包括用于对帕金森病治疗药物的DRD3、COMT、HOMER1和SLC22A1四种基因多态性检测引物和探针组合。本发明可快速对帕金森病治疗药物的DRD3、COMT、HOMER1和SLC22A1四种基因多态性进行检测，单管可同时检测三个基因，实现了高通量检测，降低了检测成本；分型的熔解峰Tm相差5℃及以上，降低了对温度精密度要求，从而降低了高通量所需的设备要求。备要求。备要求。


技术研发人员：熊伟 张东涛 罗德朋 邬蒙 苏文霞 袁雪莲
受保护的技术使用者：重庆京因生物科技有限责任公司
技术研发日：2023.07.06
技术公布日：2023/10/6