牦牛输卵管源外泌体的制备方法及其在胚胎培养中的应用

1.本发明涉及外泌体技术领域，尤其涉及一种牦牛输卵管源外泌体的制备方法及其在胚胎培养中的应用。


背景技术：

2.牦牛(b.grunniens)广泛分布在2500-6000m的高寒低氧地区，是高原地区特有的牛种。牦牛可以很好地适应如稀薄的空气，寒冷的天气，强紫外线及牧草短缺等高山草原环境，并在恶劣的生存环境条件下生存，繁育，正常生活。牦牛是高原藏区无可取代的生产和经济型哺乳动物，他们不仅为当地牧民提供可食用物品，燃料，还可以供使役，服务部队，能在青藏高原上最大限度地利用牧草资源，作为典型的高原哺乳动物研究模型，牦牛也是高原哺乳动物基因库的重要贡献者。
3.胚胎的体外培养是动物胚胎工程技术的基础环节之一，也是胚胎移植重要的前期基础。而牦牛是高原地区生产和经济的重要贡献者。在体外培养过程中，早期胚胎对环境的变化较为敏感，导致早期胚胎发育到囊胚的成功率不高，因此，如何提高囊胚率是核心问题。输卵管作为精子获能、卵子受精以及卵裂的重要场所,输卵管液是输卵管微环境中最重要的组成部分，其输卵管液外泌体在早期胚胎的发育中具有重要的调控作用。外泌体是多囊泡体中30-150nm的囊泡与细胞膜融合释放的囊泡，广泛存在于各种体液中,其内部包含蛋白质、脂质、mrna和mirna等细胞间进行物质和信息传递的多种生物活性成分，是细胞间通讯的重要介质，在生理和病理过程中发挥重要作用，参与调节机体多种生理过程。但是，在现有技术中，如何快速制备牦牛高活性输卵管液外泌体，并将其应用于体外胚胎培养过程中的相关报道甚少。
4.为此，我们提出一种牦牛输卵管源外泌体的制备方法及其在胚胎培养中的应用解决上述问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种牦牛输卵管源外泌体提取方法及其在胚胎培养中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明构建了一种牦牛输卵管液外泌体的提取方法，并且所提取外泌体可以应用于胚胎培养。
6.为解决上述技术问题，本发明提供的一种牦牛输卵管源外泌体的制备方法及其在胚胎培养中的应用本发明提供一种牦牛输卵管液外泌体的提取方法，所述提取方法包括：收集牦牛输卵管液，超速离心所得输卵管液，并重悬、过滤所得沉淀，获得输卵管液液外泌体。
7.优选的是，所述建立方法具体包括以下步骤：
8.s1、收集牦牛输卵管液；
9.s2、通过4℃，12000g条件下离心15min去除输卵管液中的细胞和细胞碎片；
10.s3、将去除细胞和细胞碎片的输卵管液进行超速离心(4℃条件下110000g的转速
离心90min)，分离出外泌体；
11.s4、使用pbs对离心管中的外泌体进行洗涤(4℃条件下110000g的转速离心90min)；
12.s5、得到的沉淀用dmem-f12培养液重悬，0.22μm的微孔滤膜过滤，置于-80℃冰箱保存。
13.优选的是，步骤(4)中，重悬沉淀所用的pbs包括如下组分：8g nacl+0.2g kcl+1.15g na2hpo3+0.2g kh2po3溶于1l去离子水中，ph值调至7.2-7.4之间。
14.优选的是，对获得的牦牛输卵管液外泌体进行表征。
15.优选的是，所述的输卵管液外泌体表征包括：透射电镜观察、nta粒径分析和蛋白免疫印迹实验。
16.本发明还公开了一种利用上述制备方法得到的牦牛输卵管液外泌体在胚胎培养上的应用。
17.优选的是，通过使用本发明的牦牛输卵管源外泌体作为合成培养基添加物，在受精卵体外发育的环境下，在提高体外胚胎生产的质量具有积极应用。
18.在提取方法过程中，所述处理包括收集牦牛输卵管液；除去输卵管液中的细胞和细胞碎片；超速离心分离得到所述牦牛输卵管源外泌体的步骤；
19.在提取方法过程中，所述处理均需要离心的步骤中，所有离心均应在4℃下进行；
20.在提取方法过程中，所述处理离心管用50ml聚丙烯离心管；
21.在提取方法过程中，所述处理离心之后的上清和沉淀部分，用微量移液器；
22.本发明还提供了一种合成培养基，该合成培养基中包括了在第一方面所述的牦牛输卵管源外泌体，在胚胎培养过程中应用，在胚胎培养过程中，所述牦牛受精卵培养在合成培养基中，合成培养基的成分为：tcm-199+10％(质量分数)fbs+100μg/ml fsh+50μg/ml lh+100μg/ml e2+100μg/ml青霉素+100μg/ml链霉素，在37℃5％(体积分数)co2和饱和湿度，5％胎牛血清，牦牛输卵管源外泌体。
23.本发明相比于现有技术，取得了以下技术效果：
24.1、本发明首次成功提取牦牛卵泡液外泌体，提供了一种简单且对技术要求不高的输卵管液外泌体提取方法。
25.2、本发明提取的牦牛卵泡液外泌体形态似杯状，nta粒径分析表明牦牛卵泡液外泌体的大小主要分布在50～150nm之间，蛋白免疫印迹结果表明其能特异性表达外泌体标志性蛋白cd63和tsg101，证明已成功分离牦牛输卵管液外泌体，并经实验证实，分离的牦牛输卵管液外泌体能够提高卵母细胞成熟率，增强胚胎发育潜能，为进一步增强牦牛的辅助繁殖技术提供新思路。
附图说明
26.图1为牦牛输卵管液纳米颗粒跟踪分析(nta)结果图；
27.图2为蛋白质印迹实验曝光图片；
28.图3为透射电子显微镜(tem)分别在500nm和100nm的检测结果图；
29.图4为卵丘乱母细胞复合体对牦牛输卵管液摄取情况的结果图。
具体实施方式
30.下面详细描述本发明的实施方式。
31.在本发明的描述中，需要理解的是，如果有涉及到的术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
32.在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接。可以是机械连接，也可以是电连接。可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
33.参考图1-4，一种牦牛输卵管源外泌体的制备方法，包括以下步骤：
34.s1、收集牦牛输卵管液，去除细胞及碎片；
35.s2、从当地屠宰场的母牛中采集发情周期黄体中期黄体同侧的输卵管，密封在塑料袋中，并在冰上运输至实验室，将输卵管组织用预热的生理盐水冲洗3遍，修剪每个输卵管，去除杂质和血水。将处理后的输卵管用剪刀去除输卵管表面的结缔组织和脂肪等，通过挤压收集输卵管黏膜，用pbs再次冲洗，收集到所述牦牛输卵管液到离心管。将离心管在4℃条件下15000g离心15分钟，取上清液，移至新的超速离心管中。
36.s3、将上述超速离心管在超速离心机上，4℃条件下，在离心力110000g，离心90分钟，收集沉淀，弃上清。此时的沉淀中包含输卵管源外泌体和有污染的蛋白质。
37.s4、将上述超速离心完的沉淀，加pbs重悬于1ml的量，然后再添加pbs量达到四分之三，在超速离心机上，4℃条件下，离心力110000g，离心90分钟，弃上清，将沉淀重新加pbs重悬，制成浓缩液进行分装在-80℃保存备用。
38.此外，还包括对牦牛输卵管源外泌体的鉴定，包括：
39.将上述提取到的牦牛输卵管源外泌体浓缩液，用1xpbs进行稀释，混合均匀，在0.22微米滤膜上过滤。取过滤后的牦牛输卵管源外泌体滴加在铜网上，在室温下孵育5分钟，用吸水纸吸干多余的液体，在铜网上滴加2％的乙酸铀酰染色1分钟，在室温下干燥20分钟，在80kv的透射电子显微镜下观察，参考图4。
40.透射电子显微镜(tem)：
41.将上述提取到的牦牛输卵管源外泌体浓缩液，用1xpbs进行稀释，混合均匀，在0.22微米滤膜上过滤。取过滤后的牦牛输卵管源外泌体滴加在铜网上，在室温下孵育5分钟，用吸水纸吸干多余的液体，在铜网上滴加2％的乙酸铀酰染色1分钟，在室温下干燥20分钟，在80kv的透射电子显微镜下观察，可参考图3。
42.nta粒径分析：
43.将上述提取到的牦牛输卵管源外泌体浓缩液，用300μl的1xpbs进行重悬得到外泌
体重悬液。打开nta 2.1analytical software电脑软件，确认连接正常，用纯水冲洗样品池。向外泌体重悬液加入10ml的1xpbs溶液，得到二次稀释液。把二次稀释液通过针筒打入样品池上机观察。
44.蛋白免疫印迹检测输卵管液外泌体内富集蛋白：
45.先配置ripa蛋白酶抑制剂混合液。收集到的输卵管液外泌体样品用ripa裂解缓冲液在冰上裂解30min，并将裂解物收集在管中。然后，在10％ sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离等量的蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上。用脱脂牛奶封闭膜3小时，与一抗在4℃下孵育过夜第二天，加入二抗在室温下孵育45分钟。用成像系统显影，可参考图2。
46.一种利用上述制备方法得到的牦牛输卵管液外泌体在胚胎培养上的应用，需要将上述提取到的牦牛输卵管源外泌体pkh26标记后应用在牦牛胚胎体外培养中，对照组不添加外泌体，实验组胚胎培养液中添加牦牛输卵管液外泌体，得到含有牦牛输卵管源外泌体的合成胚胎培养液。24h后在光学显微镜下观察牦牛卵丘卵母细胞复合体对卵泡液外泌体的摄入情况(图4)，并对成熟卵母细胞进行统计，统计结果见下表。
47.牦牛输卵管液外泌体对体外受精胚胎发育的影响
[0048][0049]
数据以四个独立实验的平均值
±
标准误表示，同一列中的不同字母(a、b)上标表示差异显著(p《0.05)。
[0050]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种牦牛输卵管源外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、收集牦牛输卵管液；s2、通过离心去除输卵管液中的细胞和细胞碎片；s3、将去除细胞和细胞碎片的输卵管液进行超速离心，分离出外泌体；s4、使用pbs对离心管中的外泌体进行洗涤；s5、对洗涤后的外泌体再次超速离心后用dmem-f12培养液重悬后，通过微孔滤膜过滤并置于-80℃冰箱保存。2.根据权利要求1所述的一种牦牛输卵管源外泌体的制备方法，其特征在于，所述牦牛输卵管液的收集方法为：从屠宰场的小母牛中采集发情周期黄体中期黄体同侧的输卵管并密封在塑料袋中，在冰上运输至实验室，修剪每个输卵管，去除组织，通过挤压收集输卵管黏膜收集到所述的牦牛输卵管液。3.根据权利要求1所述的一种牦牛输卵管源外泌体的制备方法及其在胚胎培养中的应用，其特征在于，所述s2中的离心在4℃条件下并以12000g的离心力离心15min，所述s3、s5中的离心在4℃条件下并以100000g的离心力离心90min。4.根据权利要求1所述的一种牦牛输卵管源外泌体的制备方法及其在胚胎培养中的应用，其特征在于，所述s4中的pbs包括如下组分：8g nacl+0.2g kcl+1.15gna2hpo3+0.2g kh2po3溶于1l去离子水中，将ph值调至7.2-7.4之间后用0.22μm的微孔滤膜滤器过滤后即可使用。5.根据权利要求1所述的一种牦牛输卵管源外泌体的制备方法及其在胚胎培养中的应用，其特征在于，还包括：利用分装试管将获得的牦牛卵泡液外泌体无菌分装成nml/支，n≥1，并对获得的牦牛输卵管液外泌体进行表征。6.根据权利要求5所述的一种牦牛输卵管源外泌体的制备方法及其在胚胎培养中的应用，其特征在于，所述的输卵管液外泌体表征包括：透射电镜观察、纳米颗粒跟踪分析(nta)技术和蛋白免疫印迹实验。7.一种根据权利要求1-6任一项所述的制备方法得到的牦牛输卵管源外泌体在胚胎培养中的应用。8.根据权利要求7所述的一种牦牛输卵管源外泌体在胚胎培养中的应用，其特征在于，先将所述牦牛输卵管源外泌体添加到体外培养胚胎的基础培养液当中，得到含有牦牛输卵管源外泌体的合成培养基，然后将体外培养的胚胎移入到合成培养基中进行培养。9.根据权利要求8所述的一种牦牛输卵管源外泌体在胚胎培养中的应用，其特征在于，所述胚胎为体外培养的精卵结合受精卵胚胎。10.根据权利要求8所述的一种牦牛输卵管源外泌体在胚胎培养中的应用，其特征在于，所述合成培养基的成分为：tcm-199+10％(质量分数)fbs+100μg/ml fsh+50μg/ml lh+100μg/ml e2+100μg/ml青霉素+100μg/ml链霉素，5％胎牛血清，牦牛输卵管源外泌体，其温度在37℃以及5％(体积分数)co2和饱和湿度。

技术总结
本发明属于外泌体技术领域，公开了一种牦牛输卵管源外泌体的制备方法及其在胚胎培养中的应用，所述的制备方法包括：S1、收集牦牛输卵管液；S2、通过离心去除输卵管液中的细胞和细胞碎片；S3、将去除细胞和细胞碎片的输卵管液进行超速离心，分离出外泌体；S4、使用PBS对离心管中的外泌体进行洗涤；S5、对洗涤后的外泌体再次超速离心后用DMEM-F12培养液重悬后，用0.22μm的微孔滤膜过滤，置于-80℃冰箱保存。该牦牛输卵管源外泌体通过对牦牛输卵管液样品进行处理获得，其作为牦牛胚胎体外培养中的培养液，可以实现有效的改善体外囊胚质量，对提高牦牛体外胚胎的生长发育具有重要意义。对提高牦牛体外胚胎的生长发育具有重要意义。对提高牦牛体外胚胎的生长发育具有重要意义。


技术研发人员：潘阳阳 汪燕霞 王靖雷 余四九 徐庚全 许瑞华 王萌 王立斌
受保护的技术使用者：甘肃农业大学
技术研发日：2023.07.06
技术公布日：2023/10/6