表现出免疫增强活性的新的片段化CRS肽及其用途的制作方法

表现出免疫增强活性的新的片段化crs肽及其用途
技术领域
1.本技术要求于2020年12月10日提交的韩国专利申请第10-2020-0172565号的优先权，其全部说明书通过引用以其整体合并于此。
2.本发明涉及表现出免疫增强活性的新的片段化crs肽及其用途，更具体地，本发明涉及由seq id no:2的氨基酸序列组成的新的肽、其疫苗佐剂、及其作为癌症治疗的用途。


背景技术：

3.催化trna分子的氨基酰化的氨基酰基-trna合成酶(ars或aars)对翻译过程期间解码遗传信息至关重要。每种真核trna合成酶都由核心酶(与trna合成酶的原核对应物密切相关)和额外的结构域(其添加到核心酶的氨基末端或羧基末端)组成。因此，在真核生物与原核生物之间，这些酶的组成中存在显著差异。例如，人酪氨酰-trna合成酶(tyrrs)具有原核和低级真核tyrrs分子中不存在的羧基末端结构域。
4.几种氨基酰基-trna合成酶最近被证明具有独立于它们参与翻译过程的非经典功能。也就是说，在ars蛋白的一些片段中，已经鉴定出它们表现出调节蛋白质翻译之外的其他类型的途径的细胞外信号传导活性，并且具有与氨基酰基化无关的出乎意料的活性。这种出乎意料的活性有时可能是针对特定疾病等的治疗上可用的活性，但在一些情况下，它可能是具有高的功能风险以导致人类的疾病状态的活性。例如，已经发现赖氨酰-trna合成酶(krs)具有促进癌症转移的活性(韩国注册专利第10-1453141号)。此外，迷你酪氨酰-trna合成酶(迷你-trs，对应于氨基酸残基1-364)，即trs的n端结构域(其被多形核细胞弹性蛋白酶和纤溶酶切割)，在体外表现出在全长蛋白质中未发现的非经典生物活性，迷你-trs显示出刺激内皮细胞增殖和迁移并在小鼠体外血管形成实验(matrigel assay)中具有促血管生成活性。促进血管生成的功能通常与癌症转移密切相关。
5.因此，在天然全长蛋白质序列中没有观察到这种出乎意料的活性(或在天然全长蛋白质水平上显示出不显著的作用)，存在当一些区域被隔离时显著表现出特定的活性的情况下，也存在这种效应具有不适合治疗用途的特性的情况。为了克服由于这种不可预测性造成的困难并利用这些ars家族蛋白的治疗潜力，需要做出各种努力来鉴定其他氨基酰基-trna合成酶蛋白的生物学相关形式。
6.另一方面，制药行业正在从过去的天然产品或化学合成药物转向蛋白或肽药物的开发，在全球制药市场中，蛋白或肽药物的市场从2006年的437亿美元扩大到2011年的885亿美元，国内蛋白药物市场在全球市场的份额预计将从2006年的3％增加到2021年的7％。蛋白或肽药物被评估为创新的医学领域，因为它们比合成药物副作用更少，药效更快。
7.目前，生物制药在主要制药公司的渠道中的重要性正在逐渐增加，但在诸如肽的特定生物制药发布之前，仍存在重大技术问题。例如，肽药物向靶位点的低递送率和长链肽的合成是商业化的障碍。众所周知，作为肽药物成功的关键是发现显示活性的短序列，即从全长蛋白质中选择具有优异生理活性的最小基序。如果肽长度长，则已知合成成本高，制备不容易，并且人体吸收存在问题。
8.在这方面，韩国专利申请第10-2019-0026490号公开了crs蛋白的片段(106-228aa)及其用途，文献中公开的crs片段肽不仅形成多聚体，而且在作为药物开发方面具有局限性，因为如果去除附着在n末端和c末端的亲和标签，则肽会降解。
9.发明详述
10.技术问题
11.本发明人已在先前的研究中发现半胱氨酰-trna合成酶(cysteinyl-trnasynthetase，以下称为“crs”)的片段肽具有抗癌活性和免疫增强活性，但确认了由于上述限制而难以将其开发为药物。因此，作为开发能够克服上述限制的新的片段化crs肽的深入研究的结果，本发明人发现并完成了本发明，由seq id no:2的氨基酸序列组成的新的片段化crs肽保持其作为单体的形式并且在没有亲和标签的情况下不降解，同时与上述常规crs片段肽相比表现出同等程度的抗癌活性和免疫功能增强活性。
12.因此，本发明的目的是提供一种由seq id no:2的氨基酸序列或与其示出95％或更多序列同源性的氨基酸序列组成的肽。
13.本发明的另一个目的是提供一种包含编码该肽的核苷酸序列的多核苷酸。
14.本发明的另一个目的是提供一种包含多核苷酸的载体。
15.本发明的另一个目的是提供一种用载体转化的宿主细胞。
16.本发明的另一个目的是提供一种供疫苗佐剂，其包含选自以下(i)至(iv)中的至少一种：
17.(i)肽，
18.(ii)编码(i)的肽的多核苷酸；
19.(iii)包含(ii)的多核苷酸的载体，和
20.(iv)由(iii)的载体转化的宿主细胞。
21.本发明的另一个目的是提供一种疫苗组合物，其包含该疫苗佐剂和抗原。
22.本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含选自以下(i)至(iv)中的至少一种。
23.此外，本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含选自以下(i)至(iv)中的至少一种。
24.此外，本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物基本上由选自以下(i)至(iv)中的至少一种组成：
25.(i)肽，
26.(ii)编码(i)的肽的多核苷酸；
27.(iii)包含(ii)的多核苷酸的载体，和
28.(iv)由(iii)的载体转化的宿主细胞。
29.本发明的另一个目的是提供选自以下(i)至(iv)中的至少一种用于制备用于治疗癌症的试剂的用途：
30.(i)肽，
31.(ii)编码(i)的肽的多核苷酸；
32.(iii)包含(ii)的多核苷酸的载体，和
33.(iv)由(iii)的载体转化的宿主细胞。
34.本发明的另一个目的是提供一种用于治疗癌症的方法，包括向有需要的对象施用有效量的组合物，所述组合物包含选自以下(i)至(iv)中的至少一种：
35.(i)肽，
36.(ii)编码(i)的肽的多核苷酸；
37.(iii)包含(ii)的多核苷酸的载体，和
38.(iv)由(iii)的载体转化的宿主细胞。
39.技术方案
40.为了实现本发明的上述目的，本发明提供了一种由seq id no:2的氨基酸序列或示出与其有95％或更多序列同源性的氨基酸序列组成的肽。
41.为了实现本发明的上述目的，本发明提供了一种包含编码该肽的核苷酸序列的多核苷酸。
42.为了实现本发明的上述目的，本发明提供了一种包含该多核苷酸的载体。
43.为了实现本发明的上述目的，本发明提供了一种用载体转化的宿主细胞。
44.为了实现本发明的上述目的，本发明提供了一种供疫苗佐剂，其包含选自以下(i)至(iv)中的至少一种：
45.(i)肽，
46.(ii)编码(i)的肽的多核苷酸；
47.(iii)包含(ii)的多核苷酸的载体，和
48.(iv)由(iii)的载体转化的宿主细胞。
49.为了实现本发明的上述目的，本发明提供了一种疫苗组合物，其包含该疫苗佐剂和抗原。
50.为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含选自以下(i)至(iv)中的至少一种。
51.此外，本发明提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物由选自以下(i)至(iv)中的至少一种组成。
52.此外，本发明的提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物基本上由选自以下(i)至(iv)中的至少一种组成。
53.(i)肽，
54.(ii)编码(i)的肽的多核苷酸；
55.(iii)包含(ii)的多核苷酸的载体，和
56.(iv)由(iii)的载体转化的宿主细胞。
57.为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了选自以下(i)至(iv)中的至少一种用于制备用于治疗癌症的试剂的用途：
58.(i)肽，
59.(ii)编码(i)的肽的多核苷酸；
60.(iii)包含(ii)的多核苷酸的载体，和
61.(iv)由(iii)的载体转化的宿主细胞。
62.为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了一种用于治疗癌症的方法，包括向有需要的对象施用有效量的组合物，所述组合物包含选自以下(i)至(iv)中的至少一种：
63.(i)肽，
64.(ii)编码(i)的肽的多核苷酸；
65.(iii)包含(ii)的多核苷酸的载体，和
66.(iv)由(iii)的载体转化的宿主细胞。
67.在下文中，将详细描述本发明。
68.为了解释的目的，以下(文献)使用本发明所属技术领域内的分子生物学和重组dna技术的常规方法描述了本发明的大多数实施例，除非特别指出相反。在以下文献中详细描述了这些技术：sambrook,等人,molecular cloning:a laboratory manual(2nd edition,1989)；maniatis等人,molecular cloning:a laboratory manual(1982)；dna cloning:apractical approach,vol.i&ii(d.glover,ed.)；oligonucleotide synthesis(n.gait,ed.,1984)；nucleic acid hybridization(b.hames&s.higgins,eds.,1985)；transcription and translation(b.hames&s.higgins,eds.,1984)；animal cell culture(r.freshney,ed.,1986)；a practical guide to molecular cloning(b.perbal,ed.,1984)。
69.本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文。
70.在本文的整个公开内容中，可以以范围格式来建议与本发明有关的各种方面或条件。在本说明书中，范围值的描述意在包括相应的边界值，即，除非另有规定，否则包括从下限值到上限值的所有值。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应当被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，范围的陈述应被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对范围(如7至170)的描述可以包括该范围内的各个值，如10至127、23至35、80至100、50至169等，以及9、27、35、101和155应该被认为是具体公开的。无论范围的宽度如何，这都适用。
71.本文中使用的术语“包含”与“包括”或“特征在于”具有相同含义，并且不排除在根据本发明的组合物或方法中未具体提及的额外成分或方法步骤。除非另有描述，否则术语“由......组成”意指排除额外的元素、步骤或成分等。术语“基本上由......组成”意指除了在组合物或方法范围内的描述的物质或步骤之外，还包括不对其基本性质产生实质性影响的物质或步骤。
72.如本文所用，术语“肽”和“蛋白质”根据其通常(常规)含义使用，即，它们是指氨基酸序列。肽不限于特定长度，但在本发明的上下文中，肽通常是指全长蛋白质的片段，并且它可以包括翻译后修饰，如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域已知的其他修饰(天然发生修饰和非天然发生修饰)，并且可以被称为“多肽”。本发明的肽和蛋白质可以使用多种已知的重组和/或合成技术中的任何一种来制备，其说明性实例在下文中进一步描述。
73.本发明源于crs肽和crs衍生的肽具有治疗相关的非经典生物活性的发现。
74.在本说明书中，“非经典活性”通常是指本发明的crs肽所具有的除将半胱氨酸添加到trna分子之外的活性。如本文详述，在一个具体实施方式中，本发明的crs片段表现出的非经典生物活性可以选自但不限于抗癌活性、固有免疫活化和适应性免疫活化。
75.应当理解，本发明的范围不仅包括具有至少一种非经典生物活性的crs片段肽，还包括基本上保持非经典活性的变体。
76.具体地，本发明人已经发现，新的片段化crs肽活化固有免疫和适应性免疫以抑制
肿瘤生长，并且在结构上非常稳定。在本发明中首次公开了片段化crs肽的区域。
77.因此，本发明提供了一种由seq id no:2的氨基酸序列或示出与其有95％或更多序列同源性的氨基酸序列组成的肽。
78.在本发明中，seq id no:2的肽是crs蛋白的截短形式，其特征在于该肽由crs全长蛋白序列的第99至200个氨基酸组成，第182个半胱氨酸被丝氨酸替换，该crs全长蛋白序列由seq id no:1的氨基酸序列组成。
79.本发明的肽可以使用本领域已知的可用技术制备。例如，它可以使用多种蛋白水解酶中的任何一种来制备。示例性蛋白酶包括，例如，无色肽酶、氨基肽酶、安克洛酶(ancrod)、血管紧张素转换酶、菠萝蛋白酶、钙蛋白酶、钙钙蛋白酶i、钙蛋白酶ii、羧肽酶a、羧肽酶b、羧肽酶g、羧肽酶p、羧肽酶w、羧肽酶y、caspase 1、caspase 2、caspase 3、caspase 4、caspase 5、caspase 6、caspase 7、caspase 8、caspase 9、caspase 10、caspase 11、caspase 12、caspase 13、组织蛋白酶b、组织蛋白酶c、组织蛋白酶d、组织蛋白酶e、组织蛋白酶g、组织蛋白酶h、组织蛋白酶l、木瓜凝乳蛋白酶、糜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、梭菌蛋白酶、胶原酶、补体c1r、补体c1s、补体因子d、补体因子i、黄瓜素、二肽基肽酶iv，白细胞弹性蛋白酶，胰腺弹性蛋白酶、胞内蛋白酶arg-c、胞内蛋白酶asp-n、胞内蛋白酶glu-c、胞内蛋白酶lys-c、肠激酶因子xa、无花果蛋白酶(ficin)、弗林蛋白酶(furin)、粒酶a、粒酶b、hiv蛋白酶、igase、激肽释放酶组织、亮氨酸氨肽酶(一般)、亮氨酸氨肽蛋白酶(胞质溶胶)、亮氨酸氨基肽酶(微粒体)、基质金属蛋白酶、甲硫氨酸氨肽酶、中性蛋白酶(neutrase)、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、纤溶酶、氨酰基脯氨酸(二肽)酶、链霉蛋白酶e、前列腺特异性抗原、来自灰链霉菌(streptomyces griseus)的嗜碱蛋白酶、来自曲霉菌(aspergillus)的蛋白酶、来自aspergillus saitoi的蛋白酶、来自酱油曲霉(aspergillus sojae)的蛋白酶、地衣芽孢杆菌蛋白酶(碱性或碱性蛋白酶)、来自多粘芽孢杆菌(bacillus polymyxa)的蛋白酶、来自芽孢杆菌属(bacillus sp.)的蛋白酶、来自根霉属(rhizopus sp.)的蛋白酶、蛋白酶s、蛋白酶体、来自米曲霉(aspergillus oryzae)的蛋白酶、蛋白酶3、蛋白酶a、蛋白酶k、蛋白c、焦谷氨酸氨肽酶、凝乳酶(rennin)、链激酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、凝血酶、组织纤溶酶原活化剂、胰蛋白酶、类胰蛋白酶和尿激酶等。考虑到要产生的片段的化学特异性，本领域技术人员可以容易地确定哪种蛋白水解酶是合适的。
80.本文所述的多肽可以通过本领域技术人员已知的任何合适的程序生产，如重组技术。除了重组生产方法外，本发明的多肽可以通过使用固相技术的直接肽合成来制备。
81.固相肽合成(spps)方法可以通过将称为连接体的功能单元附接到小多孔珠上并诱导它们连接肽链来使合成启动。与液相法不同，使肽与珠共价结合并防止它们通过过滤过程分离，直到它们被特定反应物如三氟乙酸(tfa)裂解。通过重复保护过程、脱保护过程和偶联过程的循环(脱保护洗涤-偶联-洗涤)来进行合成，其中再次暴露的胺基与新的氨基酸结合，其中附接到固相的肽的n-末端胺和n-保护的氨基酸单元结合。spps方法可以一起使用微波技术进行，并且微波技术可以通过在肽合成过程中施加热来缩短每个循环的偶联和脱保护所需的时间。热能可以防止膨胀肽链的聚集形成折叠聚集体并促进化学键合。
82.此外，本发明的肽可以通过液相肽合成方法制备，其具体方法参见以下文献：美国专利第5,516,891号。.此外，本发明的肽可以通过各种方法合成，如将固相合成方法和液相合成方法相结合的方法，并且制备方法不限于本文所述的手段。
83.蛋白质合成可以使用手动技术或通过自动化进行。自动化合成可以使用例如applied biosystems 431a peptide synthesizer(perkin elmer)来完成。或者，可以单独地化学合成各种片段，并使用化学方法组合以产生目标分子。
84.本发明中提供的肽包括与seq id no:2的肽具有95％或更多序列同源性的变体。变体是指肽的活性变体，其意指活性变体从其来源的肽中保留至少一种期望的非经典活性(例如，抗癌活性和免疫增强活性)。作为变体的实例，无论它是天然地还是非天然地发生(产生)，它都可以是剪接变体，并且剪接变体保留例如本文所述的至少一种非经典活性。作为另一个实例，变体，无论是天然地还是非天然发生(产生)，都包含肽序列的一个或多个点突变，变体肽保留例如本文所述的至少一种非经典活性。也就是说，在本发明中，变体(或术语“活性变体”)被理解为seq id no:2的肽的功能等价物。
85.更具体地，变体的特征在于它是与上述肽序列沿其长度方向具有至少95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或99％或更多序列同源性的功能等价物。
86.在本发明的一个方面中，肽的特征可以在于它由seq id no:2或seq id no:3的氨基酸序列组成。
87.变体是“肽”的氨基酸序列中发生任意变化的变体，并且可以包括一个或多个替换、缺失、添加和/或插入。此类变体可以是天然存在的，或者它可以使用本领域熟知的多种技术中的任何一种合成产生，例如通过修改或修饰本发明的一个或多个肽序列并评估其如本文所述的生物活性。
88.在本发明的一个实施方式中，变体包括保守替换。“保守替换”是这样的替换，其中一个氨基酸被具有相似特性的另一个氨基酸替换，并且本领域技术人员可以预测肽的二级结构和敏感性(水感性质、疏水性或亲水性)基本上不变。一般来说，以下氨基酸组表现出保守的变化：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；以及(5)phe、tyr、trp、his。
89.可以在本发明的肽的结构内进行修饰，产生编码具有期望的(合意的)特性的肽变体或衍生物的功能分子。在改变肽的氨基酸序列以制备本发明的肽的等价或改善的变体的情况下，本领域技术人员可以基于本领域已知的蛋白质密码子信息来改变一个或多个密码子。
90.某些氨基酸可以替换蛋白质或肽结构内的其他氨基酸，而不显著丧失该结构例如作为受体、抗体的抗原结合位点或底物分子上的结合位点的相互结合能力。由于蛋白质的相互作用能力和性质，这是蛋白质的一种通常定义的生物功能活性，因此某些氨基酸序列替换可以在蛋白质或肽序列中(或内)进行，当然也可以在基础dna编码序列中(内)进行，并且尽管如此，仍可以获得具有相同或相似特性的蛋白质。
91.因此，可以设想对所公开的肽序列或对编码肽的dna序列进行各种改变，而不会显著损失期望的效用或活性。在这样的修饰中，还可以考虑氨基酸的水感性(疏水性或亲水性)指数。水感性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物功能方面的重要性在本领域中是普遍理解的(kyte and doolittle,1982，通过引用并入本文)。例如，氨基酸的相对水感性有助于所产生蛋白质的二级结构，已知这反过来定义了蛋白质与其他分子如酶、底物、受体、dna、抗体、抗原等的相互作用。每个氨基酸基于其疏水性和电荷特性而指定了水感指数(kyte and doolittle,1982)。这些值为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；
苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
92.本领域已知，某些氨基酸可以被具有相似敏感性指数或评分的其他氨基酸替换，并产生具有相似生物活性的蛋白质(即仍然获得生物功能等价蛋白质)。在这种变化中，敏感性指数在
±
2以内的氨基酸优选用于替换，敏感性指数在
±
1以内的氨基酸替换是特别优选的，并且灵敏度指数为在
±
0.5以内的氨基酸替换是更特别优选的。
93.本领域还应理解，相同氨基酸的替换可以基于亲水性来实现。如美国专利第4,554,101号中所述，将以下亲水性值指定给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0
±
1)；谷氨酸(+3.0
±
1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5
±
1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。可以理解，氨基酸可以被具有相似亲水性值的其他氨基酸替换，并且可以获得生物等价蛋白质。在该变化中，亲水性值在
±
2以内的氨基酸的替换是优选的，亲水性值在
±
1以内的氨基酸的替换是特别优选的，并且亲水性值在
±
0.5以内的氨基酸的替换是甚至更特别优选的。
94.如上所述，氨基酸替换可以基于氨基酸侧链替换的相对相似性，例如，它可以基于它们的疏水性(侧链替换的相对类似性)、亲水性、电荷、尺寸等。考虑到上述各种特征的示例性替换是本领域技术人员公知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
95.氨基酸替换也可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲特性的相似性来进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有拥有相似亲水性值的不带电极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
96.此外，变体可以包含非保守的修饰。在优选实施方式中，变体肽可以通过5个或更少氨基酸的替换、缺失或添加而与天然序列不同。变体也可以例如通过缺失或添加对肽的二级结构和水感性影响最小的氨基酸来修饰。
97.肽可以包含在蛋白质的n末端的信号(或前导)序列，该序列同时或翻译后指导蛋白质的转运。肽也可以连接(缀合)到连接序列或其他序列，以促进肽的合成、纯化或鉴定(例如polyhis)，或增强肽与固体支持物的结合。例如，肽可以连接(缀合)到免疫球蛋白fc区域。
98.当比较肽序列时，如后所述当两个序列以最大对应性比对时，如果两个序列中的氨基酸序列相同，则称这两个序列“相同”。两个序列之间的比较典型地通过在比较窗口上比较序列来执行，以识别和比较序列相似性的局部区域。本说明书中使用的“比较窗口”意指具有至少约20个连续位置、典型地30至75、40至50个连续位置的片段，在该片段中，该序列与具有相同数目连续位置的参考序列可以在两个序列最佳比对之后进行比较。
99.可以使用默认参数，例如，使用生物信息学软件lasergene套件中的megalign程序
(dnastar,inc.,madison,wis.)对用于比较的序列进行最佳比对。该程序包括以下参考文献中描述的几种比对方案：dayhoff,m.o.(1978)a model of evolutionary change in proteins-matrices for detecting distant relationships。in dayhoff,m.o.(ed.)atlas of protein sequence and structure,national biomedical research foundation,washington d.c.vol.5,suppl.3,pp.345-358；hein j.(1990)unified approach to alignment and phylogenes pp.626-645methods in enzymology vol.183,academic press,inc.,san diego,calif.；higgins,d.g.and sharp,p.m.(1989)cabios 5:151-153；myers,e.w.and muller w.(1988)cabios 4:11-17；robinson,e.d.(1971)comb.theor 11:105；santou,n.nes,m.(1987)mol.biol.evol.4:406-425；sneath,p.h.a.and sokal,r.r.(1973)numerical taxonomy-the principles and practice of numerical taxonomy,freeman press,san francisco,calif.；wilbur,w.j.and lipman,d.j.(1983)proc.nat'l acad.,sci.usa80:726-730。
100.或者，用于比较的序列的最佳比对通过smith和waterman(1981)add.apl.math2:482的部分同一性算法执行，或者通过needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.48:443的同一性比对算法执行，或者通过pearson和lipman(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85:2444的相似性搜索方法执行，或者通过这些算法的计算机化执行(wisconsin genetics软件包,genetics computer group(gcg),575science dr.,madison,wis.中的gap、bestfit、blast、fasta和tfasta)来执行，或者可以通过检查来执行。
101.用于确定序列同一性和序列相似性百分比的合适算法的实例可以是blast和blast2.0算法，并且这些算法分别在altschul等人(1977)nucl.acids res.25:3389-3402和altschul等人(1990)j.mol.biol.215:403-410中描述。blast和blast2.0可用于例如，用本文所述的参数来测定本发明的多核苷酸和多肽的序列同源性百分比。用于进行blast分析的软件通过national center for biotechnology infomation可公开获得。对于氨基酸序列，可以使用评分矩阵来计算累积评分。
102.短序列命中(word hit)在每个方向上的延伸在以下情况下停止：当累积比对分数已经从其最大值减少了数量x时，当累积分数由于比对中一个或多个负评分残基的累积而变为零或更小时，或者当已经到达任何序列的末尾时。blast算法参数w、t和x决定了比对的灵敏度和速度。
103.在一个示例性方法中，通过在至少20个位置的比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定“序列同源性的百分比”，其中比较窗口中的多肽序列的区域可以包含相对于参考序列不超过20％，典型地为5-15％、或10％至12％的添加或缺失(即，间隙)(这不包括添加或缺失)。该百分比是通过以下确定的：确定两个序列中存在相同氨基酸残基的位置的数目以获得多个匹配位置，并且将匹配位置的数目除以参考序列中的位置总数(即，窗口尺寸)，并将结果乘以100以产生序列同源性百分比。
104.本发明提供的肽可以是线性形式或环状形式，这可以参考本发明的实施例来理解。
105.作为本发明变体的环状肽的制备不由本领域已知的任何肽环化的方法限制为具体的环化方法和所得的环化形式。优选地，本发明的环化肽是通过取线性肽并进行切割或替换以使半胱氨酸位于其两端(n端和c端)来制备的，并且该制备可以通过使存在于两端的
半胱氨酸残基之间形成单硫键来完成。
106.本发明提供的肽，在一个方面中，修饰的多肽的用途，其中修饰的多肽包括改善如本文所述的分离的多肽的期望特性的修饰。本发明的多肽的示例性修饰可以包括但不限于在一个或多个组成氨基酸处的化学衍生化和/或酶促衍生化，其中衍生化包括侧链变化、主链变化以及n-末端和c-末端变化，包括乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化、以及添加碳水化合物或脂质组分、部分，等等。示例性修饰包括多肽的聚乙二醇化。
107.在某些方面中，化学选择性连接技术可用于修饰本发明的肽，例如通过以位点特异性和受控的方式附接聚合物。这些技术典型地依赖于化学选择性锚定物通过化学手段或重组手段结合到蛋白质骨架中，以及随后用携带互补连接体的聚合物修饰。结果，控制了所获得的蛋白质-聚合物缀合物的组装过程和共价结构，从而使得能够合理优化药物特性，如疗效和药代动力学特性。例如，通过允许peg的选择性附接，改善了它们的药代动力学特性。
108.本发明的肽可以包括药学上可接受的盐形式。这种药学上可接受的盐例如包括但不限于，盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、马来酸盐、富马酸盐、草酸盐、甲磺酸盐或对甲苯磺酸盐。
109.本发明还提供了编码肽的多核苷酸。
110.如本文所用，术语“dna”、“多核苷酸”和“核酸”是指从特定物种的总基因组dna中分离的dna分子。因此，编码多肽的dna片段(节段)是指包含一个或多个编码序列的dna片段，所述编码序列是基本上从可获得dna片段的物种的总基因组dna中分离或纯化的。术语“dna片段”和“多核苷酸”包括dna片段和片段的较小片段，还包括重组载体(例如，质粒、粘粒、噬菌体质体、杀菌病毒、病毒等)。
111.如本领域技术人员所理解的，本发明的多核苷酸序列表达或被修饰以表达蛋白质、肽等，并且包括基因组序列、外基因组序列、在质粒上编码的序列和较小的工程化基因片段。这些片段可以是天然分离的，或者可以是人工合成修饰的。
112.如本领域技术人员所认识到的，多核苷酸可以是单链(编码序列或反义序列)，或者可以是双链，并且可以是dna分子(基因组、cdna或合成的)或rna分子。额外的编码或非编码序列可以存在于本发明的多核苷酸内。此外，多核苷酸可以连接到其他分子和/或载体材料。
113.多核苷酸可以包含天然序列，或者可以包含该序列的变体或生物功能等价物。多肽变体可以包括一个或多个替换、添加、缺失和/或插入，如下文进一步描述的那些，优选进行这样的修饰，使得经编码的多肽的期望活性相对于未修饰的多肽不显著降低。对经编码的多肽的活性的影响通常可以如本文所述进行评估。
114.本发明中提供的多核苷酸在其特定序列上没有特别限制，并且可以具有序列(核酸序列)配置的任何组合，只要它们编码本发明的肽或变体肽即可。例如，包含seq id no:2的氨基酸序列的肽可以由包含由seq id no:4表示的序列的多核苷酸表达，但不限于此。
115.无论编码序列本身的长度如何，本发明的多核苷酸都可以与其他dna序列，例如启动子、多聚腺苷酸化信号、额外的限制性内切酶位点、多个克隆位点、其他编码片段(部分、节段)等进行组合，其结果是它们的总长度可以显著变化。因此，可以设想，实际上任何长度的多核苷酸片段都是可应用的，其总长度优选地受到易于制造和在预期重组dna方案中使用的限制。
116.此外，由于遗传密码的简并性，对于本领域的普通技术人员来说，存在许多编码本文所述肽的核苷酸序列将是不言而喻的。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。然而，由于密码子使用的差异，其他多核苷酸(例如，针对人类和/或灵长类密码子选择优化的多核苷酸)是本发明特别考虑的。
117.此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本发明的范围内。等位基因是一种内源性基因，由于一个或多个突变，例如核苷酸的缺失、添加和/或替换而被修饰。所产生的mrna和蛋白质可能(但不一定)具有改变的结构或功能。等位基因可以使用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库序列比较)来鉴定。
118.多核苷酸及其融合体可以使用本领域已知和可用的任何公认技术来制备、工程化和/或表达。例如，编码本发明的肽的多核苷酸序列或其功能等价物可以在重组dna分子内用于指导多肽在合适的宿主细胞中的表达。由于遗传密码的固有简并性，可以产生编码基本相同或功能等价的氨基酸序列的其他dna序列，并且这些序列可以被克隆并用于表达给定的多肽。
119.如本领域技术人员所理解的，在一些情况下，产生具有天然界中不存在的密码子的核苷酸序列(编码多肽的核苷酸序列)是有利的。例如，可以选择特定原核或真核宿主中的优选密码子来提高蛋白质表达率或产生具有期望特性(例如，比由天然存在的序列产生的转录物的半衰期更长的半衰期)的重组rna转录物。
120.此外，由于多种原因(包括但不限于修改基因产物的克隆、加工、表达和/或活性的改变)，本发明的多核苷酸序列可以使用本领域通常已知的方法进行操作以修饰肽编码序列。
121.本发明还提供了包含多核苷酸的载体和用该载体转化的宿主细胞。
122.为了表达感兴趣的多肽，可以将编码多肽或功能等价物的核苷酸序列插入合适的表达载体(即，包含所插入的编码序列的转录和翻译所需元件的载体)中。包含编码感兴趣的多肽的序列以及适当的转录调控元件和翻译调控元件的表达载体可以通过本领域熟知的方法构建。这些方法包括体外重组dna技术、合成技术和体内基因重组：这些方法在以下参考文献中进行了描述：sambrook等人,molecular cloning,a laboratory manual(1989)以及ausubel等人,current protocols in molecular biology(1989)。
123.各种表达载体/宿主系统是本领域已知的，并且可以用于包含和表达多核苷酸序列。这种表达载体/宿主系统包括但不限于用重组噬菌体、质粒或粘粒dna表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒(baculoviruses))感染的昆虫系统；用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)，camv；烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)，tmv)或细菌表达载体(例如，ti或pbr322质粒)转化的植物系统；或微生物如动物系统。
124.表达载体内存在的“调控元件”或“调节序列”是与宿主细胞蛋白质相互作用以执行转录和翻译的非翻译区(增强子、启动子、5'和3'非翻译区)。这些元素可以在强度和特异性上变化。根据所使用的载体系统和宿主，可以使用任何数目的合适的转录和翻译元件(包括组成型启动子和诱导型启动子)。
125.例如，当克隆到细菌系统中时，可以使用诱导型启动子如pbluescript噬菌体(stratagene，la jolla，calif.)或来自psport1质粒的杂交lacz启动子(gibco brl，
gaithersburg，md)。在哺乳动物系统中，通常优选来源于哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。如果需要产生含有编码多肽的序列的多个拷贝的细胞系，则基于sv40或ebv的载体与适当的选择标记物组合可能是有用的。
126.在细菌系统中，可以根据预期用途选择多种表达载体用于肽表达。例如，如果需要大量，则可以使用指向易于纯化的融合蛋白的高水平表达的载体。此类载体包括但不限于以下：多功能大肠杆菌(e.coli)克隆载体和表达载体，如bluescript(stratagene)，其中编码感兴趣多肽的序列在载体的框架中与氨基末端met的序列和β-半乳糖苷酶的七个后续残基连接，从而产生杂交蛋白；pin载体(van heeke和schuster,j.biol.chem.264:5503 5509(1989))；等等。pgex载体(promega，madison，wis.)也可用于表达外源多肽作为与谷胱甘肽s-转移酶(gst)的融合蛋白。典型地，此类融合蛋白是可溶性的，并且可以通过吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠上并随后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而容易地从裂解细胞中纯化。该系统中产生的蛋白质可被设计为包含肝素、凝血酶或因子xa蛋白酶切割位点，以允许克隆的多肽从gst部分释放。
127.在酵母(酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae))中，可以使用许多载体，包括组成型启动子或诱导型启动子(例如，α因子、醇氧化酶和pgh)。这可以通过参考ausubel等人(见上文)以及grant等人，methods enzymol.153:516-544(1987)等来理解。。
128.当利用植物表达载体时，编码多肽的序列的表达可以由任何数目的启动子驱动。例如，病毒启动子(例如，camv的35s启动子和19s启动子)可以单独使用或与来源于tmv的ω(欧米茄)前导序列组合使用(takamatsu,embo j.6:307-311(1987))。或者，可以使用植物启动子(例如，rubisco的小亚单位或热休克启动子)。这些构建体可以通过直接dna转化或病原体介导的转染引入到植物细胞中。这样的技术在本领域中是已知的。
129.昆虫系统也可用于表达靶向多肽。例如，在一个系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(autographa californica nuclear polyhedrosis virus)(acnpv)被用作在草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)细胞或粉纹夜蛾幼虫(trichoplusia larvae)中表达外源基因的载体。编码多肽的序列可以克隆在病毒的非必需区域内，并位于多角体蛋白启动子(例如多角体蛋白基因)的控制下。编码多肽的序列的成功插入使多角体蛋白基因失去活性，并产生缺乏外壳蛋白的重组病毒。然后，重组病毒可以用于感染，例如，在其中表达感兴趣多肽的草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫。
130.在哺乳动物宿主细胞中，通常可以获得许多基于病毒的表达系统。例如，当腺病毒用作表达载体时，编码感兴趣的多肽的序列可以连接在由晚期启动子和三重前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合物内。通过利用插入到病毒基因组的非必需e1或e3区域中，可以获得能够在受感染的宿主细胞中表达多肽的活病毒。转录增强子(例如劳斯氏肉瘤病毒(rous sarcoma virus)(rsv)增强子)也可用于增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
131.此外，某些起始信号可用于编码感兴趣的多肽的序列的更有效的翻译。此类信号的实例包括atg起始密码子和相邻序列。如果将编码多肽的序列、其起始密码子和上游序列插入到合适的表达载体中，则可能不需要额外的转录或翻译调控信号。然而，如果仅插入编码序列或其一部分，则必须提供包含atg起始密码子的外源翻译调控信号。起始密码子也必须在正确的阅读框内，以确保整个插入的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以有各种来源(包括天然的和合成的)。表达的效率可以通过包含用于所使用的特定细胞系统的适当增
强子来增强。
132.宿主细胞系也可以基于其以期望的方式调节插入的序列的表达和/或加工所表达的蛋白质的能力来选择。多肽的此类修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂质化和酰化。切割蛋白质“前体”形式的翻译后加工可用于促进正确的插入、折叠和/或功能。可以选择不同的宿主细胞(例如cho、hela、mdck、hek293和w138，它们具有用于此类翻译后活性的特定的细胞机制和特征机制)，以确保外源蛋白的准确修饰和加工。
133.从长远来看，对于重组蛋白的高产率生产，稳定的表达通常是合意的。例如，可以使用表达载体转化稳定表达感兴趣的多核苷酸的细胞系，其中该表达载体可以包含病毒复制位点和/或内源性表达元件，以及在同一载体或单独载体上的选择标记基因。
134.在引入载体后，细胞可以在富集培养基中生长1至2天，之后将其转化为选择性培养基。选择标记的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在允许成功表达引入序列的细胞的生长和恢复。可以使用适合于细胞类型的组织培养技术来生长稳定转化细胞的抗性克隆。
135.可以使用多种选择系统来回收转化的细胞系。这些选择系统包括但不限于可分别用于tk细胞或aprt细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因。
136.此外，抗代谢药物耐药性、抗生素耐药性或除草剂耐药性可作为选择的依据。实例包括赋予对甲氨蝶呤抗性的dhfr；赋予对氨基糖苷类、新霉素和g-418抗性的npt；以及分别赋予对氯磺隆和膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinotricin acetyltransferase)抗性的als或pat(参见murry，上文)。本领域已知额外的选择基因，如trpb，其使得细胞能够利用吲哚而不是色氨酸，或者hisd，其使得细胞能够利用组氨醇(histinol)而不是组氨酸。可见标记物，如花青素、β-葡萄糖醛酸酶及其底物gus、以及荧光素酶及其底物荧光素，越来越受欢迎，不仅被广泛用于鉴定转化子，还被广泛用于量化可归因于特定载体系统的瞬时或稳定蛋白表达量。
137.本领域已知使用对多核苷酸编码的产物特异的多克隆或单克隆抗体来检测和测量多核苷酸编码的产物的表达的各种方案。实例包括酶联免疫吸附测定法(elisa)、放射免疫测定法(ria)和荧光活化细胞分选法(facs)。这些和额外的测定方法可以在本领域已知的方法中找到，这些方法通过引用并入本文。各种标记技术和缀合技术是本领域已知的，并且可以用于各种核酸测定和氨基酸测定。用于生产标记的杂交探针或标记的pcr探针以检测与多核苷酸相关的序列的手段包括寡标记(oligolabeling)、缺口翻译、末端标记或使用标记的核苷酸的pcr扩增。或者，为了生产mrna探针，可以将该序列或其任何部分克隆到载体中。这样的载体是本领域已知的和可商购的，并且可以用于通过添加适当的rna聚合酶(例如，t7、t3或sp6)和标记的核苷酸在体内合成rna探针。这些程序可以使用各种市售试剂盒进行。合适的报告分子或标记物包括放射性核素、酶、荧光团、化学发光剂或显色剂、底物、启动子、抑制剂和磁性颗粒。
138.用感兴趣的多核苷酸序列转化的宿主细胞可以在适合蛋白质表达及其从细胞培养物中回收的条件下培养。由重组细胞产生的蛋白质可以在细胞内分泌或包含在细胞内，这取决于其序列和/或载体。
139.如本领域技术人员所理解的，包含本发明多核苷酸的表达载体可以被设计为包含通过原核或真核细胞膜引导多肽分泌的信号序列。其他重组构建体可用于将编码感兴趣的多肽的序列与编码促进可溶性蛋白纯化的多肽结构域的序列连接。
140.除了重组生产方法外，本发明的多肽及其片段可以通过使用固相技术的直接肽合成来生产。蛋白质合成可以使用手动技术或通过自动化进行。自动化合成可以例如使用applied biosystems 431a peptide syntthesizer(perkin elmer)实现。或者，可以单独化学合成各种片段，然后使用化学方法组合以生产全长分子。
141.根据本发明的另一个方面，编码本发明的多肽的多核苷酸可以例如，使用基因治疗技术在体内递送给对象。基因治疗通常是指将异源核酸引入靶细胞，即具有需要这种治疗的病症或症状的哺乳动物，特别是人类的特定细胞。将核酸引入到选定的靶细胞中，表达异源dna，并产生由其编码的治疗产物。
142.可用于本文公开的基因治疗的各种病毒载体包括rna病毒，如腺病毒、疱疹病毒、牛痘、腺相关病毒(aav)，或优选逆转录病毒。优选地，逆转录病毒载体可以是鼠或禽逆转录病毒衍生物，或慢病毒载体。优选的逆转录病毒载体可以是慢病毒载体。可插入单一外源基因的逆转录病毒载体的实例包括但不限于以下：莫罗尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus)(momulv)、哈维鼠肉瘤病毒(harvey murine sarcoma virus)(hamusv)、鼠乳腺肿瘤病毒(murine mammary tumor virus)(mumtv)、siv、biv、hiv和劳斯氏肉瘤病毒(rsv)。许多额外的逆转录病毒载体可以结合多种基因。所有这些载体都可以包含选择标记基因，以确保转导的细胞被鉴定和产生。例如，靶向锌指衍生的dna结合多肽序列可以与编码特异性靶细胞上受体的配体的另一基因一起插入病毒载体中，从而使载体具有靶向特异性。
143.逆转录病毒载体可以例如通过插入编码多肽的多核苷酸而具有靶向特异性。例如，靶向可以通过使用针对逆转录病毒载体的抗体来实现。本领域技术人员熟悉可以插入逆转录病毒基因组中以实现包含锌指核苷酸结合蛋白多核苷酸的逆转录病毒载体的靶向特异性递送的特异性多核苷酸序列，其可以在没有过度实验的情况下容易地鉴定。
144.由于重组逆转录病毒是有缺陷的，因此它们需要辅助才能产生感染性载体颗粒。例如，可以通过使用辅助细胞系来提供这种辅助，该辅助细胞系包含在ltr中的调控序列的控制下编码逆转录病毒的所有结构基因的质粒。这些质粒缺乏使得包装机制能够识别用于封装的rna转录物的核苷酸序列。缺乏包装信号传导的辅助细胞系包括但不限于psi.2、pa317和pa12。这些细胞系产生空的病毒粒子是因为基因组没有被包装。如果将逆转录病毒载体引入到包装信号完整并且结构基因已被另一个感兴趣的基因替代的细胞中，则可以将载体包装并产生载体病毒粒子。然后，通过上述方法产生的载体病毒粒子可以用于感染组织细胞系(例如，nih3t3细胞)，从而产生大量的嵌合逆转录病毒粒子。
145.此外，可以使用用于基因治疗的“非病毒”递送技术，如dna-配体复合物、腺病毒-配体-dna复合物、dna直接注射、capo4沉淀、基因枪技术、电穿孔、脂质体技术和脂质转染。这些方法中的任何一种对本领域技术人员来说都是广泛可用的，并且适合用于本发明。本领域技术人员也可以使用其他合适的方法，并且不言而喻，本发明可以使用任何可用的转染方法来实现。脂质转染可以通过将分离的dna分子包封在脂质体颗粒内并使所述脂质体颗粒与靶细胞的细胞膜接触来实现。脂质体是胶质的自组装分子，其中由两亲性分子(如磷脂酰丝氨酸或磷脂酰胆碱)组成的脂质双层包封了周围介质的一部分，从而形成了围绕亲水内部的脂质双层。可以构建单层或多层脂质体，产生含有如在本发明中的期望的化学物质、药物或分离的dna分子的内部。
146.本发明还提供了一种疫苗佐剂，其包含选自以下(i)至(iv)中的至少一种：
147.(i)肽，
148.(ii)编码(i)的肽的多核苷酸；
149.(iii)包含(ii)的多核苷酸的载体，和
150.(iv)由(iii)的载体转化的宿主细胞。
151.在本发明中，疫苗佐剂可以定义为能够以这样的方式向免疫系统呈递抗原的物质，即当用所述疫苗佐剂施用抗原时，诱导对抗原的免疫反应或免疫反应的增加。换言之，疫苗佐剂是一种免疫增强剂，意指促进对抗原的免疫反应的物质，并且不是对宿主的免疫原，而是通过增加免疫系统细胞的活性来增强免疫力。
152.为了分析由疫苗佐剂诱导的抗原特异性免疫反应，可以将免疫反应与在存在抗原而没有疫苗佐剂的情况下诱导的免疫反应进行比较。该诱导可以在对象中或在来自对象的细胞中进行评估。
153.在本发明中，免疫反应可以是选自巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、b细胞和t细胞反应中的至少一种。特别地，免疫反应可以是b细胞反应，意指它能够产生特异性抗抗原的抗体。抗体优选为igg抗体，更优选igg2a和/或igg1抗体。免疫反应可以是t细胞反应，优选th1反应、th2反应或平衡的th2/th1反应。本领域普通技术人员将认识到，疾病依赖性b和/或t细胞反应可能需要被诱导来调节它们。可变地，免疫反应可以通过测量例如细胞因子如ifnγ、il-6、tnfα或il-10的产生来检测。这些细胞因子的产生可以通过elisa来评估，优选如在一个实施方式中进行的那样。
154.根据本发明的一个实施方式，已经发现seq id no:2的肽具有非常好的活化固有免疫和获得性免疫二者的效果，使得当用抗原处理时，可以显著增强对象的免疫反应的增加。
155.因此，对于本领域普通技术人员来说，不言而喻的是，seq id no:2的肽；或包含与所述肽显示至少95％同源性的氨基酸序列的肽、编码所述肽的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体以及用所述载体转化的宿主细胞也将显示相同的生理活性。
156.在本发明的一个实施方式中，与单独的抗原相比，当与抗原和疫苗佐剂一起施用时，疫苗佐剂可以诱导改善的先天和获得性免疫反应的活化，更具体地，改善的细胞和体液免疫反应。
157.在本发明的一个实施方式中，抗原特异性诱导的免疫反应的检测意指在施用本发明的疫苗佐剂后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多小时，或在施用后至少1天，或在施用后至少2天，或在施用后至少3天，或在施用后至少4天，或在施用后更多小时进行该检测。该检测可以在对象中或在对象的细胞中进行评估，优选如在实施方式中进行的。
158.在本发明的一个实施方式中，抗原特异性诱导的免疫反应优选意指对抗原的可检测的免疫反应。可检测的增加可在向对象施用疫苗佐剂和抗原后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小时发生，或在更长的时间段后，或在施用后至少1天、或在施用后至少2天、或在施用后至少3天、或在施用后至少4天、或在施用后更长的时间段，可以意指免疫细胞、抗体和/或细胞因子的量的至少5％、或10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％或更多的增加。该检测可以在对象中或在对象的细胞中进行评估，优选如在实施方式中进行的。
159.本发明还提供了一种疫苗组合物，其包含该疫苗佐剂和抗原。
160.在本发明中，疫苗是含有包含整个致病生物体(以下称为拯救的(rescued)或减毒的)或这种生物体的组分如蛋白质、肽或多糖的抗原的制剂，并用于赋予对由该生物体引起的疾病的免疫力。如上所述，包含seq id no:2的氨基酸序列的肽；或包含与该肽显示至少95％同源性的氨基酸序列的肽可以通过活化先天和获得性免疫系统用作疫苗组合物，以在用抗原施用时显著增强对象的免疫反应。
161.在本发明中，包含在疫苗组合物中的抗原可以是但不限于肽、蛋白质、糖蛋白、糖脂、脂质、碳水化合物、核酸、多糖和病毒、真菌、过敏原、组织、细胞等。非限制性实例包括花粉源抗原、甲型肝炎病毒源抗原、乙型肝炎病毒源抗原、丙型肝炎病毒源抗原、丁型肝炎病毒源抗原、戊型肝炎病毒源抗原、己型肝炎病毒源抗原、hiv病毒源抗原、流感病毒源抗原；疱疹病毒(hsv-1，hsv-2)源抗原、炭疽源抗原、衣原体源抗原、肺炎球菌源抗原、日本脑炎病毒源抗原、麻疹病毒源抗原、风疹病毒源抗原、破伤风菌源抗原、水痘病毒源抗原、sars病毒源抗原、eb病毒源抗原、乳头瘤病毒源抗原、幽门螺杆菌(helicobacter pylori)源抗原、狂犬病病毒源抗原、西尼罗河(west nile)病毒源抗原、汉他(hanta)病毒源抗原、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)源抗原、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)源抗原、百日咳博代氏杆菌(bordetella pertussis)源抗原、结核杆菌(mycobacterium tuberculosis)源抗原、疟原虫(plasmodium)源抗原、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)源抗原、各种人畜共同感染症源抗原、癌症抗原、以及各种食物过敏源抗原等。
162.包括在本发明的疫苗组合物中的抗原不需要是单一的。这是因为在本发明的一些应用中，可以针对多个组分如癌症细胞、细菌或病毒(而不是单个蛋白质或肽)产生免疫反应，在这种情况下，可以是可以引起免疫反应的多个蛋白质等，或者是无法指定的混合物。还可以使用本发明的疫苗组合物来主动产生对多种抗原的免疫反应，并包含多种抗原。
163.本发明的疫苗组合物中包含的抗原可以优选为肿瘤抗原。肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(tsa)或肿瘤相关抗原(taa)。几种肿瘤抗原及其表达模式是本领域已知的，并且可以根据待治疗的肿瘤的类型来选择。肿瘤抗原的非限制性实例包括甲胎蛋白、癌胚抗原、cdk4、β-连环蛋白、ca125、caspase-8、上皮性肿瘤抗原、hpv抗原、hpv16抗原、来源于hpv16 e7抗原的ctl表位、黑色素瘤相关抗原(mage)-1、mage-3、酪氨酸酶、表面ig独特型、her-2/neu、muc-1、前列腺特异性抗原(psa)、唾液酰tn(stn)、热休克蛋白、gp96、神经节苷脂分子gm2、gd2、gd3、癌胚抗原(cea)、prame、wt1、生存素、细胞周期蛋白d、细胞周期蛋白e、her2、mage、ny-eso、egf、gp100、组织蛋白酶g、人乳头瘤病毒(hpv)-16-e6、hpv-16-e7、hpv-18-e6、hpv-18-e7、her/2-neu抗原、嵌合her2抗原、前列腺特异性抗原(psa)、二价psa、erg、雄激素受体(ar)、pak6、前列腺干细胞抗原(psca)、ny-eso-1、角质层糜蛋白酶(scce)抗原、wilms肿瘤抗原1(wt-1)、hiv-1gag、人端粒酶逆转录酶(htert)、蛋白酶3、酪氨酸酶相关蛋白2(trp2)、高分子量黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)、滑膜肉瘤、x(ssx)-2、癌胚抗原(cea)、黑色素瘤相关抗原e(mage-a、mage1、mage2、mage3、mage4)、白细胞介素-13受体α(il13-rα)、碳酸酐酶ix(caix)、生存素、gp100、血管生成抗原、ras蛋白、p53蛋白、p97黑色素瘤抗原、klh抗原、癌胚抗原(cea)、gp100、mart1抗原、trp-2、hsp-70、β-hcg、testicine、1a01_hla-a/m；1a02；5t4；acrbp；afp；akap4；α-辅肌动蛋白-4/m；α-甲基酰基-辅酶_a_消旋酶；andr；art-4；artc1/m；aurkb；b2mg；b3gn5；b4gn1；b7h4；bage-1；basi；bcl-2；bcr/abl；β-连
环蛋白/m；bing-4；birc7；brca1/m；by55；钙网蛋白；camel；caspa；caspase_8；组织蛋白酶_b；组织蛋白酶_l；cd1a；cd1b；cd1c；cd1d；cd1e；cd20；cd22；cd276；cd33；cd3e；cd3z；cd4；cd44_同种型_1；cd44_同种型_6；cd52；cd55；cd56；cd80；cd86；cd8a；cdc27/m；cde30；cdk4/m；cdkn2a/m；cea；ceam6；ch3l2；clca2；cml28；cml66；coa-1/m；毛状_蛋白；胶原_xxiii；cox-2；cp1b1；csag2；ct-_9/brd6；ct45a1；ct55；ctag2_同种型_lage-1a；ctag2_同种型_lage-1b；ctcfl；cten；细胞周期蛋白_b1；细胞周期蛋白_d1；cyp-b；dam-10；dep1a；e7；ef1a2；eftud2/m；egfr；egln3；elf2/m；emmprin；epcam；epha2；epha3；erbb3；erbb4；erg；etv6；ews；ezh2；fabp7；fcgr3a_版本_1；fcgr3a_版本_2；fgf5；fgfr2；纤连蛋白；fos；foxp3；fut1；g250；gage-1；gage-2；gage-3；gage-4；gage-5；gage-6；gage7b；gage-8_(gage-2d)；gasr；gnt-v；gpc3；gpnmb/m；grm3；hage；hepsin；her2/neu；hla-a2/m；同源框_nkx3.1；hom-tes-85；hpg1；hs71a；hs71b；hst-2；htert；ice；if2b3；il-10；il-13ra2；il2-ra；il2-rb；il2-rg；il-5；imp3；ita5；itb1；itb6；激肽释放酶-2；激肽释放酶-4；ki20a；kiaa0205；kif2c；kk-lc-1；ldlr；lgmn；lirb2；ly6k；maga5；maga8；magab；mage-_b1；mage-_e1；mage-a1；mage-a10；mage-a12；mage-a2；mage-a3；mage-a4；mage-a6；mage-a9；mage-b10；mage-b16；mage-b17；mage-b2；mage-b3；mage-b4；mage-b5；mage-b6；mage-c1；mage-c2；mage-c3；mage-d1；mage-d2；mage-d4；mage-e1_(mage1)；mage-e2；mage-f1；mage-h1；magel2；乳腺珠蛋白_a；mart-1/melan-a；mart-2；mc1_r；m-csf；间皮素；mitf；mmp1_1；mmp7；muc-1；mum-1/m；mum-2/m；myo1a；myo1b；myo1c；myo1d；myo1e；myo1f；myo1g；myo1h；na17；na88-a；neo-pap；nfyc/m；ngep；n-myc；npm；nrcams；nse；nuf2；ny-eso-1；oa1；ogt；os-9；骨钙素；骨桥蛋白；p53；page-4；pai-1；pai-2；pap；pate；pax3；pax5；pd1l1；pdcd1；pdef；peca1；pgcb；pgfrb；pim-1_-激酶；pin-1；plac1；pmel；pml；pote；potef；prame；prdx5/m；prm2；prostein；蛋白酶-3；psa；psb9；psca；psgr；psm；ptprc；rab8a；rage-1；rara；rash；rask；rasn；rgs5；rhamm/cd168；rhoc；rssa；ru1；ru2；runx1；s-100；sage；sart-1；sart-2；sart-3；sepr；serpinb5；sia7f；sia8a；siat9；sirt2/m；sox10；sp17；spnxa；spxn3；ssx-1；ssx-2；ssx3；ssx-4；st1a1；stag2；stamp-1；steap-1；生存素；生存素-2b；sycp1；syt-ssx-1；syt-ssx-2；tarp；tcrg；tf2aa；tgfβ1；tgfr2；tgm-4；tie2；tktl1；tpi/m；trgv11；trgv9；trpc1；trp-p8；tsg10；tspy1；tvc_(trgv3)；tx101；酪氨酸酶；tyrp1；tyrp2；upa；vegfr1；wt1；xage1，α-辅肌动蛋白-4；artc1；bcr-abl融合蛋白(b3a2)；b-raf；casp-5；casp-8；β-连环蛋白；cdc27；cdk4；cdkn2a；coa-1；dek-can融合蛋白；eftud2；延长因子2；etv6-aml1融合蛋白；fn1；gpnmb；ldlr-岩藻糖转移酶as融合蛋白；hla-a2d；hla-a11d；hsp70-2；kiaao205；mart2；me1；mum-if；mum-2；mum-3；neo-pap；肌球蛋白i类；nfyc；ogt；os-9；pml-rarα融合蛋白；prdx5；ptprk；k-ras；n-ras；rbaf600；sirt2；snrpd1；syt-ssx1或ssx2融合蛋白；磷酸丙糖异构酶；bage-1；gage-1,2,8；gage-3,4,5,6,7；gntvf；herv-k-mel；kk-lc-1；km-hn-1；lage-1；mage-a1；mage-a2；mage-a3；mage-a4；mage-a6；mage-a9；mage-a10；mage-a12；mage-c2；粘蛋白k；na-88；ny-eso-1/lage-2；sage；sp17；ssx-2；ssx-4；trag-3；trp2-int2g；cea；gp100/pmel17；激肽释放酶4；乳腺珠蛋白-a；melan-a/mart-1；ny-br-1；oa1；psa；rab38/ny-mel-1；trp-1/gp75；trp-2；酪氨酸酶；adipophilin；aim-2；bing-4；cpsf；细胞周期蛋白d1；ep-cam；epha3；fgf5；g250/mn/caix；her-2/neu；il13rα2；肠羧基酯酶；甲胎蛋白；m-csf；mdm-2；mmp-2；muc1；p53；pbf；prame；psma；rage-1；rnf43；
ru2as；secernin 1；sox10；steap1；生存素；端粒酶；wt1；flt3-itd；bclx(l)；dkk1；enah(hmena)；mcsp；rgs5；胃泌激素-17；人绒毛膜促性腺激素、egfrviii、her2、her2/neu、p501、鸟苷酸环化酶c、前列腺酸性磷酸酶(pap)、卵清蛋白(ova)和mart-1。
164.本发明的疫苗组合物可以优选是抗癌疫苗。此外，抗癌疫苗可以是用于预防癌症的疫苗或用于治疗癌症的疫苗。
165.根据本发明的一个方面，包含含有seq id no:2的氨基酸序列的肽(或包含与其表现至少95％序列同源性的氨基酸序列的肽)和特定肿瘤抗原的疫苗组合物，可以在癌症形成之前施用至对象，并通过活化对象的免疫反应而表现出抑制癌症生长的预防效果。此外，本发明的疫苗组合物已被证明在癌症形成后对对象施用时作为治疗性疫苗有效，以抑制癌症的生长和/或杀死癌症。
166.在本发明中，癌症的类型不限于并且可以优选选自乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、胃癌、皮肤癌、头颈癌、肺癌、成胶质细胞瘤、口腔癌、垂体腺瘤、胶质瘤、脑肿瘤、咽癌、喉癌、胸腺瘤、间皮瘤、食管癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、胰腺内分泌肿瘤、胆囊癌、阴茎癌、输尿管癌、肾细胞癌、膀胱癌、非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、浆细胞肿瘤、白血病、儿童癌症、支气管癌、结肠和卵巢癌。
167.本发明的疫苗组合物可以进一步包含选自由任意疫苗佐剂和免疫检查点抑制剂中的至少一种。
168.在本发明的一个实施方式中，已经发现，当与任何额外的疫苗佐剂和/或免疫检查点抑制剂联合治疗时，本发明的肽对活化对象的免疫功能具有更显著的作用。特别地，这种效果可能是特别合意的，因为它最大限度地减少了由给予高剂量物质可能引起的副作用，并允许用最少的施用实现最大的有效性。
169.可以进一步包含在本发明的疫苗组合物中的疫苗佐剂的类型没有特别限制，并且应当理解，本领域中当前广泛使用的疫苗佐剂或将来新开发的疫苗佐剂也包括在其中。任何上述疫苗佐剂的非限制性实例可以包括1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg odn、cpg7909、sia、dslim、gm-csf、ic30、ic31、lmiquimod、imufact imp321、is patch、iscomatrix、juvimmune、lipovac、mf59、单磷酰脂a、montanide ims1312、montanide isa 206、montanide isa 50v、montanide isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、peptel载体系统、plg微粒、瑞喹莫德(resiquimod)、srl172、病毒体和其他病毒样颗粒、yf-17dbcg、aquila的qs21刺激子、ribi的detox。quil、superfos、freund’s、gm-csf、霍乱毒素、免疫佐剂、mf59和细胞因子，最优选地，它可以是cpg-odn。
170.在本发明中，所述免疫检查点抑制剂是阻断免疫系统抑制剂检查点的物质。免疫检查点可以是刺激性的或抑制性的。抑制性免疫检查点的阻断活化免疫系统功能，并可用于癌症免疫治疗[参见，例如,pardoll,nature reviews.cancer 12:252-64(2012)].当肿瘤细胞附着在特定的t细胞受体上时，导致活化的t细胞缺失。免疫检查点抑制剂防止肿瘤细胞附着在t细胞上，从而保持t细胞的活性。事实上，细胞和可溶性组分的协同作用可以对抗由病原体和癌症造成的损害。免疫系统检查点的调节需要改变该途径的至少一种组分的表达或功能活性，从而调节免疫系统的反应。免疫检查点抑制剂可以选自程序性细胞死亡-1(pd-1)拮抗剂、程序性细胞死亡-配体1(pd-l1)拮抗剂、程序性细胞死亡-配体2(pd-l2)拮抗剂、分化簇27(cd27)拮抗剂、分化簇28(cd28)拮抗剂、分化簇70(cd70)拮抗剂、分化簇80
(也称为b7-1(cd80)拮抗剂)、分化簇86(也称为b7-2(cd86)拮抗剂)、分化簇137(cd137)拮抗剂、分化簇276(cd276)拮抗剂、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kirs)拮抗剂、淋巴细胞活化基因3(lag3)拮抗剂、肿瘤坏死因子受体超家族成员4(也称为cd134(tnfrsf4)拮抗剂)、糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白(gitr)拮抗剂、糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白配体(gitrl)拮抗剂、4-1bb配体(4-1bbl)拮抗剂、溶细胞性t淋巴细胞相关抗原-4(ctla-4)拮抗剂、腺苷a2a受体(a2ar)拮抗剂、含v-set结构域的t细胞活化抑制剂1(vtcn1)拮抗剂、b-和t-淋巴细胞衰减子(btla)拮抗剂、吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)拮抗剂、t-细胞免疫球蛋白结构域及粘蛋白结构域(3tim-3)拮抗剂、t细胞活化v结构域ig抑制因子(vista)拮抗剂和杀伤细胞凝集素样受体亚家族a(klra)拮抗剂，并且可以优选是pd-1拮抗剂、pd-l1拮抗剂或lag3拮抗剂，最优选pd-l1拮抗剂。
[0171]
在本发明的一个实施方式中，免疫检查点抑制剂可以是pd-1拮抗剂。pd-1是一种t细胞共刺激受体，在肿瘤细胞逃避宿主免疫系统的能力中发挥核心作用。pd-1和pd-l1(pd-1拮抗剂的配体)之间的相互作用的阻断增强免疫功能并介导抗肿瘤活性。pd-1拮抗剂的实例包括特异性结合pd-1的抗体。特异性抗pd-1抗体包括但不限于纳武利尤单抗纳武利尤单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、sti-1014和fidilumab。
[0172]
在本发明的另一个实施方式中，免疫检查点抑制剂可以是pd-l1拮抗剂。pd-l1拮抗剂的实例包括特异性结合pd-l1的抗体。特异性抗pd-l1抗体包括但不限于阿维单抗(avelumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)和bms-936559。
[0173]
在另一个实施方式中，免疫检查点抑制剂可以是lag3拮抗剂。lag3，即淋巴细胞活化基因3，是调节t细胞稳态、增殖和活化的负共刺激受体。lag3也被报道参与调节性t细胞(treg)抑制功能。大多数lag3分子保留在微管组织中心附近的细胞中，并且仅在抗原特异性t细胞活化后被诱导[参考文献：u.s.2014/0286935]。lag3拮抗剂的实例包括特异性结合lag3的抗体。特异性抗lag3抗体包括但不限于gsk2831781。
[0174]
在本发明中，抗体意指包含完整的单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体和由至少两个完整的抗体形成的抗体片段，只要它们表现出它们预期的生物活性即可。在另一个实施方式中，抗体包含不保留抗体的fc部分的可溶性受体。在一个实施方式中，抗体可以是通过重组基因操作产生的人源化单克隆抗体及其片段。
[0175]
另一类免疫检查点抑制剂包括与t细胞上的pd-1受体结合并阻断其而不引起抑制剂信号传导的多肽。这样的肽包括b7-dc多肽、b7-h1多肽、b7-1多肽和b7-2多肽及其可溶性片段，如美国专利第8,114,845号所公开的。
[0176]
另一类免疫检查点抑制剂包括具有抑制pd-1信号传导的肽部分的化合物。此类化合物的实例在美国专利第8,907,053号中被公开。
[0177]
另一类免疫检查点抑制剂包括某些代谢酶的抑制剂，如吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)，其通过浸润骨髓细胞和肿瘤细胞表达。ido酶通过消耗t细胞合成代谢所需的氨基酸或通过合成细胞质受体的特异性天然配体来抑制免疫反应，从而改变淋巴细胞功能。
[0178]
本发明的组合物(例如，多肽、多核苷酸等)通常可以单独或与一种或多种其他治疗方式组合地在药学上可接受或生理学上可接受的溶液中配制，用于向细胞、组织或动物施用。如果需要(根据需要)，本发明的组合物可以与其他试剂(例如，其他蛋白质、多肽或各种药物活性剂)联合施用。可以包含在本发明的组合物中的其它成分实际上没有限制，其前
提是额外的试剂不会对本发明的肽等的特性产生不利影响。
[0179]
用于本发明的组合物的药学上可接受的赋形剂和载剂的剂型是本领域技术人员已知的。此外，使用本文所述的某些组合物及其制剂的适当剂量和治疗方案可以以本领域技术人员熟知的任何方式使用，包括例如经口、胃肠外、静脉内、鼻内、脑内和肌肉内施用。
[0180]
在某些应用中，本文公开的药物组合物可以通过经口施用递送给对象。因此，组合物可以用惰性稀释剂或用可吸收的可食用载剂配制，或者组合物可以包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者组合物可压缩成片剂，或组合物可以直接掺入食品中。
[0181]
在某些情况下，本文公开的药物组合物可以优选地通过非肠道、静脉内、肌肉内或腹膜内递送，并且这样的施用途径在例如美国专利第5,543,158号；美国专利第5,641,515号；美国专利第5,399,363号等中描述，其通过引用并入本文。活性化合物(作为游离碱或作为药学上可接受的盐)的溶液可以通过将其与表面活性剂如羟丙基纤维素在水中适当地混合来制备。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇或其混合物中制备，或者可以在油中制备。制剂可以包括防腐剂，以防止在正常储存和使用条件下微生物生长。
[0182]
适合注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体，以及允许即时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末(美国专利第5,466,468号通过引用并入本文)。在所有情况下，药物形式必须是充分无菌的和可流动的，以便于注射。它必须在生产和储存条件下是稳定的并且必须是防腐的，以防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载剂可以是溶剂或分散介质，例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、其合适混合物、和/或植物油。例如，通过使用诸如卵磷脂的涂布剂，通过保持分散所需的颗粒尺寸，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。可以通过各种抗菌和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚类、山梨酸、硫柳汞等)来实现微生物预防。在许多情况下，合意的是包含等渗剂，如糖或氯化钠。可注射组合物的延长的吸收可以通过在组合物中添加延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。
[0183]
例如，对于水溶液的非肠道施用，溶液应根据需要进行适当缓冲，并且液体稀释剂应首先用足够的生理盐水或葡萄糖等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内施用、肌肉内施用、皮下施用和腹膜内施用。在这方面可以使用的无菌水性介质是本领域技术人员已知的。例如，可以将单剂量溶解在1ml等渗nacl溶液中，添加到1000ml皮下灌注液中，或注射到提议的注射部位。根据用药物组合物治疗的对象的症状，剂量必然会发生一些变化。本领域普通技术人员将能够确定个体对象的适当剂量。此外，对于向人类施用，该组合物必须符合美国食品药品监督管理局生物制品办公室标准(fda office of biologics standards)所要求的无菌性、热原性以及一般安全性和纯度标准。
[0184]
无菌注射溶液可以通过将所需量的活性化合物与上文所列的各种其他组分(根据需要)一起包含在合适的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，分散体可以通过将各种无菌活性成分包含在无菌溶媒中来制备，所述无菌溶媒包含基础分散介质和上面列出的各种其他必要组分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法可以是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前灭菌和过滤的溶液中制备活性成分加上任何额外期望的组分的粉末。
[0185]
本文公开的组合物可以以中性或盐的形式配制。药学上可接受的盐可以包括酸加合盐(由蛋白质的游离氨基形成)，其中酸加合盐由无机酸(例如，盐酸或磷酸等)或有机酸
(乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和有机碱(例如，异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。根据制剂，溶液以适合剂型的方式以治疗有效量施用。制剂可以容易地以各种剂型施用，例如注射溶液、药物释放胶囊等。
[0186]
如本文所用，术语“载剂”包括任何溶剂、分散介质、溶媒、涂料、稀释剂、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲液、载剂溶液、悬浮液、胶体等。这种介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域是众所周知的。它们用于治疗组合物，除了任何常规介质或试剂与活性成分不相容的情况。辅助活性成分也可以包含在本发明的组合物中。
[0187]
表述“药学上可接受的”是指当施用至人类时不引起过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。制备包含蛋白质作为活性成分的水性组合物的方法是本领域公知的。典型地，这样的组合物制备为可注射的液体溶液或悬浮液；也可以制备适用于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。此外，组合物可以被乳化。
[0188]
在某些实施方式中，药物组合物可以通过鼻内喷雾、吸入和/或其他气溶胶递送溶媒进行递送。用于通过鼻气溶胶喷雾将基因、多核苷酸和肽组合物直接递送至肺部的方法描述于例如美国专利第5,756,353号和美国专利第5,804,212号中，其通过引用并入本文。类似地，使用微粒树脂(takenaga等人，1998)和溶血磷脂酰甘油化合物(美国专利第5,725,871号)的药物的鼻内递送在药物领域也是众所周知的。类似地，以聚四氟乙烯支持基质形式的透粘膜药物递送描述在美国专利第5,780,045号中，其通过引用并入本文。
[0189]
在某些实施方式中，可以通过利用脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等将本发明的组合物引入到适当的细胞中来实现递送。特别地，本发明的组合物可以包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒中，并配制用于递送。这些递送溶媒的配制和利用可以使用已知的现有技术进行。
[0190]
此外，本发明的药物组合物可以使用本领域已知的方法配制，以在施用至哺乳动物后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。如上所述，以这种方式配制的药物组合物可以通过包括经口、经皮、皮下、静脉内或肌肉内的多种途径中的任何途径以有效量施用，。如本文所用，“有效量”是物质在施用至患者时允许对诊断或治疗效果进行检测的量。虽然活性成分的量可以根据疾病的严重程度而变化，但基于成人，包含本发明的多肽的药物组合物可以以每剂0.1μg至10,000mg，优选1mg至5,000mg的有效量每天施用数次。然而，根据本发明的药物组合物的剂量可以根据施用的途径、施用的对象、对象的疾病及其严重程度、年龄、性别体重、个体差异和疾病状态进行适当选择，并且此类技术是本领域技术人员公知的。
[0191]
在另一个方面中，本发明提供了在细胞、组织或对象中利用本发明的组合物(例如，多核苷酸、多肽等)以实现期望的细胞效果和/或治疗效果的方法。可以被本发明调节的细胞或组织可以优选地是哺乳动物细胞或组织，并且更优选地是人类细胞或组织。这样的细胞或组织可以处于健康状态或患病状态。
[0192]
本发明还提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含选自以下(i)至(iv)中的至少一种：
[0193]
(i)肽，
[0194]
(ii)编码(i)的肽的多核苷酸；
[0195]
(iii)包含(ii)的多核苷酸的载体，和
[0196]
(iv)由(iii)的载体转化的宿主细胞。
[0197]
根据本发明的一个方面，包含seq id no:2的氨基酸序列的肽；或者，包含与所述肽显示至少95％同源性的氨基酸序列的肽，可以对肿瘤生长本身发挥抑制和杀伤作用二者，从而对癌症具有预防或治疗作用。
[0198]
本发明还提供了选自以下(i)至(iv)中的至少一种用于制备用于治疗癌症的试剂的用途：
[0199]
(i)肽，
[0200]
(ii)编码(i)的肽的多核苷酸；
[0201]
(iii)包含(ii)的多核苷酸的载体，和
[0202]
(iv)由(iii)的载体转化的宿主细胞。
[0203]
本发明还提供了一种用于治疗癌症的方法，包括向有需要的对象施用有效量的组合物，所述组合物包含选自以下(i)至(iv)中的至少一种：
[0204]
(i)肽，
[0205]
(ii)编码(i)的肽的多核苷酸；
[0206]
(iii)包含(ii)的多核苷酸的载体，和
[0207]
(iv)由(iii)的载体转化的宿主细胞。
[0208]
本发明的术语“有效量”意指当施用至对象时表现出改善、治疗、预防、检测、诊断或抑制或减少癌症效果的量。“对象”可以是动物，优选哺乳动物，特别是包括人类在内的动物，也可以是来源于动物的细胞、组织和器官。对象可能是需要这些效果的患者。
[0209]
本发明的术语“治疗”综合地是指改善癌症或癌症的症状，并且可以包括治疗或实质上预防这些疾病或改善其状况，并且包括缓解、治疗或预防症状或来源于这些疾病的大多数症状，但不限于此。
[0210]
有益效果
[0211]
本发明中公开的肽是在本说明书中首次公开的crs片段，并且表现出抗癌活性和免疫功能增强活性。
[0212]
此外，该肽、编码该肽的多核苷酸、包含该多核苷酸的载体、用该载体转化的宿主细胞、或crs全长蛋白质具有优异的抗癌活性和免疫功能增强活性，因此可以非常有用地用于开发疫苗佐剂、疫苗组合物和癌症治疗组合物。
附图说明
[0213]
图1是简要说明c-vax开发方法的示意图。
[0214]
图2是通过纯化来源于c-vax开发过程的中间体，使用丙烯酰胺凝胶进行sds-page，然后用考马斯蓝(coomasiae blue)染料对蛋白质进行染色来确认蛋白质的稳定性的结果。
[0215]
图3是通过尺寸排阻色谱法和fplc确认une-c1-4h和c-vax是否为多聚体的结果。
[0216]
图4是通过将所开发的c-vax用his-une-c1-his和pma(50ng/ml)处理48小时，然后用分化的thp-1细胞处理4小时，通过elisa确认培养基中tnf-α水平的结果。
[0217]
图5和图6分别是用各浓度的his-une-c1-his和c-vax处理bmdc 24小时后，通过
elisa确认培养基中存在的il-6(e)、il-12p70(f)的结果。
[0218]
图7是通过用各浓度的his-une-c-his、c-vax处理各hek-blue细胞系24小时，然后收集上清液并与quanti-blue溶液反应来确认各细胞系的免疫活性的实验结果。
[0219]
图8是将eg7-ova细胞(5
×
105)皮下移植到c57bl/6小鼠的右背部上，然后在第3天和第10天用ova(10ug/小鼠)、或ova(10ug/小鼠)+his-une-c1-his(100ug/小鼠)、或ova(10ug/小鼠)+c-vax(100ug/小鼠)，观察肿瘤尺寸直到第17天的结果。
[0220]
实施发明的方式
[0221]
在下文中，将详细描述本发明。
[0222]
然而，以下实例仅用于说明本发明，并且本发明的内容不限于以下实例。
[0223]
实验方法
[0224]
1.小鼠
[0225]
c57bl/6和balb/c小鼠获得自duyul biotech。此外，ova特异性t细胞受体转基因ot-1小鼠由首尔国立大学(seoul national university)的kang chang-yul教授善意提供。所有小鼠实验均按照首尔国立大学批准的指导方针进行。所有小鼠均使用机构批准的方案维持在woojung bsc上。
[0226]
2.细胞系
[0227]
通过g418选择方法产生ct26和b16f10 crs过表达细胞。简言之，使用lipofectamine 2000将pexpr-iba105 ev和crs转化到每个细胞中。为了选择过表达的细胞，在生长培养基中使用1mg/ml的g418，并选择抗性单克隆。通过免疫印迹测试每个克隆的表达水平，选择体外生长相似的克隆并用于实验。
[0228]
3.异基因小鼠肿瘤模型和肿瘤测量
[0229]
将ct26和b16f10维持在含有10％fbs和1％链霉素的dmem中。将总共5
×
105个ct26和b16f10细胞分别皮下注射到6-8周龄的balb/c和c57bl/6小鼠的右侧。在第7、8和9天，腹膜内注射每种蛋白质200μg。用数显卡尺测量肿瘤，并根据以下方程计算(0.52
×
长度
×
宽度2)。当肿瘤达到超过1500mm3时，对小鼠实施安乐死。
[0230]
4.细胞结合测定
[0231]
将c57bl/6小鼠的脾脏分离后，施加物理力将其分离并分裂成单个细胞。将其在4℃下与使用用alexa647染料染色的bsa和crs蛋白分裂的脾细胞孵育1小时。将培养的细胞用cd11b、cd11c、cd3、cd19、ly6c、ly6g和f4/80facs抗体染色，并通过facs分析进行分析。cd3：t细胞，cd11b+,f4/80+：巨噬细胞，cd11b，ly6c：单核细胞，cd11b+,ly6g：嗜中性粒细胞，cd19：b细胞，cd11b+,cd11c+：树突状细胞
[0232]
5.肿瘤浸润免疫细胞和脾脏免疫细胞测定
[0233]
在第10天和第12天处死携带ct26肿瘤的小鼠。使用肿瘤解离试剂盒，小鼠(130-096-730，miltenyi biotec)，根据制造商的方案解离肿瘤细胞。将脾细胞在含有以下的培养基中解离：含有2％fbs和1％链霉素的rpmi培养基。在裂解红细胞(裂解缓冲液(555899，bd biosciences))后，用cd8、cd4、cd3、cd45、foxp3和cd69抗体将肿瘤和脾脏细胞染色。将单克隆抗体在4℃下染色30分钟。对于细胞内染色，使用带有bd golgiplug
tm
的固定/渗透溶液试剂盒(555028，bd biosciences)。
[0234]
6.蛋白质纯化
[0235]
使用含有n和c末端6x his标签的pet28a质粒载体对crs和crs(106-228)蛋白进行纯化。在his-une-c1-4h和c-vax的情况下，使用含有n-末端6x his标签和通过rtev可切割的区域的phis.parallell质粒载体进行纯化。将转化为bl21密码子+的细胞和菌落接种到培养基中并生长。在lb中生长大规模细胞，直到od600达到0.5，并使用0.5mm iptg在4℃下诱导蛋白质表达16小时。通过离心获得细胞沉淀，并通过在含有300mm nacl的50mm tris缓冲液ph7.5中通过超声破碎。然后，通过以20,000g离心30分钟获得上清液。将其倒在含有ni-nta树脂的柱上。用含有300mm nacl、5％甘油和15mm咪唑的50mm tris、ph 7.5进行洗涤步骤。用10ml洗脱缓冲液(50mm tris ph7.5、300mm nacl、5％甘油、300mm咪唑)从柱中分离蛋白质。在his-une-c1-4h和c-vax的情况下，将rtev蛋白酶以1:20(g)目标蛋白总量混合，然后进行透析并使用tx-114去除内毒素(ref：使用triton x-114通过相分离从蛋白质溶液中去除内毒素)。在用sm-2珠填充poly-prep柱之后，根据制造商的推荐方案，通过使蛋白质通过来去除剩余的triton x-114。整个实验使用来自lal测定的0.04eu/mg或更低的滴定蛋白。
[0236]
7.elisa
[0237]
对thp1-pma和bmdc(骨髓来源的dc)细胞进行测试以确认细胞因子分泌。在24孔板中用5
×
105个细胞/ml处理，并在药物处理前2小时将每个孔换成无血清培养基。在thp1-pma的情况下，将100nm的蛋白质处理4小时。对于bmdc细胞，将100nm浓度的蛋白质处理24小时。使用il-6、tnf-α和il-12elisa试剂盒(bd)，通过将上清液以500g离心10分钟来进行elisa。
[0238]
8.活化bmdc和bmm
[0239]
使用标准方法制备骨髓来源的树突状细胞(bmdc)。简言之，从雌性c57bl/6小鼠获得骨髓细胞，并在含有10％fbs、1％链霉素和10ng/ml gm-csf(r&d，bmdc)或10ng/ml m-csf(r&d，bmm)的rpmi培养基中培养。在第3天，添加gm-csf或m-csf和新鲜rpmi培养基，并在第6天从非贴壁和松散贴壁细胞中收获bmdc，从贴壁细胞中收获bmm。将100nm的各蛋白质和1μg/ml的lps处理18小时，然后使用抗cd11c、cd40、cd80和cd86的抗体进行facs分析。
[0240]
9.治疗性抗癌疫苗小鼠模型
[0241]
在使用c-vax的治疗性癌症疫苗模型中，将e.g7-ova细胞皮下注射到背部右侧。在第3天和第10天，分别向背部左侧注射ova(10ug/小鼠)、ova(10ug/小鼠)+his-une-c1-his(100ug/小鼠)、ova(10ug/小鼠)+c-vax(100ug/小鼠)，如上所述测量肿瘤体积。
[0242]
10.尺寸排阻色谱法(fplc：快速蛋白质液相色谱法)
[0243]
使用amicon ultra-15离心过滤器单元和由50mm tris、ph 7.5、300mm nacl组成的缓冲液将蛋白质样品浓缩至所需浓度。在将柱(ge healthcare，chiggo，illinois，usa)与akta pure(ge healthcare)连接后，用柱体积三倍的缓冲液洗涤，并用蛋白质缓冲液平衡。在进行平衡后，将蛋白质样品注射到akta pure中，并根据方案根据制造商说明书的执行条件进行实验。
[0244]
11.hek-blue seap测定
[0245]
将hek细胞在5％的co2下的37℃孵化器中在含有1％抗生素、10％fbs和100ug/ml normocin(invivogen,san diego,ca,usa)的dmem中培养。将待加工的蛋白质在24孔板中加工之后，将5x105个细胞的htlr2、htlr1/tlr2和tlr2ko-htlr1/tlr2-hek-blue细胞添加到
每个孔中。将板孵育24小时，收集上清液。将收集的上清液与quanti-blue溶液(invivogen)混合，在37℃下孵育15分钟至6小时，并在od 620nm处测量结果。
[0246]
实验结果
[0247]
1.c-vax的开发，一种药物开发形式，以及免疫活性和抗癌功效的验证
[0248]
在现有研究中确认crs(106-228)的功效后，本发明人进行了使crs(106-228)成为能够进行药物开发的形式的研究。一种可以作为药物开发的形式必须满足三个条件：(1)没有标签，(2)没有蛋白质降解的稳定性，和(3)与初始形式相同或更高的效力。
[0249]
先前研究中使用的crs(106-228)具有附着在蛋白质两端的his标签，并且在本发明中，crs(106-228)片段被命名为his-une-c1-his。在本发明中，进行了一项研究，以去除his-une-c1-his两端的his标签，并通过半胱氨酸将多形式转化为单一形式(图1)。
[0250]
(1)his标签的去除和蛋白质序列的控制(une-c1-4h的产生)
[0251]
在his-une-c1-his蛋白中，首先去除c末端his标签(his-une-c1)，然后确认蛋白质降解。为了使其稳定，将蛋白质序列从crs的106-228aa调节到99-200aa(seq id no:1)，确认了序列控制的crs(99-200aa)肽(以下称为“une-c1-4h”)是没有蛋白质降解的稳定形式(图2)。
[0252]
(2)无多聚体形式的单一形式肽的制造
[0253]
通过fplc(快速蛋白质液相色谱法)确认所制备的une-c1-4h以三聚体和单体两种形式存在。为了解决这个问题，将une-c1-4h中存在的半胱氨酸残基修饰成丝氨酸残基，并且确认当通过fplc确认时仅存在单体(图3)。其中半胱氨酸残基被修饰成丝氨酸残基的une-c1-4h被命名为c-vax。
[0254]
(3)c-vax的免疫活性
[0255]
使用pma分化的thp-1细胞系，确认了his-une-c1-his和c-vax的巨噬细胞免疫活化功效。作为实验的结果，确认了c-vax和his-une-c1-his都显示出足够的免疫活化功效(图4)。
[0256]
此外，使用骨髓来源的树突状细胞(bmdc)确认了his-une-c1-his和c-vax的免疫活化功效。作为实验的结果，确认了c-vax和his-une-c1-his二者都增加了bmdc中il-6和il-12p70细胞因子分泌(图5和6)。
[0257]
(4)通过tlr2/6的c-vax免疫活化机制
[0258]
由于先前的研究已经证实his-une-c1-his通过tlr2/6引起免疫活性，因此在本发明中，我们试图确认基于his-une-c1-his制备的c-vax是否也通过tlr2/6具有免疫活性。
[0259]
作为使用htlr2-hek-blue细胞系、htlr2 ko-tlr1/6-hek-blue细胞系和htlr1/2-hek-blue细胞系的实验的结果，his-une-c1-his和c-vax以相同的模式表现出免疫活性，并且tlr2非常重要，并且已经确认tlr1/6是无效的。因此，发现c-vax也使用tlr2/6作为受体，并且c-vax通过与his-une-c1-his相同的机制表现出免疫活性(图7)。
[0260]
(5)c-vax的抗癌功效
[0261]
由于在先前研究中确认了his-une-c1-his作为抗癌疫苗的功效，因此c-vax的抗癌疫苗功效也得到了确认。
[0262]
在第3天和第7天进行右侧皮下注射具有数目为5x105个细胞的e.g7-ova细胞系，以及左侧皮下注射his-une-c1-his、c-vax 5mpk和ova蛋白，并测量癌症的大小和小鼠的重
量。
[0263]
当用ova处理c-vax时，确认显示出强烈的抗癌作用，如用ova治疗his-une-c1-his时的情况(图8)。
[0264]
工业实用性
[0265]
本发明中公开的肽是在本说明书中首次公开的crs片段，并且表现出抗癌活性和免疫功能增强活性。
[0266]
此外，该肽、编码该肽的多核苷酸、包含该多核苷酸的载体、用该载体转化的宿主细胞、或crs全长蛋白质具有优异的抗癌活性和免疫功能增强活性，因此可以非常有用地用于开发疫苗佐剂、疫苗组合物和癌症治疗组合物，并因此具有优异的工业实用性。

技术特征：
1.一种由seq id no:2的氨基酸序列或与其示出95％或更多序列同源性的氨基酸序列组成的肽。2.根据权利要求1的肽，其中所述肽活化固有免疫和适应性免疫。3.根据权利要求1的肽，其中所述肽由seq id no:2或seq id no:3的氨基酸序列组成。4.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1的肽的核苷酸序列。5.根据权利要求4的多核苷酸，其中所述多核苷酸由seq id no:4的核苷酸序列组成。6.一种载体，其包含权利要求5的多核苷酸。7.一种用权利要求6的载体转化的宿主细胞。8.一种疫苗佐剂，其包含选自以下(i)至(iv)中的至少一种：(i)权利要求1的肽，(ii)编码(i)的肽的多核苷酸；(iii)包含(ii)的多核苷酸的载体，和(iv)由(iii)的载体转化的宿主细胞。9.一种疫苗组合物，其包含权利要求8的疫苗佐剂和抗原。10.根据权利要求9的疫苗组合物，其中所述抗原是选自以下的至少一种：甲胎蛋白、癌胚抗原、cdk4、β-连环蛋白、ca125、胱天蛋白酶-8、上皮性肿瘤抗原、hpv抗原、hpv16抗原、来源于hpv16 e7抗原的ctl表位、黑色素瘤相关抗原(mage)-1、mage-3、酪氨酸酶、表面ig独特型、her-2/neu、muc-1、前列腺特异性抗原(psa)、唾液酰tn(stn)、热休克蛋白、gp96、神经节苷脂分子gm2、gd2、gd3、癌胚抗原(cea)、prame、wt1、生存素、细胞周期蛋白d、细胞周期蛋白e、her2、mage、ny-eso、egf、gp100、组织蛋白酶g、人乳头瘤病毒(hpv)-16-e6、hpv-16-e7、hpv-18-e6、hpv-18-e7、her/2-neu抗原、嵌合her2抗原、前列腺特异性抗原(psa)、二价psa、erg、雄激素受体(ar)、pak6、前列腺干细胞抗原(psca)、ny-eso-1、角质层糜蛋白酶(scce)抗原、wilms肿瘤抗原1(wt-1)、hiv-1gag、人端粒酶逆转录酶(htert)、蛋白酶3、酪氨酸酶相关蛋白2(trp2)、高分子量黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)、滑膜肉瘤、x(ssx)-2、癌胚抗原(cea)、黑色素瘤相关抗原e(mage-a、mage1、mage2、mage3、mage4)、白细胞介素-13受体α(il13-rα)、碳酸酐酶ix(caix)、生存素、gp100、血管生成抗原、ras蛋白、p53蛋白、p97黑色素瘤抗原、klh抗原、癌胚抗原(cea)、gp100、mart1抗原、trp-2、hsp-70、β-hcg、testicine、1a01_hla-a/m；1a02；5t4；acrbp；afp；akap4；α-辅肌动蛋白-4/m；α-甲基酰基-辅酶_a_消旋酶；andr；art-4；artc1/m；aurkb；b2mg；b3gn5；b4gn1；b7h4；bage-1；basi；bcl-2；bcr/abl；β-连环蛋白/m；bing-4；birc7；brca1/m；by55；钙网蛋白；camel；caspa；胱天蛋白酶_8；组织蛋白酶_b；组织蛋白酶_l；cd1a；cd1b；cd1c；cd1d；cd1e；cd20；cd22；cd276；cd33；cd3e；cd3z；cd4；cd44_同种型_1；cd44_同种型_6；cd52；cd55；cd56；cd80；cd86；cd8a；cdc27/m；cde30；cdk4/m；cdkn2a/m；cea；ceam6；ch3l2；clca2；cml28；cml66；coa-1/m；毛状_蛋白；胶原_xxiii；cox-2；cp1b1；csag2；ct-_9/brd6；ct45a1；ct55；ctag2_同种型_lage-1a；ctag2_同种型_lage-1b；ctcfl；cten；细胞周期蛋白_b1；细胞周期蛋白_d1；cyp-b；dam-10；dep1a；e7；ef1a2；eftud2/m；egfr；egln3；elf2/m；emmprin；epcam；epha2；epha3；erbb3；erbb4；erg；etv6；ews；ezh2；fabp7；fcgr3a_版本_1；fcgr3a_版本_2；fgf5；fgfr2；纤连蛋白；fos；foxp3；fut1；g250；gage-1；gage-2；gage-3；gage-4；gage-5；gage-6；gage7b；gage-8_(gage-2d)；gasr；gnt-v；gpc3；gpnmb/m；grm3；hage；hepsin；her2/neu；hla-a2/m；同源框_
nkx3.1；hom-tes-85；hpg1；hs71a；hs71b；hst-2；htert；ice；if2b3；il-10；il-13ra2；il2-ra；il2-rb；il2-rg；il-5；imp3；ita5；itb1；itb6；激肽释放酶-2；激肽释放酶-4；ki20a；kiaa0205；kif2c；kk-lc-1；ldlr；lgmn；lirb2；ly6k；maga5；maga8；magab；mage-_b1；mage-_e1；mage-a1；mage-a10；mage-a12；mage-a2；mage-a3；mage-a4；mage-a6；mage-a9；mage-b10；mage-b16；mage-b17；mage-b2；mage-b3；mage-b4；mage-b5；mage-b6；mage-c1；mage-c2；mage-c3；mage-d1；mage-d2；mage-d4；mage-e1_(mage1)；mage-e2；mage-f1；mage-h1；magel2；乳腺珠蛋白_a；mart-1/melan-a；mart-2；mc1_r；m-csf；间皮素；mitf；mmp1_1；mmp7；muc-1；mum-1/m；mum-2/m；myo1a；myo1b；myo1c；myo1d；myo1e；myo1f；myo1g；myo1h；na17；na88-a；neo-pap；nfyc/m；ngep；n-myc；npm；nrcams；nse；nuf2；ny-eso-1；oa1；ogt；os-9；骨钙素；骨桥蛋白；p53；page-4；pai-1；pai-2；pap；pate；pax3；pax5；pd1l1；pdcd1；pdef；peca1；pgcb；pgfrb；pim-1_-激酶；pin-1；plac1；pmel；pml；pote；potef；prame；prdx5/m；prm2；prostein；蛋白酶-3；psa；psb9；psca；psgr；psm；ptprc；rab8a；rage-1；rara；rash；rask；rasn；rgs5；rhamm/cd168；rhoc；rssa；ru1；ru2；runx1；s-100；sage；sart-1；sart-2；sart-3；sepr；serpinb5；sia7f；sia8a；siat9；sirt2/m；sox10；sp17；spnxa；spxn3；ssx-1；ssx-2；ssx3；ssx-4；st1a1；stag2；stamp-1；steap-1；生存素；生存素-2b；sycp1；syt-ssx-1；syt-ssx-2；tarp；tcrg；tf2aa；tgfβ1；tgfr2；tgm-4；tie2；tktl1；tpi/m；trgv11；trgv9；trpc1；trp-p8；tsg10；tspy1；tvc_(trgv3)；tx101；酪氨酸酶；tyrp1；tyrp2；upa；vegfr1；wt1；xage1，α-辅肌动蛋白-4；artc1；bcr-abl融合蛋白(b3a2)；b-raf；casp-5；casp-8；β-连环蛋白；cdc27；cdk4；cdkn2a；coa-1；dek-can融合蛋白；eftud2；延长因子2；etv6-aml1融合蛋白；fn1；gpnmb；ldlr-岩藻糖转移酶as融合蛋白；hla-a2d；hla-a11d；hsp70-2；kiaao205；mart2；me1；mum-if；mum-2；mum-3；neo-pap；肌球蛋白i类；nfyc；ogt；os-9；pml-rarα融合蛋白；prdx5；ptprk；k-ras；n-ras；rbaf600；sirt2；snrpd1；syt-ssx1或ssx2融合蛋白；磷酸丙糖异构酶；bage-1；gage-1,2,8；gage-3,4,5,6,7；gntvf；herv-k-mel；kk-lc-1；km-hn-1；lage-1；mage-a1；mage-a2；mage-a3；mage-a4；mage-a6；mage-a9；mage-a10；mage-a12；mage-c2；粘蛋白k；na-88；ny-eso-1/lage-2；sage；sp17；ssx-2；ssx-4；trag-3；trp2-int2g；cea；gp100/pmel17；激肽释放酶4；乳腺珠蛋白-a；melan-a/mart-1；ny-br-1；oa1；psa；rab38/ny-mel-1；trp-1/gp75；trp-2；酪氨酸酶；adipophilin；aim-2；bing-4；cpsf；细胞周期蛋白d1；ep-cam；epha3；fgf5；g250/mn/caix；her-2/neu；il13rα2；肠羧基酯酶；甲胎蛋白；m-csf；mdm-2；mmp-2；muc1；p53；pbf；prame；psma；rage-1；rnf43；ru2as；secernin 1；sox10；steap1；生存素；端粒酶；wt1；flt3-itd；bclx(l)；dkk1；enah(hmena)；mcsp；rgs5；胃泌激素-17；人绒毛膜促性腺激素、egfrviii、her2、her2/neu、p501、鸟苷酸环化酶c、前列腺酸性磷酸酶(pap)、卵清蛋白(ova)和mart-1。11.根据权利要求9或10的疫苗组合物，其中所述疫苗是抗癌疫苗。12.根据权利要求11的疫苗组合物，其中所述抗癌疫苗是用于预防癌症的疫苗或用于治疗癌症的疫苗。13.根据权利要求11的疫苗组合物，其中所述癌症是选自以下的至少一种：乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、胃癌、皮肤癌、头颈癌、肺癌、成胶质细胞瘤、口腔癌、垂体腺瘤、胶质瘤、脑肿瘤、咽癌、喉癌、胸腺瘤、间皮瘤、食管癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、胰腺内分泌肿瘤、胆囊癌、阴茎癌、输尿管癌、肾细胞癌、膀胱癌、非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓增生异常综合
征、多发性骨髓瘤、浆细胞肿瘤、白血病、儿童癌症、支气管癌、结肠和卵巢癌。14.根据权利要求11的疫苗组合物，其进一步包含选自疫苗佐剂、免疫检查点抑制剂和它们的组合的至少一种。15.根据权利要求14的疫苗组合物，其中所述疫苗佐剂是选自以下的至少一种：1018iss、铝盐、amplivax、as15、bcg、cp-870,893、cpg odn、cpg7909、sia、dslim、gm-csf、ic30、ic31、lmiquimod、imufact imp321、is patch、iscomatrix、juvimmune、lipovac、mf59、单磷酰脂a、montanide ims 1312、montanide isa 206、montanide isa 50v、montanide isa-51、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、peptel载体系统、plg微粒、瑞喹莫德、srl172、病毒体和其他病毒样颗粒、yf-17dbcg、aquila的qs21刺激子、ribi的detox.quil、superfos、freund's、gm-csf、霍乱毒素、免疫佐剂、mf59和细胞因子。16.根据权利要求14的疫苗组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是选自以下的至少一种：程序性细胞死亡-1(pd-1)拮抗剂、程序性细胞死亡-配体1(pd-l1)拮抗剂、程序性细胞死亡-配体2(pd-l2)拮抗剂、分化簇27(cd27)拮抗剂、分化簇28(cd28)拮抗剂、分化簇70(cd70)拮抗剂、分化簇80(cd80)拮抗剂、分化簇86(cd86)拮抗剂、分化簇137(cd137)拮抗剂、分化簇276(cd276)拮抗剂、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)拮抗剂、淋巴细胞活化基因3(lag3)拮抗剂、肿瘤坏死因子受体超家族成员4(tnfrsf4)拮抗剂、糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白(gitr)拮抗剂、糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白配体(gitrl)拮抗剂、4-1bb配体(4-1bbl)拮抗剂、溶细胞性t淋巴细胞相关抗原-4(ctla-4)拮抗剂、腺苷a2a受体(a2ar)拮抗剂、含v-set结构域的t细胞活化抑制剂1(vtcn1)拮抗剂、b-和t-淋巴细胞衰减子(btla)拮抗剂、吲哚胺2,3-双加氧酶(ido)拮抗剂、t-细胞免疫球蛋白结构域及粘蛋白结构域(3tim-3)拮抗剂、t细胞活化v结构域ig抑制因子(vista)拮抗剂和杀伤细胞凝集素样受体亚家族a(klra)拮抗剂，cd80也称为b7-1，cd86也称为b7-2，tnfrsf4也称为cd134。17.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，包含选自以下(i)至(iv)的至少一种：(i)权利要求1的肽，(ii)编码(i)的肽的多核苷酸；(iii)包含(ii)的多核苷酸的载体，和(iv)由(iii)的载体转化的宿主细胞。18.选自以下(i)至(iv)中的至少一种用于制备用于治疗癌症的药剂的用途：(i)权利要求1的肽，(ii)编码(i)的肽的多核苷酸；(iii)包含(ii)的多核苷酸的载体，和(iv)由(iii)的载体转化的宿主细胞。19.一种用于治疗癌症的方法，包括向有需要的对象施用有效量的组合物，所述组合物包含选自以下(i)至(iv)中的至少一种：(i)权利要求1的肽，(ii)编码(i)的肽的多核苷酸；(iii)包含(ii)的多核苷酸的载体，和(iv)由(iii)的载体转化的宿主细胞。

技术总结
本发明涉及表现出免疫增强活性的新的片段化CRS肽及其用途，更具体地，涉及由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的新的肽、及其作为疫苗佐剂和癌症治疗剂的用途。本发明公开的肽是本说明书中首次公开的CRS片段，并且表现出抗癌活性和免疫增强活性。活性和免疫增强活性。活性和免疫增强活性。


技术研发人员：金圣勋 金相范 赵诚敏 宋伊灿
受保护的技术使用者：塞梅蒂股份有限公司
技术研发日：2021.12.10
技术公布日：2023/10/5