风味修饰蛋白和包含该蛋白的食物产品的制作方法

1.本发明涉及风味修饰蛋白以及包含该蛋白的制剂和食物产品。风味修饰蛋白可以各种制剂提供，用于动物饲料和人类食用。


背景技术：

2.糖替代物正受到越来越多的关注，这是由于糖过量摄入作为代谢综合征的潜在原因导致了疾病意识的增强。代谢综合征的已知表现是糖尿病、肥胖症、蛀牙、若干类型的癌症和许多附加的疾病。食物和饮料行业正面临着生产更健康、低热量食物的挑战，以满足消费者和公共政策官员的需求。作为其中的一部分，许多国家正在实施糖税和警告标签。
3.食物行业面临的挑战是，在提供成功产品所必需的味道的同时，使你的食物和饮料更天然，更适合消费者趋势。低热量甜味剂成分针对寻求降低其饮食中热量和糖水平的消费者具有扩展选项，但这些成分受到味道、稳定性和灵活性的限制。
4.全球迫切需要具有最佳感官性状和良好稳定性的食物产品和饮料产品的健康增甜替代物，以在全球市场上成功竞争。人造高强度甜味剂(his)，诸如糖精、阿斯巴甜、环磺酸盐、安赛蜜、三氯蔗糖、纽甜和申糖精在世界范围内被用作低热量甜味剂，用于患有糖相关疾病的患者，诸如糖尿病、血脂过多、代谢综合征等。his具有各种副作用，例如，这些零热量甜味剂据报道与微生物相互作用，并导致肥胖症和前驱糖尿病病症(suez等人，2014，nature，第514卷，第181-186页)，即使程度不如糖。美国心脏协会发表了针对his的建议，声称“a dearth of evidence for adverse health effects”(johnson等人，2018，circulation，第138卷，no.9)。在此建议中，所有his、天然的(甜菊糖苷和僧果)和人造的，都被置于同样的审查之下。此外，低强度甜味剂(lis)，即稀有糖和多元醇(例如，木糖醇、甘露醇、阿洛糖等)，与高成本相关联，并且不能被人体完全消化，限制了其使用，以避免腹胀、腹泻和其他不利的胃肠作用。因此，当前不存在实现显著(》30％)的糖含量降低的良好的糖替代物，并完全解决味道、健康、成本和产品适应度。
5.甜蛋白(sp)有可能通过提供天然、可口、无血糖生成指数的低热量甜味剂来取代his，因为蛋白不像蔗糖那样诱导胰岛素反应(weihrauch2001和cohen 2001)。sp存在于异国水果中，并且比糖甜700倍-3,000倍。这些健康的甜味剂像糖一样与甜味受体结合，但作为蛋白被消化。期望它们的血糖指数为零，热量约为0，并且对我们的健康或微生物组无不利影响。非洲甜果素是当前市场上唯一的全球认可的甜蛋白。由于高价格、有限的供应和未达最佳的感官性状，sp通常不被用作显著的(》30％)降糖解决方案。除非洲甜果素之外，sp尚未进入大众食物市场，这是由于费用高、有限的供应、低稳定性、短货架期(尤其是在脂肪环境中)以及口感不佳。因此，需要开发组合物和制剂来克服上述问题中的一者或多者。
6.gb2123672描述了在各种饮料、漱口水中或作为药物基质的甜蛋白，诸如非洲甜果素和莫奈林，以及掺入的弱酸性多糖胶，任选地与食用酸或增量剂一起。
7.wo8402450描述了将非洲甜果素或莫奈林应用于包含胶基、甜味剂和调味剂的口香糖组合物的表面。
8.wo2019215730公开了具有改善的食物相关特性的经修饰的蛋白。


技术实现要素：

9.根据一些方面，本公开提供了一种经修饰版本的单链莫奈林(mnei)蛋白，包含来自mnei参考蛋白的具有两个或更多个氨基酸缺失、插入、替换或它们的任何组合的氨基酸序列，其中该经修饰的mnei蛋白与所述参考mnei蛋白相比具有至少一种改善的食物相关特性。
10.根据一些其他方面，本公开提供了一种食物产品，包含经修饰的单链莫奈林(mnei)蛋白，包含来自mnei参考蛋白的具有两个或更多个氨基酸缺失、插入、替换或它们的任何组合的氨基酸序列，其中该经修饰的mnei蛋白与该参考mnei蛋白相比具有至少一种改善的食物相关特性。根据一些实施方案，经修饰的蛋白包含来自参考mnei蛋白的至少三个氨基酸缺失、插入、替换或它们的任何组合。
11.根据一些实施方案，该两个或更多个氨基酸缺失、插入、替换或它们的任何组合位于该参考mnei蛋白的表面上或该参考mnei蛋白的核心中。根据一些实施方案，该两个或更多个氨基酸缺失、插入、替换或它们的任何组合位于经修饰的mnei环(也称为“连接子区”)和β链边缘内。根据一些实施方案，该两个或更多个氨基酸缺失、插入、替换或它们的任何组合位于跨越残基46-56的经修饰的mnei环和β链边缘内。
12.根据一些实施方案，所述氨基酸缺失、取代、替换、接枝或它们的任何组合通过以下中的至少一者来稳定环区：(i)添加至少一个氢键，(ii)延伸保持该环区的β链，(iii)降低该环区处的相对德拜-沃勒因子，或(iv)它们的任何组合。根据一些实施方案，所述稳定与以下中的至少一者相关联：(i)减少聚集，(ii)增加熔点温度，(iii)增加货架期稳定性，或(iv)它们的任何组合。
13.根据一些实施方案，该经修饰的mnei蛋白具有低于以罗塞塔能量单位(reu)给出的-182的能量。
14.根据一些实施方案，该至少一种食物相关特性为甜味效能、甜味动力学、掩蔽效应、增强味道和变味或它们的任何组合中的至少一者。根据一些实施方案，与该参考mnei蛋白相比该经修饰的mnei蛋白具有至少1.5倍增加的甜味效能。
15.根据一些实施方案，与该参考mnei蛋白相比，该经修饰的mnei蛋白具有以下特征中的至少一者：(1)增加的热稳定性，(2)增加的ph稳定性，(3)增加的溶解度，(4)减少的与疏水区的结合，(5)高压稳定性，(6)增加的货架期稳定性以及它们的任何组合。
16.根据一些实施方案，该经修饰的mnei蛋白包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20和seq id no:21、或其片段或变体。
17.根据一些实施方案，该参考mnei蛋白具有seq id no:45中列出的序列。
18.根据一些实施方案，该经修饰的mnei蛋白或其任何组合用于制备用于口服递送的产品。
19.根据一些实施方案，该产品为食物产品、食物补充产品或药物。
20.根据一些实施方案，该经修饰的mnei蛋白或其任何组合被用作风味修饰剂或风味增强剂。
21.根据一些实施方案，该经修饰的mnei蛋白被用作甜味剂。
22.根据一些方面，本公开提供了一种包含本发明的经修饰的蛋白的食物产品。
23.根据一些实施方案，该食物产品包含至少一种食物成分。根据一些实施方案，该食物成分是人造风味剂、食品添加剂、食物着色剂、防腐剂或糖添加剂中的至少一者。根据一些实施方案，该食物成分选自由以下各项组成的组：甜叶菊、蔗糖、龙舌兰蜜、糙米糖浆、枣糖、蜂蜜、枫糖浆、糖蜜、僧果、糖醇、稀有糖、阿斯巴甜、三氯蔗糖、乙酰磺胺酸钾、糖精、纽甜、申糖精和膳食纤维。
24.根据一些实施方案，所述甜叶菊是莱苞迪甙或甜菊糖苷。根据一些实施方案，所述莱苞迪甙是rebm。
25.根据一些实施方案，在rebm和本发明的该经修饰的mnei蛋白之间存在协同作用。
26.根据一些方面，本公开提供了一种包含本发明的经修饰的mnei蛋白的增甜组合物。根据一些实施方案，本公开提供了一种包含所述增甜组合物的
27.可摄取组合物。根据一些实施方案，该可摄取组合物具有低血糖效应，并且呈液体食料或固体食料的形式。
28.根据一些方面，本发明提供了具有改善的食物或饮料相关特性的特定食物和饮料制剂。
29.根据一些方面，本公开提供了一种包含在每100gr或100ml约0.2mg至约30mg的范围内的一种或多种经修饰的单链莫奈林(mnei)蛋白的食物或饮料制剂。根据一些实施方案，该范围为每100gr或100ml约0.4mg至约10mg。
30.根据一些实施方案，所述制剂具有在约2至约8.5范围内的ph。
31.根据一些实施方案，所述经修饰的mnei蛋白包含与参考mnei蛋白具有40％至99％同一性的氨基酸序列，该参考mnei蛋白包含seq id no:45中提及的氨基酸序列。
32.根据一些实施方案，该经修饰的mnei蛋白包含选自由seq id no:l-27或其片段或变体组成的组的氨基酸序列。
33.根据一些实施方案，该经修饰的mnei蛋白是可消化的蛋白。
34.根据一些方面，本发明提供了一种经调配以供人类受检者消费的食物或饮料组合物，该组合物包含所述制剂。
35.根据一些实施方案，该饮料组合物选自由以下各项组成的组：碳酸软饮料、非碳酸软饮料、喷泉饮料、冷冻即饮饮料、咖啡饮料、茶饮料、乳制饮料、水果饮料、加味水、强化水、运动饮料、能量饮料、等渗饮料、低热量饮料和酒精饮料。
36.根据一些实施方案，该食物组合物选自由以下各项组成的组：烘焙食品、曲奇饼、饼干、烘焙混合物、谷物、甜食、软糖、太妃糖、口香糖、泡泡糖、乳制品、酸奶、调味酸奶、酱油和其他大豆基产品、非乳制品、沙拉酱、番茄酱、蛋黄酱、醋、冷冻甜点、肉制品、鱼产品、瓶装食物和罐装食物、桌面甜味剂、巧克力、水果、干果和蔬菜。
37.根据一些实施方案，与具有该参考mnei蛋白的食物或饮料组合物相比，所述组合物具有至少一种改善的食物或饮料相关特性。
38.根据一些实施方案，该至少一种改善的食物或饮料相关特性选自由以下各项组成
的组：改善的甜味特征、缩短的甜味余味、改善的甜味效能、改善的甜味动力学、增加的热稳定性、高压稳定性、增加的ph稳定性、减少的与疏水区的结合、改善的冻-融稳定性、改善的干燥后可重构性、增加的溶解度、更接近糖的感官性状和增加的货架期稳定性。
39.根据一些实施方案，该食物或饮料组合物包含至少一种附加的食物成分。
40.根据一些实施方案，该食物成分是风味剂、食品添加剂、食物着色剂、防腐剂或甜味增强剂中的至少一者。
41.根据一些实施方案，该食物成分选自由以下各项组成的组：甜叶菊、蔗糖、龙舌兰蜜、糙米糖浆、枣糖、蜂蜜、枫糖浆、糖蜜、甜菊糖苷、僧果、糖醇、稀有糖、阿斯巴甜、三氯蔗糖、乙酰磺胺酸钾、糖精、纽甜、申糖精和膳食纤维。
42.根据一些实施方案，该稀有糖是阿洛糖或塔格糖。
43.根据一些实施方案，该食物或饮料组合物具有低血糖效应。
44.根据一些实施方案，该碳酸软饮料选自由以下各项组成的组：可乐、柠檬-酸橙风味的起泡饮料、橙子风味的起泡饮料、葡萄柚风味的起泡饮料、葡萄风味的起泡饮料、覆盆子风味的起泡饮料、草莓风味的起泡饮料、菠萝风味的起泡饮料、姜汁汽水、根啤酒和麦芽饮料。
45.根据一些实施方案，该非碳酸软饮料选自由以下各项组成的组：果汁、水果风味果汁、果汁饮料、花蜜、蔬菜汁、蔬菜风味果汁、运动饮料、能量饮料、蛋白饮料、含维生素的强化水、近水饮料、椰子汁、茶、咖啡、可可饮料、含牛奶组分的饮料、含谷物提取物的饮料和冰沙。
46.根据一些实施方案，该制剂用于制备用于口服递送的产品。
47.根据一些实施方案，该产品是食物或饮料产品、膳食补充产品或药物。
48.根据一些方面，本公开提供了一种包含本发明制剂的食物或饮料产品。
49.根据一些方面，本公开提供了一种包含所述制剂的减糖或无糖添加的软饮料。
50.根据一些方面，本公开提供了一种包含所述制剂的减糖或无糖添加的乳制品。根据一些实施方案，所述乳制品是酸奶或马拉比。
51.根据一些方面，本公开提供了一种包含所述制剂的减糖或无糖添加的酱产品。根据一些实施方案，所述酱产品是番茄酱。
52.根据一些方面，本公开提供了一种包含所述制剂的减糖或无糖添加的干果。根据一些实施方案，所述干果选自由以下各项组成的组：蔓越莓、葡萄干、蓝莓、李子、樱桃、苹果、菠萝、西瓜、哈密瓜、无花果、香蕉、枣、黑醋栗和杏。根据一些实施方案，所述干果是干无花果。
53.根据一些方面，本公开提供了一种包含所述制剂的减糖或无糖添加的口香糖产品。根据一些实施方案，所述口香糖产品是口香糖或泡泡糖产品。
54.根据一些方面，本公开提供了一种包含所述制剂的减糖或无糖添加的涂抹产品。根据一些实施方案，所述涂抹产品是花生酱。
55.根据一些方面，本公开提供了一种包含所述制剂的减糖或无糖添加的糖浆产品。
附图说明
56.为了更好地理解本文所公开的主题并且举例说明如何在实践中实施该主题，现在
将参考附图仅通过非限制性实施例来描述实施方案，在附图中：
57.图1是示出mnei和mnei经修饰的蛋白的相对甜味的柱状图，基于1:4000的效能，在6
°
bx下，相对于dm09，在水中稀释，评估甜味。
58.图2a至图2d是示出mnei(图2a)、dm13(图2b)、dm28(图2c)和dm31(图2d)的甜味强度的剂量-应答的图。
59.图3是示出加热至90℃达10分钟后dm13在柠檬酸盐缓冲液中的稳定性的柱状图。y轴是甜味强度。
60.图4是示出加热至95℃达30秒后dm13在柠檬酸盐缓冲液中的稳定性的柱状图。y轴是甜味强度。
61.图5a至图5b是示出dm13在21℃和32℃下储存8周后的稳定性的柱状图。y轴是甜味强度。
62.图6是示出添加的糖69％减少的对照番茄酱原型和具有dm09的示例性番茄酱的特性的蜘蛛图，结果示出与具有dm09的番茄酱相比，对照番茄酱不太甜、更酸、更咸，并且具有更大的舌头麻刺感。
63.图7是示出添加的糖69％减少的番茄酱原型与具有全糖的番茄酱相比不太甜、更酸并且具有更浅的颜色的蜘蛛图。
64.图8是示出具有dm09(添加的糖69％减少)的番茄酱原型具有与全糖番茄酱非常类似的感官性状的蜘蛛图。
65.图9是示出具有dm28的番茄酱与具有dm09的番茄酱相比具有类似的感官性状的蜘蛛图。
66.图10是示出在一个月的货架期后，具有dm09的番茄酱没有失去其甜味的蜘蛛图。对于货架期为1个月的番茄酱来说，产品发生的变化是典型的(颜色更深，更调味，更酸，更浓稠，并且质地更不光滑)。
67.图11是示出具有添加的糖33％减少的原味酸奶比添加具有dm09和添加的糖33％减少的原味酸奶更不甜的蜘蛛图。
68.图12是示出具有dm09(添加的糖33％减少)的原味酸奶具有与全糖酸奶类似的感官性状的蜘蛛图。
69.图13是示出具有dm28的草莓酸奶具有与具有dm09的草莓酸奶类似的感官性状的蜘蛛图。
70.图14是示出在两周的货架期后，具有dm09的酸奶具有与具有dm09的新鲜原味酸奶类似的感官性状蜘蛛图。
71.图15是示出在相同的甜味水平当量下，具有甜叶菊和dm09的水溶液比单独具有甜叶菊的水溶液更甜的蜘蛛图。
72.图16是示出在相同的甜味水平当量下，与单独具有僧果和甜叶菊的水溶液相比，具有僧果、甜叶菊和dm09的组合的水溶液更甜，具有更短的“晚发型”的蜘蛛图。
73.图17是示出柠檬风味的饮料(用甜叶菊使糖减少50％，5
°
bx当量)具有与甜叶菊和dm09(各自2.5
°
bx当量)非常类似的感官性状的蜘蛛图。
74.图18是示出具有dm031的番茄酱(添加的糖69％减少)与具有dm09的番茄酱具有非常类似的感官性状的蜘蛛图。
75.图19是示出具有dm31的草莓酸奶具有与具有dm09的草莓酸奶类似的感官性状的蜘蛛图。
76.图20是示出咀嚼30秒后具有dm09的口香糖比不不具有dm09的口香糖更甜的蜘蛛图。
77.图21是示出具有dm09和50％糖减少的花生酱具有与全糖花生酱类似的感官性状的蜘蛛图。
78.图22是示出具有dm09(70％糖减少)的冰咖啡比不具有dm09(70％糖减少)的冰咖啡更甜的蜘蛛图。
79.图23是示出蔓越莓汁(40％糖减少、甜叶菊和dm09)具有与全糖蔓越莓汁类似的感官性状的蜘蛛图。
80.图24是示出具有dm28的蔓越莓汁比具有dm09的蔓越莓汁更甜的蜘蛛图。
81.图25是示出具有40％糖减少、甜叶菊和dm31的蔓越莓汁与具有40％糖减少、甜叶菊和dm09的蔓越莓汁具有类似的感官性状的蜘蛛图。
82.图26是示出蔓越莓干(50％糖减少和dm09)比不具有dm09(50％糖减少)的蔓越莓干更甜的蜘蛛图。
83.图27是示出具有dm09的桃皮比不具有dm09的桃皮更甜的蜘蛛图。
84.图28是示出具有40％添加的糖减少+dm09和甜叶菊的绿色冰茶比不具有dm09和甜叶菊的具有40％添加的糖减少的绿色冰茶更甜的蜘蛛图。
85.图29是示出具有50％添加的糖减少+dm31的马拉比与具有50％添加的糖减少但不具有dm31的马拉比相比更甜的蜘蛛图。
86.图30a至图30b是突显了dm31中的变化的晶体结构图像。图30a示出了dm31(黑色)的晶体结构与mnei(pdb id:2o9u)(白色)的晶体结构的比对。图30a中较小的图放大了dm31中所选择的氨基酸变化，以及重新设计的环。重新设计的环导致了增加的稳定性，以及新的氢键和附近的两条伸长的β链(图30a，最右下方的图)。图30b示出了dm31的相同环区与公共数据库中可用的附加的mnei结构的叠加。dm31用黑色标记。
87.图31a至图31b是示出几个mnei结构(2o9u、liv7、5zlp)、dm09和dm31的归一化b因子的柱状图。首先使用z分数归一化法对每个结构的主链b因子分别进行归一化。b因子示出为不同二级结构元件的平均值(图31a)，以及作为重新设计的环区一部分的特定残基(e48至e54，根据mnei序列编号)(图31b)。
88.图32a至图32c示出了稳定mnei(图32a)、dm09(图32b)和dm31(图32c)的晶体结构中的氢键。重新设计的环区用黑色边框高亮显示。
89.图33a至图33b示出了与β-转角的经典定义(图33b)相比较，dm31(图33a)上的晶体结构中的环区。dm31的环结构(图33a)与图33b所示的示意定义相匹配。
90.图34a至图34b是16％ sds page麦黄酮蛋白凝胶和考马斯蓝染色的图像，是1ug体外消化样品在消化前(to)、口服阶段结束时(3分钟，m)、胃消化阶段结束时(2小时，g)和肠十二指肠阶段结束时(2小时，d)的图像，图34b示出了用作阳性对照的α-乳清蛋白的图像，m、g和d如结合图34a所详述的。
具体实施方式
91.人造低热量甜味剂在市场上很容易买到，但许多都具有显著的副作用。例如，糖精，广泛用于使食物和饮料变甜而不增加热量或碳水化合物，已经与癌症，诸如膀胱癌有关。因此，显著需要替换当前可用的人造低热量甜味剂，其将提供最佳的感官性状，并且适用于食物产品和饮料两者。
92.本公开涉及基于mnei的甜味蛋白和mnei味道修饰蛋白，并且基于对相对于已知甜味剂表现出改善的特性的蛋白的识别。通过优化方法，例如各种计算方法，识别此类蛋白。
93.令人惊讶的是，本发明人已经发现，在mnei(在本文中表示为“参考蛋白”)的氨基酸序列中引入各种特定的缺失或取代，导致了与参考mnei蛋白相比具有至少一种改善的特性的蛋白。这表明蛋白的至少一种改善的特性对经修饰的mnei蛋白在食物应用和饮料应用中的适应度和用途来说可能是很重要的。
94.具体地，如以下实施例所示，如与它们的参考蛋白相比，蛋白(在本文中表示为“经修饰的蛋白”或“设计蛋白”)表现出改善的感官性状和/或稳定性。如本文所述，感官性状涉及味道特征(例如，甜味效能、后味和余味)。
95.因此，在其最广泛的方面，本公开涉及经修饰的mnei蛋白，包含如与参考mnei蛋白的序列相比具有至少两个氨基酸缺失、替换(取代)和/或插入的氨基酸序列，其中如与参考mnei蛋白相比，经修饰的蛋白具有至少一种改善的食物相关特性。
96.至少一种改善的食物相关特性涵盖增加经修饰的蛋白在食物应用和饮料应用中的适应度的特性，诸如风味、质地、味道、甜味阈值、甜味水平、甜味特征、感官性状、甜味动力学、稳定性(结构和功能)、耐热性、对食品基质的适应度、货架期、对其他风味的掩蔽和/或增强、变味、味道起效、余味、味道圆度或糖样味道。
97.在一些实施方案中，至少一种食物相关特性是影响感官的特性。如本文所用的术语“适当地影响感官”是指由例如味道确定的感官印象的变化。影响感官的特性包括，例如，甜味特征，诸如甜味效能(糖样风味)、甜味动力学(起效时间、余味时间、味道持续时间)、缺少变味(例如，金属味道)，以及掩蔽或增强其他味道。例如，改善的特性与增加的甜味、减少的起效时间或减少的余味有关。
98.根据一些实施方案，其中至少一种特性是影响感官的特性，经修饰的蛋白可被视为糖替代物。在一些实施方案中，至少一种食物相关特性是甜味效能、减少的起效时间或减少的余味中的至少一者。
99.在一些实施方案中，至少一种食物相关特性是稳定性。在一些实施方案中，稳定性是热稳定性、更长的货架期、对低ph值的稳定性、盐浓度稳定性、离子强度稳定性或在含脂肪或含蛋白的基质中的稳定性中的至少一者。在一些实施方案中，至少一种食物相关特性是热稳定性。
100.在一些实施方案中，至少一种食物相关特性是增加的货架期稳定性。例如，经修饰的蛋白可稳定至少一周、两周、一个月，并且甚至一年以上。
101.通过差示扫描量热法、差示扫描荧光测定法、圆二色性和感官分析来品尝货架期稳定性。在一些实施方案中，食物味道被保持，并且蛋白是完整的。
102.如上所述，经修饰的mnei蛋白可与至少一种附加的食物成分结合使用。在一些实施方案中，至少一种食物相关特性可指经修饰的mnei蛋白和至少一种食物成分之间的协同
效应。根据一些实施方案，所述协同效应可影响味道增强、味道阻断或味道修饰。食品成分的非限制性实施例包括人造风味剂或天然风味剂、食物添加剂、食物着色剂、防腐剂、增量剂或附加的糖添加剂。食物成分可具有掩蔽或增强味道的效果。
103.如本文所述，参考蛋白是味道修饰蛋白和/或味道增强蛋白和/或味道蛋白，并且具体地是甜蛋白。味道修饰蛋白改善了感官性状，例如，可给非甜味物质，例如水和酸味物质增加甜味。如本文所用，已知有味道的蛋白结合味道受体并诱发味觉。如本文所用，已知甜味蛋白结合甜味受体并诱发甜味感觉。甜味受体的非限制性实施例包括由两个亚单元构成的味道受体异型二聚，诸如1型成员1(tas1r1，uniprot id，人类基因：ts1r1人类)、味道受体1型成员2(tas1r2，t1r2，tr2，uniprot-q8te23)、味道受体1型成员3(tas1r3，t1r3，uniprot-q7rtx0)。
104.在一些实施方案中，参考蛋白是天然存在的蛋白。在一些其他实施方案中，参考蛋白存在于植物中，诸如热带植物。植物的非限制性实施例包括马槟榔、欧布利山柑、奇遇果、卡特莫夫果、神秘果或伦巴中的至少一者。
105.在一些实施方案中，参考蛋白是莫奈林。
106.在一些实施方案中，参考蛋白是由链a(genbank登录号p02881)和链b(genbank登录号p02882)组成的莫奈林。
107.在一些实施方案中，参考蛋白是mnei。
108.野生型莫奈林和mnei之间的主要区别是一个区域，其中gly-phe二肽用于将两个亚单元连接成称为mnei的单链莫奈林。
109.在一些实施方案中，参考蛋白是自然界中未发现的序列，并且因此被称为合成蛋白、工程蛋白或设计蛋白。合成蛋白可包含天然存在的蛋白的氨基酸序列的全部或一部分(蛋白多肽链的全部或一部分)或其部分。例如，参考蛋白可包含天然存在的蛋白的键修饰，导致对应于天然存在的蛋白的单个多肽链，使得野生型蛋白的至少两个多肽链通过其他氨基酸共价地连接。
110.在一些实施方案中，参考蛋白是被称为mnei的经修饰的莫奈林蛋白。
111.在一些实施方案中，参考蛋白是单链莫奈林(mnei)蛋白(seq id no:45)。本文提到的mnei氨基酸编号与蛋白数据库(pdb)id 2o9u一致。
112.本文所述的经修饰的蛋白可通过各种方法设计。
113.在一些实施方案中，使用计算工具或通过专家蛋白设计和结构生物学方法，例如定点诱变、蛋白工程或定向进化来完成蛋白设计，如下文另外描述的。发明人已经开发了基于参考风味蛋白和在序列和/或结构特征上与参考风味蛋白具有局部相似性或全局相似性的其他蛋白的序列数据、结构数据和/或进化数据的计算方法。本文开发和应用的计算方法使得发明人能够设计具有特定氨基酸取代的蛋白，这些取代在很大程度上是有利的，并因此被预测具有改善的性状，诸如热稳定性、盐稳定性、ph稳定性、货架期、折叠和溶解性特征。具体地，将计算蛋白设计(cpd)应用于参考蛋白结构和/或序列内的特定位点或区，这些位点或区对于与受体的功能结合不是必需的。此外，cpd允许发明人将取代限制到符合所需改善的特征的预定氨基酸组。预定氨基酸组既存在于输入数据中，即蛋白经受cpd的区，又存在于输出数据中，即所得的经修饰的蛋白中存在的氨基酸的位置和类型。
114.例如，通过使用cpd，有可能用“理想”氨基酸(诸如在外部表面区中的亲水性氨基
酸和在疏水性核心内的疏水性氨基酸)替换“非理想”氨基酸(诸如在疏水性核心内的亲水性氨基酸或在外部表面区上的疏水性氨基酸)。
115.不受理论的约束，发明人表明在外部表面区用亲水性氨基酸取代疏水性氨基酸将减少与口腔的非特异性结合并减少残留的后味。
116.本文开发的方法包括寻找“稳定取代”，例如，将降低蛋白结构总能量的氨基酸取代。总能量可通过应用本领域已知的算法来计算。此类算法的非限制性实施例包括罗塞塔，osprey(m.hallen，j.martin等人，journal of computational chemistry 2018；39(30):2494-2507)，或encom(frappier v，chartier m，najmanovich rj，nucleic acids res.，2o15；43(w1):w395-400)。这些cpd方法通过一系列正交方法进行聚焦和过滤，诸如进化序列和结构共有、常规和高温分子动力学(md)和其他动态模拟、相关突变分析(cma)、表面静电分析、目视检查，以及空腔、疏水性斑块、未满足的氢键等的分析。
117.氨基酸取代基于以下考虑：(a)表面静电势和(缺少)表面疏水性斑块，(b)蛋白等电点(pl)在特定范围内的保留，(c)蛋白内部腔的分析，(d)动态稳定性，包括相关突变分析、正常模式分析和高温动力学或室温动力学中的均方根波动(rmsf)，(e)取代能量学的熵分量和/或焓分量，(f)特定取代的可视化，(g)相关蛋白家族中允许的氨基酸类型；如规划后多重序列比对(msa)的进化保守性分析所反映的，以及(h)低伪能量cpd计算中所反映的取代频率。
118.计算方法包括以下步骤中的一者或多者：
119.(1)多重序列比对(msa)或多重结构比对。在此步骤中，在公共数据库中查询与目标参考蛋白或其片段相似的dna序列和/或蛋白序列。基于所获得的结果，构建多重序列比对(msa)或多重结构比对，并计算保守率。根据msa结果，对关于要进行cpd的级别作出决定。在非保守位置，cpd中允许所有氨基酸(具有或不具有半胱氨酸)，而对于更保守的位置，cpd限于具有类似特性(电荷、大小、内部动力学等)的残基。此步骤涉及根据生物物理知识和保守数据限制每个位置的取代。msa可产生位置特异性取代矩阵(pssm)，其中沿序列的每个位置以与每个氨基酸的相对丰度相关的方式描述，可能考虑了氨基酸取代或缺失或插入的潜在可能性。
120.(2)蛋白功能分析和结构-功能-动力学关系分析。在此步骤中，具有已知影响(诸如对活性、结构、结合等)的取代的数据库是使用先验知识构建的。基于先验知识，已知干扰蛋白稳定性和/或功能的取代位置和取代-邻近位置(例如，0.5nm-1nm的距离)在cpd期间受到限制，并且不被取代。
121.(3)cpd。此步骤部分地由指定软件，诸如rosetta、osprey、scwrl、pymol、alphafold等完成。在进行确定性cpd之前，参考蛋白3d结构/模型被最小化能量。cpd可包括定点氨基酸替换，其中一个氨基酸被另一个氨基酸替换，或蛋白区被其他氨基酸序列替换，从而产生具有不同长度的蛋白。后者可通过从头计算方法重建区，诸如环或从其他蛋白中取出区来完成，方法可被称为“接枝”。对于每种参考蛋白，考虑多个模型。
122.(4)选择：收集具有最低能量的蛋白模型。在这些模型上组装msa，并确定保守序列。基于生物化学和生物物理学的先验知识，选择取代的子集。这些子集表示在cpd期间以高频率出现的一个或多个位置的替换。然后，每个子集在蛋白的3d结构上建模，并使能量最小化。然后选择最低能量子集用于另外计算和实验验证。
123.在cpd中使用的考虑因素中的一个考虑因素是受体结合位点以及是否在结合区及其附近取代氨基酸。确定对味道受体结合至关重要的氨基酸残基通常可通过各种氨基酸的单点取代来完成。如此处实施例中所详述的，发明人已经使用计算分析来表征味道受体的推定结合位点。发明人已经在味道受体中识别了若干新型结合位点，其与参考蛋白和经修饰的蛋白结合。
124.cpd中的另一个考虑因素是保留与受体结合所需的功能可塑性，同时增加热稳定性，这在本质上通常与蛋白硬化相关联。为了激活受体，蛋白必须经历一些构象变化(也被称为“功能可塑性”)。因此，发明人集中于可硬化的区，同时保留必须保持功能可塑性的区。
125.经修饰的mnei蛋白基于参考mnei蛋白(氨基酸序列)，并且如此，应当指出的是，本文所述的关于经修饰的mnei蛋白的任何特征/特性/表征都是相对于参考对应的mnei蛋白提供的。
126.如本文所述，经修饰的mnei蛋白包含相对于参考mnei蛋白(参考氨基酸序列)具有至少两个氨基酸取代、缺失或插入、至少三个氨基酸取代、缺失或插入、至少四个氨基酸取代、缺失或插入、至少五个氨基酸取代、缺失或插入、至少六个氨基酸取代、缺失或插入、至少十个氨基酸取代、缺失或插入、至少十五个氨基酸取代、缺失或插入或至少十八个氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列。
127.在一些实施方案中，相对于参考mnei蛋白(参考氨基酸序列)，经修饰的mnei蛋白包含介于两个氨基酸取代、缺失或插入和二十个氨基酸取代、缺失或插入之间，介于两个氨基酸取代和十个氨基酸取代之间，介于三个氨基酸取代和十个氨基酸取代之间，介于三个氨基酸取代和六个氨基酸取代之间。本文使用的范围包括范围界限，使得例如，介于3和6之间包括3、4、5和6。
128.在一些实施方案中，相对于具有seq id no:45中所提及的序列的参考mnei蛋白，经修饰的mnei蛋白包含至少两个氨基酸取代、缺失或插入、至少三个氨基酸取代、缺失或插入、至少四个氨基酸取代、缺失或插入、至少五个氨基酸取代、缺失或插入、至少六个氨基酸取代、缺失或插入、至少十个氨基酸取代、缺失或插入、至少十五个氨基酸取代、缺失或插入或至少十八个氨基酸取代、缺失或插入。
129.在一些实施方案中，经修饰的mnei蛋白包含与参考mnei蛋白的氨基酸序列40％至98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的mnei蛋白包含与参考氨基酸序列90％至98％同一性的氨基酸序列。
130.在一些实施方案中，经修饰的mnei蛋白包含与参考氨基酸序列60％至90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的mnei蛋白包含与参考氨基酸序列70％至90％同一性的氨基酸序列。
131.在一些实施方案中，经修饰的mnei蛋白包含与seq id no:45中所提及的氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列。
132.在一些实施方案中，经修饰的mnei蛋白包含与seq id no:45中提及的氨基酸序列具有90％至98％同一性的氨基酸序列。
133.当两个或更多个序列进行比较和比对以获得最大对应性时，就确定了两个或更多个氨基酸序列之间的％同一性。在本公开的上下文中，本文所述的具有％同一性的序列(氨
基酸)被视为与计算同一性的参考序列具有相同的功能/活性。
134.在一些实施方案中，经修饰的mnei蛋白包含与参考mnei蛋白的氨基酸序列40％至98％类似的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的mnei蛋白包含与参考氨基酸序列90％至98％相似性的氨基酸序列。
135.在一些实施方案中，经修饰的mnei蛋白包含与参考氨基酸序列60％至90％相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的mnei蛋白包含与参考氨基酸序列70％至90％类似的氨基酸序列。
136.在一些实施方案中，经修饰的mnei蛋白包含与seq id no:45中所提及的氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相似性的氨基酸序列。
137.在一些实施方案中，经修饰的mnei蛋白包含与seq id no:45中所列举的氨基酸序列具有90％至98％相似性的氨基酸序列。
138.在一些实施方案中，经修饰的mnei蛋白包含seq id no:1-21中的一者中所列举的氨基酸序列、其变体或前述的片段。具体地，经修饰的mnei蛋白可包含seq id no:1、4、16、19或24中的一者中所列举的氨基酸序列、其变体或其片段。经修饰的mnei蛋白也可包含与seq id no:1-21中的一者，尤其是seq id no:1、4、16、19或24中的一者至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的序列。
139.如本文所用的序列相似性或序列同源性是指具有类似物理化学特性的保守氨基酸的量(％)，例如亮氨酸和异亮氨酸。
140.在确定序列同一性时，不计算间隙，并且序列同一性相对于两者中较短的序列。在此上下文中，应当指出的是，参考mnei蛋白(氨基酸序列)的长度可与经修饰的mnei蛋白(氨基酸序列)相同，或可与经修饰的mnei蛋白(氨基酸序列)不同。
141.术语“氨基酸序列”和/或“多肽链”用于描述具有氨基酸序列或多肽链的蛋白。因此，术语“参考蛋白”等同于术语“参考氨基酸序列”，术语“经修饰的蛋白”等同于术语“经修饰的氨基酸序列”。应当指出的是，术语“氨基酸序列”和/或“多肽链”涵盖具有3d结构的序列以及没有3d结构的序列。
142.如本文结合本公开使用的术语“片段”涉及源自全长蛋白的蛋白或肽，这些全长蛋白被缩短，即缺少至少一个氨基酸。此类片段可包括蛋白一级序列的至少10个连续氨基酸、更多个连续氨基酸，诸如20个连续氨基酸或30个连续氨基酸或更多个连续氨基酸。
143.本公开中使用的术语“变体”涉及蛋白或肽的衍生物，其包括氨基酸序列的修饰，例如通过取代、缺失、插入或化学修饰。在一些实施方案中，此类修饰不会降低蛋白或肽的功能性。此类变体包括蛋白，其中一个或多个氨基酸已经被其相应的d-立体异构体或除天然存在的20个氨基酸之外的氨基酸取代，诸如鸟氨酸、羟脯氨酸、瓜氨酸、高丝氨酸、羟赖氨酸和正缬氨酸。然而，此类取代也可以是保守的，即氨基酸残基被化学上类似的氨基酸残基替换。
144.作为计算优化过程的一部分，基于能量考虑，在计算、生物信息学或结构生物学分析后，经修饰的蛋白可从大量输出群体的氨基酸序列中选择，即那些具有低能量的序列。
145.能量计算可应用于整个氨基酸序列，或另选地限制于蛋白内的特定区或所选择的氨基酸。在后者中(不同的区或所选择的氨基酸)，可整合信息以测量整个蛋白。
146.氨基酸序列中的每一个氨基酸序列(例如，经修饰的蛋白)的计算可通过结合基于物理的(也被称为生物物理方法)和基于统计的势(也被称为基于知识的势或信息学方法)来完成，诸如通过使用罗塞塔能量单位(reu)。罗塞塔能量单位(reu)是罗塞塔软件的算法，该罗塞塔软件是用于计算建模和蛋白结构分析的算法包。罗塞塔软件实现了计算生物学的显著科学进步，包括从头蛋白设计、酶设计、配体对接以及生物大分子和大分子复合物的结构预测。罗塞塔能量函数是基于物理和统计的势的组合，与任何实际的物理能量单位都不匹配。罗塞塔能量是任意标度的，并且有时被称为reu(代表“罗塞塔能量单位”)。
147.在一些实施方案中，可计算包含至少一个氨基酸取代的完整蛋白序列的reu。在一些其他实施方案中，可计算包含完整蛋白序列的至少一个氨基酸取代的至少一个区的reu。在一些其他实施方案中，可计算完整蛋白序列中至少一个氨基酸取代的reu。
148.在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有低于以reu给出的-182的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有约以reu给出的-190的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有约以reu给出的-195的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有低于以reu给出的-195的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有低于以reu给出的-196的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有低于以reu给出的-197的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有低于以reu给出的-198的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有约以reu给出的-198的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有低于以reu给出的-198.4的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有低于以reu给出的-200的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有以reu给出的较低-203的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有低于以reu给出的-206.4的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有低于以reu给出的-210的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有低于以reu给出的-214.6的能量。
149.在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有低于以reu给出的-270.11的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有低于以reu给出的
‑‑
300的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有低于以reu给出的-350的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有低于以reu给出的-400的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有低于以reu给出的-410的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有低于以reu给出的-418的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有低于以reu给出的-420的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有低于以reu给出的-430的能量。在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有低于以reu给出的-433的能量。
150.在一些实施方案中，经修饰的蛋白具有介于以reu给出的-182至以reu给出的约-214.6之间的能量。在一些其他实施方案中，经修饰的蛋白具有介于以reu给出的-195至以reu给出的约-214.6之间的能量。在一些其他实施方案中，经修饰的蛋白具有介于以reu给出的-197至以reu给出的约-214.6之间的能量。
151.如本文所述，经修饰的蛋白可由蛋白不同区域的氨基酸取代或缺失产生。如本文所用的“蛋白区”是指氨基酸序列或结构基序，其是蛋白序列(氨基酸序列)或结构的一部分。蛋白区域的非限制性实施例包括蛋白表面、蛋白核心、蛋白环、二级结构元件、二级结构封盖、二硫键、结合位点、连接子、疏水性斑块或蛋白疏水区。
152.参考蛋白中的氨基酸取代不限于特定的蛋白区或序列。可包括氨基酸取代的参考蛋白区包括参考蛋白表面、疏水核心或称为环区的区(也表示为缺少二级结构的区)、二级
结构的边缘(也表示为二级结构封盖区)、二硫化物区、结合位点区、连接子区和疏水性斑块区。
153.如本文所用，“参考表面区”、“参考核心区”或“参考二硫键或环区”可指参考蛋白的对应区，其可以是参考mnei蛋白。
154.在一些实施方案中，参考蛋白可在参考蛋白结构和/或序列内的受限区内被取代。在一些实施方案中，参考蛋白可在表面区中被取代。在一些实施方案中，参考蛋白可在核心区中被取代。在一些实施方案中，参考蛋白可被二硫键取代。在一些实施方案中，参考蛋白可在环区中被取代。在一些实施方案中，两个或更多个氨基酸替换位于参考蛋白的表面上。
155.在一些实施方案中，参考蛋白可用不在参考蛋白与受体的预测或已知结合位点相邻的区域中的受限区取代。在此上下文中，“邻近”可意指距结合界面4-7a。
156.在一些实施方案中，参考蛋白可在参考蛋白结构和/或序列内的不同区被取代。在一些实施方案中，参考蛋白可至少在表面区、核心区、二硫键或环区或它们的任何组合中被取代。
157.如本文所用，蛋白表面区是具有部分或全部溶剂可及性的区域(sasa-溶剂可及性表面积)。如本文所用的蛋白核心区是氨基酸相对sasa(溶剂可及表面积)小于50％的溶剂不可及的区域，或对于内核而言，小于20％。
158.在一些实施方案中，经修饰的蛋白包含在表面区中相对于参考表面区具有10％到98％、20％到98％、30％到98％、40％到98％、50％到90％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
159.在一些实施方案中，经修饰的蛋白包含在疏水核心(疏水性斑块)区中相对于参考疏水核心(疏水性斑块)区具有10％至98％、20％至98％、30％至98％、40％至98％、50％至90％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
160.在一些实施方案中，经修饰的蛋白包含在疏水核心(疏水性斑块)区中相对于参考疏水核心(疏水性斑块)区具有10％至98％、20％至98％、30％至98％、40％至98％、50％至90％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％相似性的氨基酸序列。
161.在一些实施方案中，经修饰的蛋白包含在相对于参考表面区的表面区中具有三(3)个氨基酸取代至四十(40)个氨基酸取代、4个氨基酸取代至30个个氨基酸取代、5个氨基酸取代至30个氨基酸取代的氨基酸序列。
162.在一些实施方案中，修饰的蛋白包含在相对于参考表面区的表面区中具有至少一个(1)个氨基酸取代、两个(2)个氨基酸取代、三个(3)个氨基酸取代、至少4个氨基酸取代、至少5个氨基酸取代、至少6个氨基酸取代、至少10个氨基酸取代、至少15个氨基酸取代、至少18个氨基酸取代、至少20个氨基酸取代、至少25个氨基酸取代或至少30个氨基酸取代的氨基酸序列。
163.在一些实施方案中，经修饰的蛋白包含在核心区中相对于参考核心区具有20％、30％、50％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
164.在一些实施方案中，经修饰的蛋白包含在核心区中相对于参考氨基酸序列核心区20％、30％、50％、80％、90％、95％或98％类似的氨基酸序列。
165.在一些实施方案中，经修饰的蛋白包含相对于参考核心区在核心区中具有1个氨基酸取代至5个氨基酸取代的氨基酸序列。
166.在一些实施方案中，经修饰的蛋白包含在与受体结合的区(受体结合位点)中相对于参考中与受体结合的参考区具有90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
167.在一些实施方案中，经修饰的蛋白包含相对于参考受体结合位点在受体结合位点中具有90％、95％或98％相似性的氨基酸序列。
168.在一些实施方案中，参考蛋白的受体结合位点在经修饰的蛋白中未被取代。
169.在一些实施方案中，二硫键中的至少一者被去除，并且它们周围的区被重新设计，在被去除的二硫键中的每个二硫键周围有8个取代至20个取代。
170.氨基酸在本文中可通过其通常已知的三字母符号或通过iupac-iub生物化学命名法委员会推荐的单字母符号提及。如本文所用的氨基酸取代(替换)是指从一个氨基酸到不同氨基酸的变化。这通常是由于非同义错义突变引起的dna序列中的点突变，该突变改变了密码子序列以编码与参考不同的氨基酸。氨基酸替换可能影响蛋白的功能或结构，这通常取决于被替换的氨基酸有多相似或不相似以及它们在序列或结构中的位置。例如，可基于大小、极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、膨松度(或柔韧性)、β-分支、驻留于特定二级结构或特定溶剂可及区域中的倾向、芳香性、赋予特定结合相互作用(氢键、盐桥、极性和非极性相互作用)的能力、pk、结合糖和其他翻译后修饰的能力和/或所涉及残基的两亲性质的相似性来进行氨基酸取代。
171.在一些实施方案中，氨基酸替换可以是保守替换。此类替换涵盖一个氨基酸变成另一个具有类似特性的氨基酸。保守氨基酸替换(也表示为保守氨基酸“替换”或保守氨基酸突变)是蛋白中的氨基酸替换，其将给定氨基酸改变为具有类似生物化学、结构和/或化学特性的不同氨基酸。
172.例如，氨基酸可基于它们的结构和它们侧链(r基团)的一般化学特性分类成六大类。
173.脂族：异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、缬氨酸(v)；
174.羟基或含硫/硒：丝氨酸(s)，半胱氨酸(c)，苏氨酸(t)，蛋氨酸(m)；
175.环状：脯氨酸(p)
176.芳族：苯丙氨酸(f)，酪氨酸(y)，色氨酸(w)
177.碱性：组氨酸(h)、赖氨酸(k)、精氨酸(r)
178.酸性及其酰胺：天冬氨酸(d)，谷氨酸(e)，天冬酰胺(n)，谷氨酰胺(q)
179.此外，以下组中的每个组都含有其他示例性氨基酸，它们是彼此的保守取代：
180.1)非常小：丙氨酸(a)、甘氨酸(g)；
181.2)负电荷：天冬氨酸(d)，谷氨酸(e)；
182.3)极性(酰胺化羧基侧链)：天冬酰胺(n)，谷氨酰胺(q)；
183.4)带正电荷：精氨酸(r)，赖氨酸(k)；
184.6)芳族：苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)，并且偶尔还有组氨酸(h)；
185.7)小极性：丝氨酸(s)，苏氨酸(t)；
186.8)含硫：半胱氨酸(c)，蛋氨酸(m)
187.9)小：ala(a)，甘氨酸(g)，丝氨酸(s)。
188.10)β-分支的：缬氨酸(v)，异亮氨酸(i)，并且偶尔还有苏氨酸(t)；
189.11)极性：天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)；
190.然而，存在产生多种氨基酸指数的许多氨基酸簇，每个都突显了氨基酸特征的不同方面-例如，参见aa指数数据库https://www\genome.jp/aaindex/中的数百个此类指数。因此，保守替换中的一些保守替换可表示蛋白适合在食物和饮料行业中工业用途的其他重要特征，例如，与舌头的非特异性结合或其他感官性状方面。
191.附加的保守分析基于以下内容：
[0192]-非极性“疏水”氨基酸选自由以下各项组成的组：缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、蛋氨酸(m)、苯丙氨酸(f)、色氨酸(w)、半胱氨酸(c)、丙氨酸(a)、酪氨酸(y)、组氨酸(h)、苏氨酸(t)、丝氨酸(s)、脯氨酸(p)、甘氨酸(g)、精氨酸(r)和赖氨酸(k)；
[0193]
‑“
极性”氨基酸选自由以下各项组成的组：精氨酸(r)、赖氨酸(k)、天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)；
[0194]
‑“
带正电荷”的氨基酸选自由以下各项组成的组：精氨酸(r)、赖氨酸(k)和组氨酸(h)；以及
[0195]
‑“
酸性”氨基酸选自由以下各项组成的组：天冬氨酸(d)、天冬酰胺(n)、谷氨酸(e)和谷氨酰胺(q)。
[0196]
在一些实施方案中，替换是自由基替换。自由基替换(取代)是氨基酸与另一种具有不同特性的氨基酸的交换。
[0197]
参考蛋白和经修饰的蛋白之间的序列相似性和/或序列同一性程度通常会影响经修饰的蛋白的特性。例如，大量的取代可能影响结合动力学、折叠动力学、溶解度、热稳定性、盐稳定性、ph稳定性、货架期、与非水颗粒(例如，食物基质中的蛋白或脂肪或口腔中的疏水区)的结合、3d结构，以及其活性和相关特性。本文开发和应用的计算方法提供了对用于取代的推定氨基酸残基的透彻理解，这将导致改善的经修饰的蛋白。
[0198]
根据一些方面，参考蛋白是具有seq id no:45中提及的氨基酸序列的mnei。如下文实施例1所示，cpd分析已经揭示了若干氨基酸作为替换或缺失的目标。
[0199]
在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代是保守取代。在一些实施方案中，至少一个氨基酸取代是自由基取代。在一些实施方案中，两个或更多个氨基酸被取代。
[0200]
mnei的氨基酸取代先前已有报道，包括多重突变。例如，zheng等人报道了具有改善的甜味和稳定性的新型双突变的基于mnei的蛋白。具体地，zheng等人表明了mnei中的单个取代e2n导致甜味提高了3倍且稳定性略有降低。zheng等人进一步示出，除了e2n取代(例如e2n/e23a、e2n/y65r)之外，引入附加的取代e23a或y65r不影响甜味。
[0201]
在一些实施方案中，作为mnei的参考蛋白中的至少三个氨基酸取代中的至少两个或至少三个氨基酸取代是保守取代。
[0202]
如本文所述，本文所述的经修饰的mnei蛋白具有改善的食物相关特性。可通过本领域已知的任何味道测试来确定蛋白的甜味特征，诸如甜味效能(糖样风味)、缺少变味、减少的起效时间和减少的经修饰的蛋白的余味。例如，与蔗糖或其他甜味剂的甜味的比较可由品尝小组进行，并且甜度效能可按照以下实施例中的详细描述进行分级。
[0203]
该比较可通过确定如与已知甜味剂，诸如蔗糖相比的经修饰的蛋白的阈值来进行，例如，通过确定引起甜味感觉所需的最小浓度，或甜味特征评估，包括特性，诸如甜味特征、甜味起效时间、余味、口感、后味、变味和不需要的味道的掩蔽。
[0204]
如本文所用，术语影响增甜的特性包括由约0.28mg/l、约0.5mg/l或更高的甜味阈
值、介于约1秒至20秒的甜味持续时间、介于2秒至18秒之间的甜味持续时间、介于2秒至4秒之间的甜味持续时间。
[0205]
经修饰的mnei蛋白，像参考mnei蛋白一样，与甜味受体结合。
[0206]
在一些实施方案中，基于每重量，经修饰的mnei蛋白具有比糖高300-16,000的感知甜味阈值。
[0207]
感官性状包括味道动力学，示出了随时间的味道强度，即开始持续时间(感觉到味道的时间)、味道持续时间和余味时间(对应于高斯尾部)。附加的特征包括变味(例如，由于与其他受体结合)、口感圆度、金属味和其他副作用、与其他成分的协同作用(例如，掩蔽和增强其他风味或不需要的味道，诸如甜叶菊)、口感、涩味等。
[0208]
在一些实施方案中，与参考蛋白相同或相对于该参考蛋白改善，经修饰的蛋白的特征在于以下特征中的至少一者：(1)结构热稳定性，(2)功能热稳定性，(3)ph稳定性，(4)在水或部分含水环境(例如，含脂肪的食物)中的溶解性，或(5)货架期稳定性。
[0209]
本文所述的经修饰的蛋白的特征在于甜味以及其他味道效果(掩蔽不需要的味道、较少的后味、较少的余味、较少的变味、鲜味、较好的口感)，其可用作制备口服递送产品中的甜味剂。
[0210]
经修饰的蛋白可用作风味修饰剂或风味增强剂。
[0211]
本文所述的经修饰的蛋白用作口服产品。在一些实施方案中，该产品是食物或饮料产品、膳食补充产品或药物。对于产品制备，本文所述的蛋白可与任何食品级添加剂结合。食物或饮料产品可呈任何固体干燥形式提供和使用，包括但不限于细粉、冻干物、颗粒、片剂等。在一些实施方案中，组合物呈液体形式提供，例如，作为水中的溶质(水溶液)。
[0212]
包含经修饰的蛋白的产品可具有多种应用。这包括但不限于(以下项中的每一项构成本公开的单独的实施方案)，在食物和饮料行业(水果和蔬菜汁和花蜜、软饮料、即饮饮料、糖浆、功能饮料、运动饮料等)中用作甜味剂、风味剂、增强剂、掩蔽剂和具有风味特性的蛋白)，在乳制品行业中，即乳制品、酸奶和布丁；在制药行业中；自然疗法行业、营养品行业(例如，营养品棒)和其他保健产品(例如，牙膏和漱口水)、甜食、软糖和口香糖行业、蔬菜(例如，番茄酱或沙司)或任何其他需要使用风味修饰组合物作为赋形剂或添加剂的应用。
[0213]
根据一些实施方案，附加的食物成分选自由以下各项组成的组：蔗糖、果糖、葡萄糖、龙舌兰蜜、糙米糖浆、枣糖、蜂蜜、枫糖浆、糖蜜、僧果、糖醇、稀有糖、甜菊糖苷、阿斯巴甜、三氯蔗糖、乙酰磺胺酸钾、和膳食纤维。
[0214]
在一些实施方案中，相对于参考蛋白，经修饰的蛋白具有相等或改善的结构热稳定性。
[0215]
如本文使用的术语“结构热稳定性”或“热稳定性”是指经修饰的蛋白在高于参考蛋白的温度的温度下保持其3d结构的能力。蛋白的3d结构稳定性可通过本领域已知的任何方法来测量，诸如圆二色性(cd)或热移位测定法，诸如差示扫描荧光测定法(dsf)或差示扫描量热法(dsc)或用蛋白变性剂，诸如氯化胍进行滴定。3d蛋白结构可能会影响蛋白功能。显著地，食物产品和饮料产品所需的货架期和热稳定性可与结构热稳定性有关，并且由不同的可测量值组成，例如，巴氏灭菌(或在消费者包装的商品最终产品的制备期间的热处理)可通过不同的方案来应用，并且与在非常短的时间内保持蛋白结构的耐热性有关。
[0216]
在一些实施方案中，相对于参考蛋白，经修饰的蛋白具有相同或更高的功能热稳
定性。如本文所用的术语“功能热稳定性”是指与参考蛋白相比，经修饰的蛋白在暴露于高温后保持其功能的能力。
[0217]
在一些实施方案中，本文的经修饰的蛋白可在较高温度下或在暴露于较高温度有限时间后保持其甜味效果。换句话说，在产品暴露于室温以上的温度，有时高达50℃，有时高达100℃，或甚至高达150℃后，甜味或感官性状不存在明显变化。蛋白功能，例如甜味，可在蛋白冷却到可品尝的温度后通过感官测试来测量。
[0218]
在一些实施方案中，经修饰的蛋白相对于参考蛋白具有相等或更高的ph稳定性。ph稳定性是指相对于参考蛋白，经修饰的蛋白在更宽的ph范围内的长期稳定性，即在产品暴露于3至8之间的任何ph，有时介于4至8之间的ph后，经修饰的蛋白保持3d结构和/或功能。例如，像可乐样的苏打水具有2.3-2.5的ph值，在该ph值下，甜味蛋白中的一些甜味蛋白不稳定，并且立即或在短于饮料正常货架期的时间后失去功能。
[0219]
在一些实施方案中，经修饰的mnei蛋白具有比参考mnei蛋白更高的溶解度。溶解度可以是在水性、部分水性或非水性环境中，诸如含脂肪的食物。
[0220]
在一些实施方案中，相对于参考mnei蛋白，经修饰的mnei蛋白具有改善的货架期。改善的货架期是指包含组合物的产品没有感觉到甜味(功能)的变化或物理变质(例如，颜色变化、相分离等)在产品暴露于高达150℃的任何温度之后，有时暴露于介于4℃至150℃或100℃之间的任何温度。
[0221]
在一些其他实施方案中，与参考蛋白相同或相对于该参考蛋白改善，经修饰的mnei蛋白的特征在于以下特征中的至少一者：(1)折叠动力学，(2)蛋白的翻译后修饰(例如，糖基化或乙酰化)模式不同于参考蛋白，(3)二硫键的数量相对于没有二硫键的参考mnei蛋白更高。
[0222]
在一些实施方案中，经修饰的mnei蛋白具有与参考mnei蛋白相等或相对于该参考mnei蛋白的折叠动力学。即，来自未折叠或部分折叠结构的蛋白折叠速率更快(如在计算机上评估的，例如，通过分子动力学或通过体外或体内实验方法)。另选地，更快的折叠动力学是指变性实验中更慢的未折叠动力学，例如，通过变性剂滴定(例如，氯化胍和/或高浓度尿素)或其他方法。
[0223]
在一些实施方案中，经修饰的mnei蛋白的特征在于在被评估的宿主生物体中的表达产量等于或高于参考mnei蛋白。
[0224]
在一些实施方案中，经修饰的mnei蛋白具有介于8.6至9.5之间的pl值。
[0225]
本文所述的经修饰的mnei蛋白的特征在于甜味以及其他味道效果(掩蔽不需要的味道、较少的后味、较少的余味、较少的变味、较少的余味起效和鲜味)可用作制备口服递送产品的甜味剂。
[0226]
经修饰的mnei蛋白可用作风味修饰剂或风味增强剂。
[0227]
本文所述的经修饰的mnei蛋白用作口服产品。在一些实施方案中，产品是是食物产品、食物补充产品或药物。对于产品制备，本文所述的蛋白可与任何食品级添加剂结合。食物产品可呈任何固体干燥形式提供和使用，包括但不限于细粉、冻干物、颗粒、片剂等。在一些实施方案中，组合物呈液体形式提供，例如，作为水中的溶质(水溶液)。
[0228]
包含经修饰的蛋白的mnei产品可具有多种应用。这包括但不限于(以下项中的每一项构成本公开的单独的实施方案)，在食物和饮料行业(水果和蔬菜汁和花蜜、软饮料、即
饮饮料、糖浆、功能饮料、运动饮料等)中用作甜味剂、风味剂、增强剂、掩蔽剂)，在乳制品行业中，即乳制品、酸奶和布丁；在制药行业中；自然疗法行业、营养品行业和其他保健产品(例如，牙膏和漱口水)、甜食、软糖和口香糖行业、蔬菜(例如，番茄酱或沙司)或需要使用风味修饰组合物作为赋形剂或添加剂的任何其他应用。
[0229]
该产品可包含附加的食物成分。在一些实施方案中，食物成分是甜味剂，例如甜菊糖苷。本文所述的经修饰的蛋白和甜菊糖苷的组合产生协同效应。因此，在一些实施方案中，产品包含至少一种由seq id no:1-21表示的经修饰的蛋白和甜菊糖苷。
[0230]
其中甜叶菊(在本文中表示为甜菊糖苷或其混合物)和/或其变体与本发明的经修饰的蛋白以0.5
°
bx至8
°
bx蔗糖当量的范围组合，经修饰的蛋白表示30％至70％蔗糖甜味的替换。在蔗糖当量为0.5
°
bx至8
°
bx时，感觉到的甜味强度至少是甜叶菊溶液的100％。在蔗糖当量为0.5
°
bx至8
°
bx时，感觉到的残留感官性状优于100％的甜叶菊溶液。
[0231]
在蔗糖当量为0.5
°
bx至8
°
bx时，感觉到的酸味感观特征优于100％的甜叶菊溶液。
[0232]
根据一些实施方案，附加的食物成分选自由以下各项组成的组：蔗糖、龙舌兰蜜、糙米糖浆、枣糖、蜂蜜、枫糖浆、糖蜜、僧果、糖醇、稀有糖、阿斯巴甜、三氯蔗糖、乙酰磺胺酸钾、和膳食纤维。
[0233]
在一些实施方案中，本文所述的制剂提供了具有减少、消除或掩蔽的后味或异味(例如，金属或甘草味道)或减少、消除或掩蔽的苦味或减少、消除或掩蔽的甜味余味的糖样味道特征。
[0234]
应当指出的是，根据本发明，经修饰的mnei蛋白可通过本领域已知的任何方法产生，例如，该蛋白可通过重组dna技术合成产生，或通过发酵罐、植物、植物愈伤组织或其他生物反应器在微生物中产生蛋白。在一些实施方案中，经修饰的蛋白可在细菌中产生，诸如大肠杆菌(e.coli.)。在一些其他实施方案中，经修饰的蛋白可由酵母产生，诸如酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母菌(pichia pastoris)。在一些其他实施方案中，经修饰的蛋白可在丝状真菌，诸如木霉菌(trichoderma)或曲霉菌(aspergillus)中产生。
[0235]
术语“酵母和丝状真菌”包括但不限于任何克鲁维酵母菌(kluyveromyces)属，诸如乳酸克鲁维酵母菌(kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母菌(kluyveromyces marxianus)、酵母菌(saccharomyces)属，诸如酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母菌(pichia)属，诸如毕赤酵母菌(pichia pastoris)、费比恩毕赤酵母菌(pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(pichia trehalophila)、科克拉马毕赤酵母菌(pichia koclamae)、膜醭毕赤酵母菌(pichia memhranaefaciens)、微小毕赤酵母菌(pichia minuta)(甲醇诱导型酵母菌(ogataea minuta)、粉状毕赤酵母菌(pichia lindner))、掌毕赤酵母菌(pichia opuntiae)、耐热毕赤酵母菌(pichia thermotolerans)、水杨毕赤酵母菌(pichia salictaria)、葛根毕赤酵母菌(pichia guercuum)、皮杰普氏毕赤酵母菌(pichia pyperi)、树干毕赤酵母菌(pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母菌(pichia methanolica)、多形汉逊酵母菌(hansenula polymorpha)、白色念珠菌(candida albicans)、任何曲霉属真菌(aspergillus)属，诸如构巢曲霉菌(aspergillus nidulans)、黑曲霉菌(aspergillus niger)、米曲霉菌(aspergillus oryzae)、里氏木霉菌(trichoderma reesei)、鲁克文金孢子菌(chrysosporium lucknow ens e)、镰刀菌
(fusarium)属，禾谷镰刀菌(fusarium gramineum)、枯萎镰刀菌(fusarium venenatum)、小立碗藓(physcomitrella patens)、嗜热毁丝菌(myceliopthora)和神经孢子菌(neurospora crassa)。
[0236]
在一些实施方案中，所选氨基酸序列的dna序列在rna水平和dna水平上被优化。在rna水平下，这包括最小化rna二级结构，以确保快速插入核糖体中。在dna水平下，这包括对宿主生物体的密码子优化(顾及到了rna水平优化)。密码子使用优化为每种表达的氨基酸提供了使用宿主生物体中最丰富的trna的偏好。
[0237]
关于上述内容，应当理解，在提供的情况下，百分比值，诸如例如10％、50％、120％、500％等能够与“倍数变化”值互换，即分别为0.1、0.5、1.2、5等。
[0238]
除非另外指明，否则本文所用的所有科学和技术术语均具有本领域常用的含义。本文提供的定义是为了便于理解本文频繁使用的某些术语，而并非意在限制本公开的范围。
[0239]
如本文所用的术语“约”是指
±
10％。术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(having)”及其同源词意指“包括但不限于”。术语“基本上由
…
组成”意味着组合物、方法或结构可包括附加的成分、步骤和/或部分，但仅仅是在这些附加的成分、步骤和/或部分不会实质上改变要求权利的组合物、方法或结构的基本特征和新颖特征时。如本文所用，术语“约”表示可以比所提及的值最多向上或向下偏离1％、更具体地5％、更具体地10％、更具体地15％，并且在一些情况下最多向上或向下偏离20％的值，该偏离范围包括构成连续范围的整数值，如果适用的话，还包括非整数值。
[0240]
必须注意，如在本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另外清楚地说明并非如此。
[0241]
如本文所用的“溶液”是指液体混合物，其中微量组分(溶质)均匀分布在主要组分(溶剂)内。与悬浮液或混浊的混合物相比，溶液是清澈的，并且不含颗粒物。
[0242]
如本文所用的“糖浆”或“饮料糖浆”是指饮料前体，向其中加入流体，通常是水，以形成即饮饮料或“饮料”。通常，糖浆与水的体积比率介于1:3至1:8之间，更通常介于1:4和1:6之间。糖浆与水的体积比率也表示为“掷”。饮料行业内通常使用的1:5比率被称为“1+5掷”。
[0243]
该制剂可“原样”使用或与其他甜味剂、风味剂和食品成分组合使用。
[0244]
甜味剂的非限制性实施例包括甜菊糖苷、蛇菊苷、莱苞迪甙a、莱苞迪甙b、莱苞迪甙c、莱苞迪甙d、莱苞迪甙e、莱苞迪甙f、杜尔可甙a、甜菊双糖甙、甜茶甙以及在贝尔托尼甜叶菊植物中发现的其他甜菊糖苷及其混合物、甜叶菊提取物、罗汉果提取物、罗汉果甙、高果糖玉米糖浆、玉米淀粉、转化糖、果寡糖、菊粉、菊粉寡糖、偶合糖、麦芽寡糖、麦芽糊精、固体玉米糖浆、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、阿斯巴甜、糖精、三氯蔗糖、糖醇。
[0245]
香料的非限制性实施例包括蔓越莓、柠檬、橙子、香蕉、葡萄、梨、菠萝、瓜拉那、苹果、芒果、苦杏仁、可乐、肉桂、糖、棉花糖和香草香料。
[0246]
其他食物成分的非限制性实施例包括风味剂、酸化剂、有机酸和氨基酸、着色剂、增量剂、经修饰的淀粉、胶、质构剂、防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、稳定剂、增稠剂和胶凝剂。
[0247]
如本文所用，短语“糖样特性”、“糖样味道”、“糖样甜味”、“含糖的”和“糖样的”是
同义的。糖样特征包括任何类似于蔗糖的特征，包括但不限于最大应答、风味特征、时间特征、适应行为、口感、浓度/应答函数行为、味道和风味/甜味相互作用、空间模式选择性和温度效应。这些特征是其中蔗糖的味道不同于天然和合成的高效能甜味剂的味道的维度。特征是否更具糖样是由专家感官小组对糖和功能味道改善组合物的评估决定的。此类评估量化了组成特征的相似性。确定组合物是否具有更具糖样的味道的合适的程序是本领域熟知的。
[0248]
如本文所用的术语“风味”或“风味特征”是味道、气味和/或质地的组分的组合后的感官感知。如本文所用的术语“增强”包括赋活、强化、加重、放大和增强风味特征的感官感知，而不改变其性质。如本文所用的术语“修饰”包括改变、变化、抑制、降低、强化和补充风味特征的感官感知，其中此类特征的质量或持续时间有缺陷。
[0249]
如本文所用的“味道修饰蛋白(tmp)”被定义为充当基本味道(诸如但不限于甜味、鲜味)的替代物的蛋白，以及具有风味特征的阻断剂、增强剂、掩蔽剂和蛋白。
[0250]
本发明中的“高强度甜味剂”意指与蔗糖相比具有强甜味的蛋白，并且可以是天然存在的蛋白、重组蛋白或它们的组合。该高强度甜味剂表现出的甜味是相同量蔗糖的5倍或更多、10倍或更多、50倍或更多、100倍或更多、500倍或更多、1000倍或更多、5000倍或更多、10000倍或更多、50000倍或更多、100000倍或更多。
[0251]
如本文所用的“营养功能组分”是指人体所需的营养物质，是指选自由以下各项组成的组中的任何一者或多者：矿物质、有机酸、维生素、多酚、蛋白、氨基酸、膳食纤维和糖类(糖类除外)。
[0252]
如本文所用的术语“功能”是指在热或其他过程(尽管可能有结构变化)后功能(例如甜味)的保持。
[0253]
如本文所用的术语“功能稳定性”是指在制剂或消费者包装的良好条件下的稳定性和保持功能感官特性的稳定性，而不是呈干燥、水或缓冲剂形式的纯物质的化学稳定性。
[0254]
如本文所用，术语“食料”意指任何可食用的口腔组合物，包括饮料、甜食产品、口香糖产品或食物产品。
[0255]
如本文所用的术语“饮料”意指任何可饮用的液体或半液体，包括例如风味水、软饮料、水果饮料、基于咖啡的饮料、基于茶的饮料、基于果汁的饮料、基于牛奶的饮料、果冻饮料、碳酸或非碳酸饮料、酒精或非酒精饮料。
[0256]
如本文所用，“口服摄入的组合物”和“增甜组合物”是同义的，并且是指接触人或动物口腔的物质，包括摄入口腔并随后从口腔中排出的物质，以及饮用、食用、吞咽或以其他方式摄入的物质，并且当在通常可接受的范围内使用时，对人或动物消费是安全的。这些组合物包括食物、饮料、药物、营养品、口腔卫生/化妆品等。这些产品的非限制性实施例包括非碳酸和碳酸软饮料(csd)，诸如可乐、姜汁汽水、根啤酒、苹果酒、水果风味软饮料(例如柑橘风味软饮料，诸如柠檬-酸橙、蔓越橘或橙子)；粉末状软饮料等；源自水果或蔬菜的果汁；果汁，包括压榨果汁等；含有水果颗粒的果汁、水果饮料、果汁饮料、含有果汁的饮料、含有水果调味剂的饮料、蔬菜汁、含有蔬菜的果汁和含有水果和蔬菜的混合果汁；运动饮料、能量饮料、近水饮料等饮料(例如，具有天然调味剂或合成调味剂的水)；茶类或饮料，诸如咖啡、可可、红茶、绿茶、乌龙茶等；含有乳组分的饮料，诸如乳饮料、含有乳组分的咖啡、牛奶咖啡、奶茶、水果乳饮料、可饮用的酸奶、乳酸菌饮料等；乳制品；烘焙产品；甜点，诸如酸
奶、果冻、橡皮糖、可饮用的果冻、布丁、巴伐利亚奶油、牛奶冻、蛋糕、核仁巧克力饼、慕斯、花生酱等，在下午茶时间或餐后食用的甜味食物产品或饮料产品；冷冻食物；冷甜食，例如冰淇淋类型，诸如冰淇淋、冰牛奶、乳糖冰等(食物产品或饮料产品，其中甜味剂和各种其他类型的原料被添加到乳制品中，并且所得的混合物被搅拌和冷冻)，以及冰甜食，诸如冰冻果子露、甜点冰等(食物产品或饮料产品，其中各种其他类型的原料被添加到含糖液体中，并且所得的混合物被搅拌和冷冻)；冰淇淋；普通甜食，例如烘焙甜食或蒸制甜食，诸如蛋糕、薄脆饼干、饼干、红豆酱小面包等；年糕和零食；桌面产品；普通甜食，诸如口香糖(例如，包括包含基本上不溶于水的可咀嚼胶基的组合物诸如糖胶屎或其替代物，包括橡胶或某些可食用的天然合成树脂或蜡)、硬糖、软糖、薄荷糖、牛轧糖、软糖豆等；调味汁，包括水果风味调味汁、巧克力调味汁等；可食用凝胶；奶油，包括黄油奶油、面粉糊、鲜奶油等；果酱，包括草莓酱、橘子酱等；面包，包括甜面包等或其他淀粉产品；香料；普通调味品，包括用于烤肉、烤禽、烧烤肉等的调味酱油，以及番茄酱(tomato catsup)(番茄酱(ketchup))、沙司、面汤等；加工的农产品、家畜产品或海产品；加工的肉产品，诸如香肠等；蒸馏食物产品或饮料产品、泡菜、果酱、酱油、美味佳肴、配菜；零食，诸如薯片、曲奇饼等；谷类产品；口服施用或用于口腔的药物、准药物和膳食补充剂(例如，维生素、止咳糖浆、止咳糖、咀嚼片、氨基酸、苦味药物或药剂、酸化剂等)，其中药物可呈固体、液体、凝胶或气溶胶形式，诸如药丸、片剂、喷雾剂、胶囊、糖浆、滴剂、锭剂、粉末等；个人护理产品，诸如用于口腔的口腔组合物，诸如口腔清新剂、漱口剂、口腔冲洗剂、牙膏、牙齿抛光剂、洁齿剂、口腔喷雾剂、牙齿增白剂等；膳食补充剂；动物饲料；和营养产品，其包括可提供医疗或健康益处的任何食物或食物的一部分，这些益处包括疾病的预防和治疗(例如，心血管疾病和高血胆固醇水平、糖尿病、骨质疏松症、炎症或自身免疫性病状)。
[0257]
如本文所用，甜叶菊是原产于巴西和巴拉圭的菊科(asteracae)(菊科(compositae))多年生灌木甜叶菊(贝尔托尼)的通用名。甜叶菊叶、叶的含水提取物和从甜叶菊中分离的纯化的甜菊糖苷已经被开发为无热量和天然来源的期望的甜味剂。从甜叶菊中分离的甜菊糖苷包括甜菊苷、莱苞迪甙a、莱苞迪甙c、杜尔可甙a、甜茶甙、甜菊双糖甙、莱苞迪甙b、莱苞迪甙d和莱苞迪甙f。
[0258]
从甜叶菊中分离并表征了reb m(也被称为莱鲍迪甙x)，(13-[(2-o-β-d-吡喃葡萄糖基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-β-d-吡喃葡萄糖基)基]ent kaur-16-烯-19-羧酸-[(2-o-β-d-吡喃葡萄糖基-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基)]。
[0259]
如本文所述，食物或饮料组合物具有改善的食物或饮料相关性质。可通过本领域已知的任何味道测试来确定组合物的甜味特征，诸如甜味效能、缺少变味、减少的起效时间和减少的组合物的余味。例如，与蔗糖或其他甜味剂的甜味的比较可由感官小组进行，并且甜味效能可按照以下实施例中的详细描述进行分级。
[0260]
非限制性实施例
[0261]
实施例1：基于mnei的蛋白的设计
[0262]
基于mnei的蛋白的设计如下进行：单链莫奈林，mnei(seq id no:45)是由96个氨基酸构成的多肽，分子量约11kd，并且pl约8.7。
[0263]
计算方法
[0264]
如上所述，计算和人类专家分析提供了缩减的序列空间，该空间可由专家、用实验
方法或这些方法的组合进行进一步的计算分析。此类分析可应用于单个氨基酸、应用于氨基酸簇或应用于其他组合。
[0265]
在计算蛋白设计(cpd)过程期间，允许在不太可能是受体结合位点一部分的特定区域进行氨基酸替换和/或缺失，例如，在螺旋周围、形成蛋白核心的β-折叠的非暴露侧、或区分mnei和野生型莫奈林的工程环。rosetta运行产生了600k个模型。当绘制出所有模型的能量时，结果图具有效用函数的形式。效用函数(也被称为对数赔率)是赔率p/(1
–
p)的对数，其中p是概率。其是s形“逻辑”函数的逆函数。
[0266]
为了进一步分析，选择了5k最低型号。将替换数量(与mnei相比)绘制为reu的函数给出了高斯分布，示出了群体是正常的，并且对于进一步的分析是有效的。
[0267]
mnei的环设计
[0268]
mnei中的y47-k56环(即gly-phe肽)是一种柔性环，通过分子动力学(md)模拟在ph＝2和7时表明。此环不是莫奈林的天然环，并且是作为天然莫奈林的两个亚单元(链a和链b)的连接子引入的。这样，mnei产生了。引入的环对甜味没有影响，因此mnei具有与莫奈林相同的甜味，然而，mnei具有更高的tm(熔融温度)，这说明了环对蛋白稳定性的影响(curr opin struct biol.1999年8月；9(4):494-9)。识别环的重要性，发明人重新设计并缩短了环以增加产量、稳定性和感官性状。
[0269]
程序：
[0270]
接枝
[0271]
根据环和mnei的两个相邻β-折叠的3d结构比对，识别了两种类似的蛋白。基于这些pdb，使用rosetta构建并最小化了四个模型。
[0272]
基于尺寸和从头计算建模
[0273]
除了上文概述的接枝程序，基于物理考虑和生物物理的考虑，获得了附加的环改变。为了研究环长度对mnei稳定性的影响，使用cpd软件，诸如罗塞塔或瑞士pdb查看器的对不同长度的环进行建模。使用mnei序列或基于同源性建模，基于物理考虑进行环建模。然后将每个模型的能量最小化，并使用gromos96 43b 1力场计算能量。基于此分析，进一步测试了具有6个残基、5个残基和4个残基的环，因为发现具有这些长度的环在能量上更有利。
[0274]
热稳定性
[0275]
建立了mnei序列的不同变型，并用罗塞塔预测了每个模型的能量。为了进一步分析，选择最低能量的序列dm28(具有4聚体环，即4个氨基酸的环，将初始mnei环缩短了3个氨基酸)，并且使用罗塞塔进行能量cpd计算，重复100k次。然后使用dm28作为模板，将4聚体环与特定氨基酸取代结合，构建了附加的变型(产生dm29、dm31、dm32和dm33，参见表3和表4)。在dm09的基础上增加了一个附加的变体dm30。选择最低能量的序列dm31进行进一步分析。
[0276]
表1a：由罗塞塔计算的不同序列的能量。所有计算都是使用罗塞塔3.8完成的。注意，reu是针对蛋白的理论结构计算的，mnei除外，其计算基于pdb id 2o9u和dm31的晶体结构(表中最后一行)。
[0277]
蛋白reumnei-198.410dm09_6mer.环-195.663dm09_5mer.环-189.168
mnei_5mer.环-192.917dm28-200.068dm29-198.603dm30-200.03dm31-203.534dm32-201.43dm33-203.061晶体结构dm31-208.025
[0278]
图30至图32比较了dm31的特性和mnei的特性，使用了在pdb可获得的晶体结构和由发明人解决的dm31的晶体结构。这些数字表明，取代，插入和缺失，以及环的重新设计，导致了新的蛋白，dm31，使蛋白更稳定，具有显著更具刚性的结构元件。如与mnei的环结构相比，dm31的紧凑的重新设计的环结构表明了增加的稳定性(图30b)。此外，图31a和图31b所示的b因子分析表明了dm31的环残基的降低的b因子(图31b)，以及二级结构元件的降低的平均值(图31a)。由于b因子指示无序，这些结果表明dm31的增加的稳定性。
[0279]
图32示出了在重新设计的环和相邻的β链中的主链介导的氢键，表明了如与mnei中的对应环(图32a，pdb id:2o9u)相比，在dm31(图32c)的此区中有更好优化的氢键以及新的键。新的氢键表示稳定的β转角，替换了无序的环。氢键也示出在1b表中。此图示出了dm31中存在的19个氢键，并且在可用的mnei结构中的至少一个结构中不存在。表中的数字指示主链氮上参与的氢和作为受体的主链氧的距离。该表表明，与dm31晶体结构(分辨率为1.6埃)相比，在2o9u结构(可用于mnei的最高分辨率结构(分辨率为1.15a))中，存在较少的氢键，并且这些键中的一些不太优化(在距离和角度方面)。除了图31中描述的b因子增加之外，2o9u结构具有三个双占位残基(e4、m42和e48)；突显了在dm31结构中硬化的高分辨率结构中的无序。
[0280]
图30a中的插入物突显了所选择的氨基酸取代以及重新设计的环区。这些变化是设计蛋白dm31增加稳定性和甜味的基础。图30a中示出环区的插入物(也参见图30b)示出环区域中的残基不仅形成新型氢键(图32)，而且参与附近两条β链的伸长，也指示增加的稳定性。总体而言，用由β转角连接的伸长的β链替换二有序环使蛋白的此区变硬，导致增加的稳定性，如熔融温度的显著增加所示。
[0281]
表1b：氢键。1-字母的氨基酸描述，随后链中作为氢键供体或受体的氨基酸编号。编号与mnei的编号(pdb id:2o9u)一致。所有的氢键都在主链氮上的氢和作为受体的主链氧之间。该数字表示供体和受体的氢之间的埃距离。
[0282]
#氢键供体受体liv72o9udm311t45 nn21.8
‑‑
2.12e4k432.12,2.52.13k43e41.8
‑‑
1.84m42q612.41.8、2.32.15q61m421.8
‑‑
1.96146g571.8
‑‑
1.97g571462.22.5
‑‑
8e54e48
‑‑‑‑
2.19e48e5421.8210y58e771.821.811e77y581.9
‑‑
212e59k441.9
‑‑
1.913k44e591.81.91.814f71v641.91.91.915v64f711.9
‑‑
1.916d74r882.1
‑‑
1.817r88d742.52.32.518n90r722.22219r72n902
‑‑
1.9
[0283]
b因子(德拜-沃勒因子)
[0284]
德拜沃勒因子，也被称为温度因子、b因子或原子位移参数，包括存放在蛋白数据库(pdb)的每个x射线结构中的每个原子。这些值是针对每个蛋白原子给出的，并且是指从实验电子密度图中得到的原子的平均位移。此类分散是两种不同现象的结果，一种是由原子的温度相关振动引起的动态无序，另一种是静态无序。
[0285]
为了证明重塑环的稳定性，基于由结构蛋白组学中心(weizmann institute of science)制备的晶体结构，比较了mnei(pdb id:2o9u，1iv7，5z1p)的结构的主链b因子与dm09和dm31的值。对于每个蛋白，首先使用z分数归一化单独对主链b因子值进行归一化。
[0286]
归一化后，很明显引入dm31的环设计(缺失3个氨基酸)降低了重新设计的环中的b因子-通过去除具有高b因子的位置和影响邻近残基两者。
[0287]
图31a至图31b表明了mnei结构dm09和dm31的归一化b因子。首先分别使用z分数归一化对每个结构的主链b因子进行归一化。区(a)和环残基(b)。
[0288]
晶体结构质量保证分析
[0289]
软件molprobity对蛋白结构的生物物理特性进行质量保证分析。使用molprobity检查mnei结构并将其与dm09和dm31的晶体结构进行比较。比较表明，与参考mnei结构相比，dm31具有有利的性状。显著地，dm31没有差的旋转异构体，并且根据molprobity，超过96％的其旋转异构体受到青睐。molprobity研究的另一方面是不同氨基酸的主链二面角的组合与这些角度的已知统计分布的关系。相对于这些分布，dm31没有异常角，并表明超过97％的有利值。
[0290]
表1c：晶体结构分析数据
[0291]
[0292]
氢键：在环区引入β-转角
[0293]
蛋白由氢键稳定，这些氢键也决定了它们的二级结构。pymol用于分析dm31、dm09和代表性高质量mnei结构pdb id 2o9u的晶体结构的氢键。分析显示在e48和e51(相当于mnei的e54)之间的设计环区存在新的氢键。此引入的结合，是旨在稳定环区的设计的结果，导致了经典的刚性ii型β-转角，其比在mnei结构中发现的随机线圈不稳定环要稳定得多。
[0294]
图32a至图32c表明了mnei(a)、dm09(b)和dm3 1(c)的氢键。环区被框在正方形中。
[0295]
图33示出了dm31环结构符合β-转角的结构定义：dm31设计环的结构和示意性β-转角。
[0296]
实施例2：mnei设计蛋白dm13-dm33的克隆、表达和表征
[0297]
在用异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)诱导的t7启动子下，在大肠杆菌bl21(de3+)中生产重组mnei蛋白。使用此系统，mnei蛋白在高密度发酵过程中表达为细胞溶质蛋白(可溶部分)。设计mnei(dm)设计的蛋白有高达11％的氨基酸取代。本发明的发明人在wo2019215730中公开了两种dm分子(dm08和dm09)。两种蛋白都在mnei的位于位置2、位于位置23和位于位置65含有三个取代，导致更高的热稳定性和增加的稳定性。
[0298]
本发明公开了新型dm分子，其产生是为了在dm08或dm09的位于位置35、位于位置36和位于位置70添加高达三个额外的氨基酸取代，位于位置2和位于位置23有或没有逆转替换。此外，产生了两种独特的dm分子(dm28和dm29)，其中从连接莫内林b链和a链的环中去除了四个氨基酸。位于位置36和位于位置70的取代与新设计的环结合，产生了附加的三种变体(dm31、dm32和dm33)。与dm09(dm30)相比，产生了仅具有单个氨基酸取代的一种附加的变体。
[0299]
所有dm均在大肠杆菌发酵中产生，并纯化至》95％的水平。
[0300]
克隆
[0301]
基于dm08和dm09序列的定点诱变(sdm)用于产生dm 13-dm33。
[0302]
对于dm28-33中的环去除，以类似的方式进行缺失。表2列出了用于此过程的引物。所有最终的构建序列都得到确认。
[0303]
表2：用于产生dm13-33的定点诱变反应的引物
[0304][0305]
dm13-dm33和dm-3，8-12的核苷酸序列列于表3。
[0306]
表3：经修饰的蛋白的序列
[0307]
[0308][0309]
发酵
[0310]
使用sartorius biostatb系统或solaris jupiter系统的2l容器，在3l容器中对所有dm克隆进行发酵。一些dm克隆是通过外包在vtt(芬兰)和scivac(以色列)生产的。所有发酵都遵循基于arie geerlofembl汉堡2008年1月29日的“大肠杆菌的高细胞密度发酵”的方案。
[0311]
纯化
[0312]
使用以下步骤纯化所有dm样品：
[0313]
1.压力均质器裂解。
[0314]
2.在多模式树脂上捕获蛋白，用相同缓冲液中增加的nacl浓度洗脱。
[0315]
3.使用来自以下组的树脂的至少一个抛光步骤：
[0316]
1.离子交换。
[0317]
2.疏水相互作用。
[0318]
3.尺寸排除。
[0319]
4.最终微生物过滤(0.2um)并储存在-20℃下。
[0320]
表征
[0321]
纯化水平
[0322]
使用凝胶电泳随后考马斯染色和密度测定分析来评估纯化水平。使用50ng/泳道-500ng/泳道的bsa标准曲线，通过运行20pg/泳道的每种蛋白进行密度测定分析。在所有样品中，最大污染达到3％(即97％纯度)。
[0323]
甜味评估
[0324]
专业感官小组包括首先用糖溶液在0-100(量级估计)的标度上校准的专门小组成员，其中0＝一点也不甜，并且100＝非常甜。校准后，品酒师根据经验证的品尝方案，在相同的标度上对测试样品进行分级。在2
°
bx、4
°
bx、6
°
bx和8
°
bx的浓度下获得蔗糖的线性标度。
[0325]
白利糖度(bx)＝gr/100ml。
[0326]
在每个测试中，在所选择的效能x4000下，通过与6
°
bx的糖、dm09和新的所选择的dms进行比较来进行最初的甜味评估。所有稀释仅在水中进行。专家小组在不同场合对样品进行评估，使用6
°
bx蔗糖和dm09作为对照(图1)。
[0327]
dsf分析和dsc分析-热敏性
[0328]
相对tm通过使用纳米调温普罗米修斯的差示扫描荧光测定法(dsf)来确定。dsf是一种简单、快速、并且准确分析蛋白稳定性和聚集的方法。dsf检测蛋白中色氨酸残基和酪氨酸残基的荧光变化。色氨酸残基和酪氨酸残基的荧光强烈依赖于它们的周围环境。蛋白构象的变化将反映为荧光变化。荧光比率的一阶导数(330/350)用于确定拐点。由于不需要二级报告荧光团，蛋白溶液可独立于缓冲液组分进行分析，并且超过250mg/ml至10μg/ml的浓度范围。dm13-33在ph 7的10mm磷酸盐缓冲液中以0.5mg/ml的浓度进行分析。
[0329]
表4总结了修饰蛋白dm 13-dm33的特性。结果指示若干氨基酸在控制蛋白甜味和热稳定性中的作用。除了e2、e23和y65，用异亮氨酸取代位于位置70的亮氨酸使tm增加了2℃。通过用苏氨酸取代位于位置36的赖氨酸进一步增加了稳定性，然而，此取代也导致了蛋白甜味的降低。导致4个氨基酸环的环设计导致增加的稳定性，表现为tm增加约7℃-10℃。
[0330]
表4：修饰蛋白dm13-dm33的特性总结：
[0331]
tm(℃)结构热稳定性根据拐点来估计，该拐点通过差示扫描荧光测定法(dsf)来确定。与dm09相比，基于在水中稀释的1:4000的效能，在6
°
bx蔗糖当量下评估甜味水平。
[0332][0333]
结论：特定位置对tm和甜味水平的影响
[0334]
e2-用n取代＝》tm和甜味的增加(dm22与dm23或dm20与dm21的比较)。
[0335]
e23-用a或v取代＝》tm增加(dm13与dm15或dm 17与dm22的比较)。对甜味无明显影响(以其他取代为背景)。
[0336]
e23-用a与v＝》(dm09与dm27的比较)取代。
[0337]
e23-用i取代＝》tm增加(dm13与dm15或dm17与dm22的比较)。对甜味没有明显影响。
[0338]
n35-用t取代＝》对任一参数没有明显影响。
[0339]
k36-用t取代＝》tm增加，甜味明显降低(dm14与dm17、dm24与dm14或dm13与dm16的比较)
[0340]
y65-用r与k取代＝》(dm08与dm27的比较)
[0341]
l70-用i取代＝》tm少量增加，对甜味没有明显影响(dm09与dm14或dm08与dm13的比较)。
[0342]
环设计-e50、f52、r53缺失＝》tm大幅增加，对甜味无明显影响
[0343]
实施例3：对莫奈林设计蛋白dm13的甜味强度和稳定性的感官评估
[0344]
与mnei(图2a)相比，进行了dm13(图2b)、dm28(图2c)和dm31(图2d)的甜味强度的剂量应答。首先用糖溶液对专门小组成员进行校准，标度为0-100(量级估计)，其中0＝一点都不甜，100＝非常甜。a在2
°
bx、4
°
bx、6
°
bx和8
°
bx的浓度下获得蔗糖的线性标度。白利糖度(bx)＝gr/100ml。校准后，品酒师根据经验证的品尝方案，在相同的标度上以递增的浓度对测试样品进行分级。
[0345]
如图2所示，dm13、dm28和dm31比mnei甜四倍。
[0346]
在缓冲柠檬酸盐中于95℃热处理30秒
[0347]
缓冲柠檬酸盐(ph＝3)在热混合器中预热至95℃。在95℃下，将dm13(浓度为5
°
bx异甜)加入到缓冲溶液中，并在此温度下保持30秒。30秒后，溶液立即在冷冻机中冷却。
[0348]
专家小组(n＝15)品尝产品，并在0-100的标度上评估甜味强度。将每种处理过的产品与参考品(相同的溶液，不加热)进行比较品尝。所有的产品都有代码编号。如图4所示，dm13在95℃下的柠檬酸缓冲液中稳定30秒。
[0349]
在缓冲柠檬酸盐中于90℃热处理10分钟
[0350]
缓冲柠檬酸盐(ph3)在热混合器中预热至90℃。在90℃下，将dm13(浓度为5
°
bx异甜)加入到缓冲溶液中，并因此在此温度下保持1分钟、3分钟和10分钟。
[0351]
在相关时间后，溶液立即在冷冻机中冷却。
[0352]
专家小组品尝产品，并在0-100的标度上评估甜味强度。将处理过的产品与参考品(没有加热的相同溶液)进行比较品尝。所有的产品都有代码编号。如图3所示，dm13在90℃下的缓冲柠檬酸盐中稳定10分钟。
[0353]
dm13在21℃和32℃下8周后的甜味稳定性
[0354]
在21℃和32℃下，在缓冲柠檬酸盐(0.113％柠檬酸、0.016％柠檬酸三钠、99.9％水)中，对dm13的货架期稳定性进行了4周和8周的测试。dm13以5白利糖度当量(效能1:4000)加入。
[0355]
由专家小组品尝处理过的产品，并与新鲜溶液进行比较。如图5a和图5b所示，dm13在两种温度下稳定8周。
[0356]
实施例4：具有设计mnei(dm)蛋白的番茄酱和原味酸奶制剂
[0357]
具有dm蛋白的番茄酱制剂呈现在表5中。
[0358]
表5：基于dm09、dm28和dm31的番茄酱制剂(与普通番茄酱相比，69％添加的糖减少)
[0359][0360]
*根据蛋白溶液浓度的变化
[0361]
具有dm蛋白的酸奶制剂呈现在表6中。
[0362]
表6：基于dm09、dm28和dm31的酸奶(与普通全糖酸奶相比，33％添加的糖减少)
[0363][0364]
测试方法-味道蛋白专家小组
[0365]
使用受过训练的专家小组进行分析鉴别来确定所有的感官评估。感官专家小组是通过对潜在品尝者的筛选过程建立的。根据iso标准(is 8586-1)进行的筛选测试检查了品尝者的感官灵敏度、一致性和感觉记忆。该小组受过良好的训练和校准。所选择的小组定期接受训练，以保持高性能输出。
[0366]
番茄酱原型和原味酸奶原型的感官性状-测试程序：
[0367]
对于每个类别(番茄酱/原味酸奶)，由专家小组确定感官词汇。感官词汇是通过品尝该类别的大范围产品并提升描述该类别的所有相关感官属性而构建的。尽可能使用多样化语言来描述产品。
[0368]
掌握感官词汇后，选择将用于描述问卷中产品的关键属性。
[0369]
建立番茄酱和原味酸奶的感官性状：专门小组成员根据从词汇表中选择的所有属性，以固定参考点(0)对每个测试产品和参考进行双向评分(介于-3至+3之间)。当测试产品在特定属性(例如，更甜、更浓稠等)上被评估为比参考产品“更多”时，其得到正值(+1、+2或+3)，而当其在特定属性上被评估为比参考产品“更少”时(例如，不太甜、不太稠等)，其得到负值(-1、-2或-3)。在属性之前和之间，品尝者被要求用矿泉水漱口，吃一块无盐饼干和黄瓜，并且然后再喝水。
[0370]
结果
[0371]
番茄酱原型
[0372]
如图6所示，添加的糖69％减少的番茄酱原型与具有dm09的番茄酱原型相比，不太甜、更酸、更咸，并且在舌头上有更多的麻刺感。
[0373]
图7示出了添加的糖69％减少的番茄酱原型与具有全糖的番茄酱相比不太甜、更酸并且具有更浅的颜色。
[0374]
表明了具有dm09(添加的糖69％减少)的番茄酱具有与全糖番茄酱原型非常类似的感官性状(图8)。
[0375]
图9表明，与具有dm09的番茄酱相比，具有dm28的番茄酱具有类似的感官性状，除了具有更大的“晚发型”和更大的粘度。
[0376]
图18表明具有dm031的番茄酱(添加的糖69％减少)与具有dm09的番茄酱具有非常类似的感官性状。
[0377]
在一个月的货架期后，具有dm09的番茄酱没有失去其甜味。对于番茄酱来说，在一个月的货架期后，产品发生的变化是典型的(颜色更深、更调味、更酸、更浓稠、质地更不光滑)(图10)。
[0378]
酸奶原型
[0379]
如图11所示，具有添加的糖33％减少的原味酸奶比添加具有dm09和添加的糖33％减少的原味酸奶更不甜。
[0380]
图12表明，具有dm09(添加的糖33％减少)的原味酸奶具有与全糖酸奶原型类似的感官性状。
[0381]
如图13所示，具有dm28的草莓酸奶与具有dm09的草莓酸奶具有类似的感官性状，只是稍微有点酸。
[0382]
图19表明，具有dm31的草莓酸奶具有与具有dm09的草莓酸奶类似的感官性状。
[0383]
图14表明，在两周的货架期后，具有dm09的原味酸奶具有与具有dm09的新鲜原味酸奶类似的感官性状。
[0384]
实施例5：甜味剂的组合
[0385]
甜味剂的感官性状-测试程序：
[0386]
筛选了许多甜味剂和甜味剂组合。具有最佳结果的甜味剂组合是甜叶菊对甜叶菊+dm09，以及僧果与甜叶菊对僧果、甜叶菊和dm09的组合。每种甜味溶液的最终浓度相当于5
°
bx(在两种甜味剂的组合中，每种甜味剂的浓度相当于2.5
°
bx，并且在三种甜味剂的组合中，每种甜味剂的浓度相当于1.7
°
bx)。
[0387]
问卷中的感官属性是由专门小组成员的初步品尝确定的。
[0388]
建立每种甜味剂溶液的感官性状：专门小组成员在所选择的属性，以固定参考点(0)对每种测试溶液(甜味剂+dm09/dm28)和参考(不含dm09/dm28的甜味剂)进行双向评分(介于-3至+3之间)。当测试产品在特定属性(例如，更甜、更绵长等)上被评估为比参考产品“更多”时，其得到正值(+1、+2或+3)，而当其在特定属性上被评估为比参考产品“更少”时(例如，不太甜、不太具有余味等)，其得到负值(-1、-2或-3)。
[0389]
在品尝之前和之间，品尝者被要求用矿泉水漱口，吃一块无盐饼干和黄瓜，并且然后再喝水。
[0390]
柠檬风味饮料原型
[0391]
具有dm蛋白的柠檬风味饮料的制剂呈现在表7和表8中。
[0392]
表7：基于dm09的柠檬风味饮料
[0393][0394]
表8：基于dm09和甜叶菊的柠檬风味的饮料(10bx，50％添加的糖减少)
[0395][0396]
结果
[0397]
如图15所示，在相同的甜味水平当量下，具有甜叶菊和dm09的水溶液比单独具有甜叶菊的水溶液更甜。图16表明在相同的甜味水平当量下，与单独具有僧果和甜叶菊的水溶液相比，具有僧果、甜叶菊和dm09的组合的水溶液更甜，具有更短的“晚发型”。
[0398]
如图17所示，柠檬风味的饮料(用甜叶菊使添加的糖减少50％(5
°
bx当量)具有与甜叶菊和dm09(各自2.5
°
bx当量)非常类似的感官性状。
[0399]
实施例6：具有设计-莫奈林(dm)蛋白的口香糖原型
[0400]
口香糖通常由胶基、软化剂、甜味剂和风味剂构成。胶基是口香糖“咀嚼”的原因。其由食物级聚合物、蜡和软化剂组合而成，赋予口香糖期望的质地。
[0401]
具有dm蛋白的口香糖制剂呈现在表9中。
[0402]
表9：基于dm09的口香糖
[0403]
材料百分比山梨糖醇13-17％甘露糖醇9-14％麦芽糖醇浆3-8％安赛蜜0.05-0.5％三氯蔗糖0.05-0.5％胶基14-19％甘油2-4％风味剂1-3％大豆卵磷脂0.03-0.08％丁基化羟基苯甲醚0.4-0.9％水2-5％
麦芽糖糊精38-45％dm090.01-0.03％
[0404]
制备说明：
[0405]
首先，加热胶基，并且将熔化的物质放入混合器中。
[0406]
接下来，在不断混合期间逐渐加入成分1-13。
[0407]
然后，揉捏该物质以使口香糖光滑、成形和成型。
[0408]
将含有糖醇及人造甜味剂的参考口香糖样品与含有相同量的糖醇及人造甜味剂并添加了甜蛋白的口香糖样品进行比较。
[0409]
将0.01重量％-0.05重量％的甜蛋白添加到配方中。
[0410]
甜蛋白效能为4000-8000，相当于48白利糖度-56白利糖度。
[0411]
感官小组：
[0412]
使用受过训练的专家小组进行分析鉴别，建立口香糖的感官性状。
[0413]
专门小组成员在问卷中对每个测试口香糖产品的所有属性进行评级。在30秒、2分钟和4分钟后测量属性。
[0414]
在产品之前和之间，品尝者被要求用矿泉水漱口，吃一块无盐饼干和黄瓜，并且然后再喝水。
[0415]
结果
[0416]
如图20所示，咀嚼30秒后具有dm09的口香糖比不不具有dm09的口香糖更甜。
[0417]
实施例7：具有设计mnei(dm)蛋白的花生酱原型
[0418]
具有dm蛋白的花生酱制剂呈现在表10中。
[0419]
表10：基于dm09的花生酱
[0420]
成分全糖50％糖减少花生酱(g)80-10080-100脂肪(g)1-31-3nacl(g)0.1-0.30.1-0.3糖(g)4-61-3麦芽糖糊精(g)-2-4干燥dm09(g)-0.0006-0.0008纤维(g)-1-3卵磷脂(g)0-100-10
[0421]
将所有成分混合，直到混合物均质。
[0422]
结果
[0423]
如图21所示，具有dm09，50％糖减少的花生酱具有与全糖花生酱非常类似的感官性状。
[0424]
实施例8：具有设计mnei(dm)蛋白的冰咖啡原型
[0425]
具有dm蛋白的冰咖啡制剂呈现在表11中。
[0426]
表11：基于dm09的冰咖啡
[0427]
成分 咖啡(g)0.5-2
糖(g)1-3麦芽糖糊精(g)4-6dm 09(g)0.002-0.003牛奶(g)92
[0428]
将咖啡、糖、麦芽糖糊精和dm09混合成组合混合物。然后将7g-9g混合物与89g-94g牛奶混合，直到混合物均质。
[0429]
结果
[0430]
如图22所示，具有dm09(70％糖减少)的冰咖啡比不具有dm的冰咖啡(70％糖减少)更甜。
[0431]
实施例9：蔓越莓汁原型
[0432]
具有dm蛋白的蔓越莓汁的制剂呈现在表12至表15中。
[0433]
表12：dm09和基于甜叶菊的蔓越莓汁(40％糖减少)
[0434] 百分比1000ml蔓越莓汁50bx3-630-60(g)蔗糖4-840-80(g)dm09(5.14mg/ml)0.08-0.240.8-2.4(ml)reb m purecircle0.0025-0.0040.025-0.04(g)nacl0.02-0.060.2-0.6(g)水85-90850-900(g)总1001000.061
[0435]
表13：基于dm09和dm16的蔓越莓汁(40％糖减少(6obx))
[0436] 百分比1000ml蔓越莓汁50bx3-630-60(g)蔗糖4-840-80(g)dm09(5.14mg/ml)0.2-0.42-4(ml)dm16(5.8mg/ml)0.08-0.140.8-1.4(ml)nacl0.02－0.060.2-0.6(g)水85-90850-900(g)总1001000.1
[0437]
表14：基于dm28的蔓越莓汁(40％糖减少(6
°
bx))
[0438] 百分比1000ml蔓越莓汁50bx3-630-60(g)蔗糖4-840-80(g)dm28(9.6mg/ml)0.08-0.130.8-1.13(ml)reb m(purecircle)0.0028-0.00420.028-0.042(g)nacl0.02-0.060.2-0.6(g)水85-90850-900(g)总1001000.1
[0439]
表15：基于dm31的蔓越莓汁(40％糖减少(6
°
bx))
[0440][0441][0442]
结果
[0443]
图23表明，蔓越莓汁(40％糖减少，甜叶菊和dm09)具有与全糖蔓越莓汁相类似的甜味。图24表明具有dm28的蔓越莓汁比具有dm09的蔓越莓汁更甜。图25表明蔓越莓汁(40％糖减少、甜叶菊和dm31)与具有40％糖减少、甜叶菊和dm09的蔓越莓汁具有类似的感官性状。
[0444]
实施例10：蔓越莓干和桃皮原型
[0445]
具有dm蛋白的蔓越莓干的制剂呈现在表16至表18中。
[0446]
表16：具有dm蛋白的蔓越莓干(50％添加的糖减少和45％的糖+5％的果糖)
[0447][0448]
将蔓越莓以1:3的比率浸泡在浸渍糖浆中长达6小时，直到蔓越莓达到45
°
bx-60
°
bx(对于全糖应用)或20
°
bx-30
°
bx(对于dm应用)，然后将蔓越莓在70℃-120℃下烘干，直到它们达到70
°
bx-86
°
bx(对于全糖应用)或33
°
bx-45
°
bx(对于dm应用)。
[0449]
表17：具有dm蛋白的蔓越莓干(40％添加的糖减少)
[0450] 应用全糖(100g输液)具有dm的应用(100g输液)水(g)28-3550-6150白利糖度蔓越莓浓缩汁(g)4-64-8dm09(5.14mg/ml)(ml)—1.17-1.43nacl(g)0.03-0.070.03-0.07糖(g)53-7231-45
[0451]
将蔓越莓以1:3的比率浸泡在浸渍糖浆中长达6小时，直到它们达到45
°
bx-60
°
bx(对于全糖应用)或25
°
bx-38
°
bx(对于dm应用)，然后将蔓越莓在70℃-120℃下烘干，直到它们达到74
°
bx-84
°
bx(对于全糖应用)或42
°
bx-54
°
bx(对于dm应用)。
[0452]
表18：具有dm蛋白的蔓越莓干(50％添加的糖减少)
[0453][0454]
将蔓越莓以1:3的比率浸泡在浸渍糖浆中2小时-6小时，直到蔓越莓达到45
°
bx-60
°
bx(对于全糖应用)或20
°
bx-30
°
bx(对于dm应用)。蔓越莓然后在70℃-120℃下烘干。当蔓越莓达到70
°
bx-86
°
bx(全糖应用)或33
°
bx-45
°
bx(dm应用)时，干燥被视为完成。2小时后，将蔓越莓从烤箱中去除，并将混合物(麦芽糖糊精和干燥的dm09)喷洒在蔓越莓干上(混合物喷洒量相当于10％添加的糖-量从全糖配方中计算)。将蔓越橘放回烤箱，在70℃-120℃下进一步干燥10分钟-30分钟。
[0455]
dm09桃皮制剂呈现在表19中。
[0456]
表19：具有dm-09的桃皮原型
[0457][0458]
桃子被去皮，并且核被去除。去皮的桃子在食物加工机中与柠檬酸混合成光滑的糊状。然后将dm09加入到均质共混物中。将混合物倒入并抹平成均匀的薄层，并在40℃下在脱水烘箱中干燥9小时-10小时，直至其干燥。取出干燥的桃皮，并冷却。皮革被卷起来存放在气密容器里。
[0459]
结果
[0460]
图26表明，与蔓越莓干(50％糖减少)相比，蔓越莓干(50％糖减少和dm09)更甜。
[0461]
图27表明，具有dm09的桃皮比不具有dm09的桃皮更甜。
[0462]
实施例11：具有设计mnei(dm)蛋白的绿色冰茶原型
[0463]
具有dm蛋白的绿色冰茶制剂呈现在表20中。
[0464]
表20：基于dm09的冰茶
[0465]
成分40％糖减少*40％糖减少+dm09绿茶提取物**86-100(g)86-100(g)糖4.3-5.3(g)4.3-5.3(g)柠檬酸0.2-0.3(g)0.2-0.3(g)dm09(12.97mg/ml)-0.03-0.04(ml)reb-m-0.002-0.003(g)
[0466]
*全糖冰茶每100ml含8g糖
[0467]
**绿茶提取物是通过将绿茶袋浸泡在95℃的水中1.5分钟制成的。
[0468]
结果
[0469]
如图28所示，具有40％添加的糖减少+dm09和甜叶菊的绿色冰茶比不具有甜叶菊的具有40％添加的糖减少的绿色冰茶更甜的蜘蛛图。
[0470]
实施例12：具有设计mnei(dm)蛋白的马拉比原型
[0471]
含有dm蛋白的马拉比制剂呈现在表21中。
[0472]
表21：基于dm31的马拉比原型
[0473]
成分50％糖减少50％糖减少+dm31牛奶54-66(g)54-66(g)奶油22-28(g)22-28(g)糖2-3(g)2-3(g)玉米粉5-6(g)5-6(g)玫瑰水1-2(g)1-2(g)dm31(15.88mg/ml)-0.08-0.1(ml)水5-6(g)5-6(g)
[0474]
将牛奶、奶油、糖和玫瑰水加热至100℃。同时，玉米粉与水混合。当液体达到100℃时，加入玉米粉并混合。当温度降至60℃时，加入dm31并混合。甜点被倒进上菜的盘子里，并冷却。
[0475]
结果
[0476]
如图29所示，具有50％添加的糖减少+dm31的马拉比与具有50％添加的糖减少的马拉比相比更甜。
[0477]
实施例13：体外消化研究
[0478]
消化性研究的目的是确定用作甜味剂的dm蛋白在消化后在胃肠道中的去向。测试蛋白是dm31蛋白，通过在大肠杆菌(e.coli)bl21(de3)中精确发酵产生。
[0479]
体外消化静态模型根据infogest方案(nature protocols 14，991-1014(2019))进行。
[0480]
对在消化模型结束时获得的消化肽进行了计算机过敏性分析。
[0481]
消化周期包括口服消化(m)、胃消化(g)和十二指肠消化(d)。所用的消化酶：胃蛋白酶(在模拟胃液(sgf)-(2,000u/ml sgf)中制备)，消化十二指肠酶在模拟十二指肠液(sdf)-胰蛋白酶(100u/ml sdf)和糜蛋白酶(25u/ml sdf)中制备。阳性对照是一种已知的可完全消化的蛋白，即α-乳清蛋白。阴性对照不存在蛋白。
[0482]
所使用的样品分析：蛋白sds凝胶-在16.5％ sds page麦黄酮蛋白凝胶上运行每个消化阶段的蛋白样品，使用考马斯亮蓝染色。
[0483]
质谱肽识别：每个周期的两个重复，g和d，在smoller proteomics center，technion使用q-exact plus(thermo)通过lc-ms/ms进行分析，并通过discover软件针对dm和宿主微生物(大肠杆菌)数据库的序列进行识别。
[0484]
结果
[0485]
如图34所示，dm31蛋白在胃期结束时被部分消化，并且在十二指肠期结束时被完
全消化。使用infogest方案通过静态模型获得的结果清楚地表明了dm蛋白在生理消化过程中的消化。
[0486]
在dm-31消化期间，肠道内生成的肽没有过敏性风险。结果表明，dm-31消化与任何安全问题无关。

技术特征：
1.一种经修饰的单链莫奈林(mnei)蛋白，包含来自参考mnei蛋白的具有两个或更多个氨基酸缺失、插入、替换或它们的任何组合的氨基酸序列，其中所述经修饰的mnei蛋白与所述参考mnei蛋白相比具有至少一种改善的食物相关特性。2.根据权利要求1所述的经修饰的mnei蛋白，其中所述至少两个或更多个氨基酸缺失、替换或它们的任何组合位于所述参考mnei蛋白的表面上或所述参考mnei蛋白的核心中。3.根据权利要求1所述的经修饰的mnei蛋白，其中所述至少两个或更多个氨基酸缺失、插入、替换或它们的任何组合位于跨越残基46-56的经修饰的mnei蛋白环和β链边缘内。4.一种经修饰的mnei蛋白，包含与参考mnei蛋白具有介于40％至98％之间的同一性的氨基酸序列，其中与所述参考mnei蛋白相比，所述经修饰的mnei蛋白具有至少一种改善的食物相关特性。5.根据权利要求1至4中任一项所述的经修饰的mnei蛋白，具有低于以罗塞塔能量单位(reu)给出的-182的能量。6.根据权利要求1至5中任一项所述的经修饰的mnei蛋白，其中所述至少一种食物相关特性为甜味效能、甜味动力学、掩蔽效应、增强味道和变味中的至少一者。7.根据权利要求1至6中任一项所述的经修饰的mnei蛋白，与所述参考mnei蛋白相比具有至少1.5倍增加的甜味效能。8.根据权利要求1至7中任一项所述的经修饰的mnei蛋白，其特征在于与所述参考mnei蛋白相比具有以下特征中的至少一者：(1)增加的热稳定性，(2)增加的ph稳定性，(3)增加的溶解度，(4)减少的与疏水区的结合，(5)高压稳定性，和(6)增加的货架期稳定性。9.根据权利要求1至8中任一项所述的经修饰的mnei蛋白，其中所述经修饰的mnei蛋白包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seqid no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20和seq id no:21、或其片段或变体。10.根据权利要求1至9中任一项所述的经修饰的mnei蛋白，其中所述参考mnei蛋白包含在seq id no:45中提及的所述氨基酸序列。11.根据权利要求1至10中任一项所述的经修饰的mnei蛋白，或根据权利要求1至10中任一项所述的两个或更多个经修饰的mnei蛋白的任何组合，其用于制备用于口服递送的产品。12.根据权利要求11所述的经修饰的mnei蛋白或mnei蛋白的组合，其中所述产品为食物产品、食物补充产品或药物。13.根据权利要求1至10中任一项所述的经修饰的mnei蛋白，或根据权利要求1至10中任一项所述的两个或更多个经修饰的mnei蛋白的任何组合，其用作风味修饰剂、风味增强剂或风味掩蔽剂。14.根据权利要求1至10中任一项所述的经修饰的mnei蛋白，或根据权利要求1至10中任一项所述的两个或更多个经修饰的mnei蛋白的任何组合，其用作甜味剂。15.一种食物产品，包含根据权利要求1至10中任一项所述的经修饰的mnei蛋白，或根
据权利要求1至10中任一项所述的两个或更多个经修饰的mnei蛋白的任何组合。16.根据权利要求15所述的食物产品，包含至少一种食物成分。17.根据权利要求16所述的食物产品，其中所述食物成分是人造风味剂、食品添加剂、食物着色剂、防腐剂或甜味增强剂中的至少一者。18.根据权利要求17所述的食物产品，其中所述食物成分选自由以下各项组成的组：甜叶菊、蔗糖、龙舌兰蜜、糙米糖浆、枣糖、蜂蜜、枫糖浆、糖蜜、僧果、糖醇、稀有糖、阿斯巴甜、三氯蔗糖、乙酰磺胺酸钾、糖精、纽甜、申糖精和膳食纤维。19.一种增甜组合物，包含根据权利要求1至10中任一项所述的经修饰的mnei蛋白，或根据权利要求1至10中任一项所述的两个或更多个经修饰的mnei蛋白的任何组合。20.一种可摄取组合物，包含根据权利要求19所述的增甜组合物。21.根据权利要求20所述的可摄取组合物，其中所述可摄取组合物具有低血糖效应，并且呈液体食料或固体食料的形式。22.一种食物或饮料制剂，包含一种或多种经修饰的单链莫奈林(mnei)蛋白，其中所述一种或多种经修饰的mnei蛋白在每100gr或100ml介于约0.2mg和约30mg之间的范围内。23.根据权利要求22所述的食物或饮料制剂，其中所述制剂具有介于约2和约8.5之间的范围内的ph。24.根据权利要求22所述的食物或饮料制剂，其中所述经修饰的mnei蛋白包含与参考mnei蛋白具有40％至99％同一性的氨基酸序列，所述参考mnei蛋白包含seq id no:45中提及的序列。25.根据权利要求22所述的食物或饮料制剂，其中所述经修饰的mnei蛋白包含选自由seq id no:1-27或其片段或变体组成的组的氨基酸序列。26.一种经调配以供人类受检者消费的食物或饮料组合物，所述组合物包含根据权利要求22至25中任一项所述的制剂。27.根据权利要求26所述的饮料组合物，其中所述饮料选自由以下各项组成的组：碳酸软饮料、非碳酸软饮料、喷泉饮料、冷冻即饮饮料、咖啡饮料、茶饮料、乳制饮料、水果饮料、加味水、强化水、运动饮料、能量饮料、等渗饮料、低热量饮料和酒精饮料。28.根据权利要求26所述的食物组合物，其中所述食物选自由以下各项组成的组：烘焙产品、曲奇饼、饼干、烘焙混合物、谷物、甜食、软糖、太妃糖、口香糖、泡泡糖、乳制品、酸奶、调味酸奶、花生酱、酱油和其他大豆基产品、非乳制品、沙拉酱、番茄酱、蛋黄酱、醋、冷冻甜点、肉制品、鱼肉产品、瓶装食物和罐装食物、桌面甜味剂、巧克力、水果、干果和蔬菜。29.根据权利要求26所述的食物或饮料组合物，其中与具有所述参考mnei蛋白的食物或饮料组合物相比，所述组合物具有至少一种改善的食物或饮料相关特性。30.根据权利要求29所述的食物或饮料组合物，其中所述至少一种改善的食物或饮料相关特性选自由以下各项组成的组：更好的甜味特征、缩短的甜味余味、更好的甜味效能、更好的甜味动力学、增加的热稳定性、高压稳定性、增加的ph稳定性、减少的与疏水区的结合、改善的冻-融稳定性、改善的干燥后可重构性、增加的溶解度、更接近糖的感官性状和增加的货架期稳定性。31.根据权利要求26所述的食物或饮料组合物，包含至少一种附加的食物成分。32.根据权利要求31所述的食物或饮料组合物，其中所述食物成分选自由以下各项组
成的组：风味剂、食品添加剂、食物着色剂、防腐剂和甜味增强剂。33.根据权利要求31所述的食物或饮料组合物，其中所述食物成分选自由以下各项组成的组：甜叶菊、蔗糖、龙舌兰蜜、糙米糖浆、枣糖、蜂蜜、枫糖浆、糖蜜、甜菊糖苷、僧果、糖醇、稀有糖、阿斯巴甜、三氯蔗糖、乙酰磺胺酸钾、糖精、纽甜、申糖精和膳食纤维。34.根据权利要求26所述的食物或饮料组合物，其中所述食物或饮料组合物具有低血糖效应。35.根据权利要求27所述的饮料组合物，其中所述碳酸软饮料选自由以下各项组成的组：可乐、柠檬-酸橙风味的起泡饮料、橙子风味的起泡饮料、葡萄柚风味的起泡饮料、葡萄风味的起泡饮料、覆盆子风味的起泡饮料、草莓风味的起泡饮料、菠萝风味的起泡饮料、姜汁汽水、根啤酒和麦芽饮料。36.根据权利要求27所述的饮料组合物，其中所述非碳酸软饮料选自由以下各项组成的组：果汁、水果风味果汁、果汁饮料、花蜜、蔬菜汁、蔬菜风味果汁、运动饮料、能量饮料、蛋白饮料、含维生素的强化水、近水饮料、椰子汁、茶、咖啡、可可饮料、含牛奶组分的饮料、含谷物提取物的饮料和冰沙。37.一种减糖或无糖添加的软饮料，包含根据权利要求22所述的制剂。38.一种减糖或无糖添加的乳制品，包含根据权利要求22所述的制剂。39.一种减糖或无糖添加的酱产品，包含根据权利要求22所述的制剂。40.一种减糖或无糖添加的干果产品，包含根据权利要求22所述的制剂。41.一种减糖或无糖添加的口香糖产品，包含根据权利要求22所述的制剂。42.一种减糖或无糖添加的涂抹产品，包含根据权利要求22所述的制剂。43.一种减糖或无糖添加的糖浆产品，包含根据权利要求22所述的制剂。44.根据权利要求1所述的经修饰的单链莫奈林(mnei)蛋白，其中所述氨基酸缺失、取代、替换、接枝或它们的任何组合能够通过以下中的至少一者来稳定所述经修饰的蛋白的环区：(i)添加至少一个氢键，(ii)延伸保持所述环区的β链，(iii)降低所述环区处的相对德拜-沃勒因子，或(iv)它们的任何组合。45.根据权利要求44所述的经修饰的单链莫奈林(mnei)蛋白，其中所述稳定能够实现以下中的至少一者：(i)减少聚集，(ii)增加熔点温度，(iii)增加货架期稳定性，或(iv)它们的任何组合。

技术总结
本发明涉及一种经修饰的单链莫奈林(MNEI)蛋白，该经修饰的MNEI蛋白包含来自参考MNEI蛋白的具有两个或更多个氨基酸缺失、插入、替换或它们的任何组合的氨基酸序列，其中经修饰的MNEI蛋白与该参考MNEI蛋白相比具有至少一种改善的食物相关特性；并且涉及其在食物行业中的用途。物行业中的用途。物行业中的用途。


技术研发人员：宜兰
受保护的技术使用者：AMAI蛋白质有限公司
技术研发日：2021.12.21
技术公布日：2023/10/5