鸡环状RNAcircSLC2A13在促进鸡肌肉形成中的应用

鸡环状rna circslc2a13在促进鸡肌肉形成中的应用
技术领域
1.本发明涉及鸡育种技术领域，具体地，涉及鸡环状rna circslc2a13在促进鸡肌肉形成中的应用。


背景技术：

2.动物骨骼肌起源于中胚层的间充质干细胞，中胚层的间充质干细胞经历成肌细胞、肌管、肌纤维等阶段后逐渐形成的肌肉组织。骨骼肌发育的具体过程如下：在轴旁中胚层发育形成生肌节后，生肌节中的间充质干细胞发育成单核的成肌细胞；单核的成肌细胞融合成初级肌管和次级肌管；随着肌管内肌原纤维的增加，肌管的细胞核移动到细胞膜周边，然后肌管发育成肌纤维；肌纤维的继续生长并最终形成肌肉组织。通常情况下骨骼肌发育的前三个阶段在胚胎期已经完成，出生后肌纤维的数目不再增加，之后肌肉的生长主要是依靠肌纤维长度和直径的增加。由于肌纤维的生长发育与肌肉品质密切相关，所以骨骼肌的生长发育直接关系到家禽的产肉性能。
3.骨骼肌的生成过程是一个持续的发育过程，整个发育过程受到复杂严密的调控，任何调控异常都可能影响骨骼肌正常的发育过程。mirna是一类长度22nt左右的内源性非编码rna，一些mirna特异性表达于肌肉组织，如mir-133、mir-206、mir-1等，这些mirna大多受到肌细胞转录因子的调控或直接作用于与骨骼肌发育相关的基因，从而影响成肌细胞的增殖和骨骼肌的形成。mir-215-5p为mir-215家族中的重要成员，mir-215-5p可调控鸡心肌细胞和鸡脂肪细胞的增殖分化。目前对mir-34a的研究多集中于癌症方面。
4.环状rna(cricrna)是一类不含5’帽子和3’polya尾巴的闭合环状结构，由前体mrna反向剪接形成，属于内源性非编码rna范畴。circrna广泛存在于人体的各种器官中，有研究发现，circrna在骨骼肌的生长发育和成肌细胞的增殖、分化中扮演着重要的角色。ooyang等(欧阳宏佳.环状rna对鸡胚胎骨骼肌发育的影响[d].华南农业大学,2017.)对鸡不同发育时期的肌肉组织测序发现，外显子组成的环状rna上含有大量的mirna结合位点，其中，差异表达的circrbfox2可以作为mir-206分子海绵促进鸡成肌细胞的增殖，circsvil竞争性吸附mir-203促进细胞分化，circhipk3和circfgfr2也可发挥mirna海绵体功能，调控成肌细胞的增殖。
[0005]
鸡slc2a13位于1号染色体上，含有10个外显子，是溶质载体转运蛋白(so lute carrier，slc)家族中的一员。slc家族在氨基酸、葡萄糖、核苷酸等代谢物和必需营养物转运中发挥重要作用，广泛参与机体内各种基础生理代谢过程。但目前还未有鸡slc2a13对肌肉生长调控方面的报导。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供鸡环状rna circslc2a13在促进鸡肌肉形成中的应用。
[0007]
本发明的第一个目的是提供鸡环状rna circslc2a13在促进鸡肌肉形成中的应
用。
[0008]
本发明的第二个目的是提供鸡环状rna circslc2a13在促进成肌细胞的增殖和/或分化、鸡成纤维细胞增殖中的应用。
[0009]
本发明的第三个目的是提供含有鸡环状rna circslc2a13的重组载体在促进鸡肌肉形成中的应用。
[0010]
本发明的第四个目的是提供含有鸡环状rna circslc2a13的重组载体在促进成肌细胞和/或分化、鸡成纤维细胞增殖的增殖的应用。
[0011]
本发明的第五个目的是提供含有鸡环状rna circslc2a13的重组工程菌在促进鸡肌肉形成中的应用。
[0012]
本发明的第六个目的是提供含有鸡环状rna circslc2a13的重组工程菌在促进成肌细胞的增殖和/或分化、鸡成纤维细胞增殖中的应用。
[0013]
本发明的第七个目的是提供检测鸡环状rna circslc2a13表达量的试剂在鸡分子育种中的应用。
[0014]
本发明的第八个目的是提供检测鸡环状rna circslc2a13表达量的试剂在评估鸡肌肉率方面的应用。
[0015]
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
[0016]
鸡环状rna circslc2a13在促进鸡肌肉形成中的应用，所述鸡环状rna circslc2a13的核苷酸序列如seq id no：1所示。
[0017]
鸡环状rna circslc2a13在促进成肌细胞的增殖和/或分化、鸡成纤维细胞增殖中的应用，所述鸡环状rna circslc2a13的核苷酸序列如seq id no：1所示。
[0018]
含有鸡环状rna circslc2a13的重组载体在促进鸡肌肉形成中的应用，所述鸡环状rnacircslc2a13的核苷酸序列如seq id no：1所示。
[0019]
含有鸡环状rnacircslc2a13的重组载体在促进成肌细胞和/或分化、鸡成纤维细胞增殖的增殖的应用，所述鸡环状rna circslc2a13的核苷酸序列如seq id no：1所示。
[0020]
含有鸡环状rnacircslc2a13的重组工程菌在促进鸡肌肉形成中的应用，所述鸡环状rnacircslc2a13的核苷酸序列如seq id no：1所示。
[0021]
含有鸡环状rna circslc2a13的重组工程菌在促进成肌细胞的增殖和/或分化、鸡成纤维细胞增殖中的应用，所述鸡环状rna circslc2a13的核苷酸序列如seq id no：1所示。
[0022]
检测鸡环状rna circslc2a13表达量的试剂在鸡分子育种中的应用，所述鸡环状rnacircslc2a13的核苷酸序列如seq id no：1所示。
[0023]
其中，所述试剂可以为核苷酸如seq id no：2和3所示的引物。
[0024]
检测鸡环状rna circslc2a13表达量的试剂在评估鸡肌肉率方面的应用，所述鸡环状rna circslc2a13的核苷酸序列如seq id no：1所示。
[0025]
其中，所述试剂可以为核苷酸如seq id no：2和3所示的引物。
[0026]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0027]
本发明通过实验确定了circslc2a13广泛表达于麒麟鸡各个组织中，其中，在脾脏和肺脏中高表达，在胸肌和腿肌中低表达，在胚胎期的表达量高于出生后组织中的表达。circslc2a13的表达规律与slc2a13 mrna的表达规律趋势一致。在df-1细胞和成肌细胞分
别过表达circslc2a13，circslc2a13显著提高了df-1细胞活力和标记基因ccnd1的表达，促进了df-1细胞增殖。同样地，circslc2a13促进成肌细胞增殖和分化。
附图说明
[0028]
图1为鸡circslc2a13全长克隆及成环验证。其中a为circslc2a13成环位置扩增结果；泳道m：dl2000 maker；泳道1～2：以麒麟鸡肝脏组织cdna为模板pcr扩增结果；b为鸡circslc2a13成环位置测序结果；c为鸡circslc2a13全长结构跑胶；泳道m：dl2000 maker；泳道1～2；d：鸡circslc2a13全长结构示意图。
[0029]
图2为鸡circslc213和slc2a13 mrna的rnase r耐受性分析。数据为平均值以平均值
±
标准误表示，n＝4，*p＜0.05表示差异显著，**p＜0.01表示差异极显著。
[0030]
图3为鸡circslc2a13和slc2a13 mrna时空表达规律。其中a为麒麟鸡不同组织中circslc2a13的表达规律；b为麒麟鸡不同组织中slc2a13 mrna的表达规律；c为circslc2a13在胸肌中的表达规律；d为circslc2a13在腿肌中的表达规律；e为slc2a13 mrna在胸肌中的表达规律；f为slc2a13 mrna在腿肌中的表达规律。数据为平均值以平均值
±
标准误表示，n＝4，*p＜0.05表示差异显著，**p＜0.01表示差异极显著。
[0031]
图4为鸡circslc2a13在成肌细胞中核质定量分析。数据为平均值以平均值
±
标准误表示，n＝4，*p＜0.05表示差异显著，**p＜0.01表示差异极显著。
[0032]
图5为circslc2a13过表达载体验证及转染效率分析。其中，a为circslc2a13插入序列测序结果；b为df-1细胞中过表达circslc2a13后，circslc2a13表达情况；数据为平均值以平均值
±
标准误表示，n＝4，*p＜0.05表示差异显著，**p＜0.01表示差异极显著。
[0033]
图6为鸡circslc2a13对df-1细胞增殖的影响。其中a为转染pcd2.1-cir和pcd2.1-circslc2a13 48h后，edu实验结果；b为转染pcd2.1-cir和pcd2.1-circslc2a13 48h后，流式细胞术细胞周期分析；c为转染pcd2.1-cir和pcd2.1-circslc2a13 48h后，cck-8检测细胞增殖；d为转染pcd2.1-cir和pcd2.1-circslc2a13 48h后，增殖标记基因qrt-pcr实验结果。数据为平均值以平均值
±
标准误表示，n＝4，*p＜0.05表示差异显著，**p＜0.01表示差异极显著。
[0034]
图7为鸡circslc2a13对成肌细胞增殖的影响。其中，a为成肌细胞中，circslc2a13的过表达效率；b为成肌细胞转染pcd2.1-cir和pcd2.1-circslc2a13，cck-8实验结果；c为转染pcd2.1-cir和pcd2.1-circslc2a13 48h后，edu实验结果(100
×
)；数据为平均值以平均值
±
标准误表示，n＝4，*p＜0.05表示差异显著，**p＜0.01表示差异极显著。
[0035]
图8为细胞周期、qrt-pcr和western blot检测鸡circslc2a13对成肌细胞增殖的影响。其中，a为过表达circslc2a13后，流式细胞仪检测细胞周期；b为转染pcd2.1-cir和pcd2.1-circslc2a13 48h后，增殖标记基因定量结果；c为westorn blot检测增殖标记基因蛋白质表达量；数据为平均值以平均值
±
标准误表示，n＝4，*p＜0.05表示差异显著，**p＜0.01表示差异极显著。
[0036]
图9为鸡circslc2a13对成肌细胞分化的影响。其中，a为转染pcd2.1-cir和pcd2.1-circslc2a13，分化标记基因的变化；b为westorn blot实验结果；c为转染pcd2.1-cir和pcd2.1-circslc2a13，myhc细胞免疫荧光结果(200
×
)。数据为平均值以平均值
±
标准误表示，n＝4，*p＜0.05表示差异显著，**p＜0.01表示差异极显著。
mix(q711)、mirna universal sybr qpcr master mix(mq101)购自诺维赞，mirna-nc购自武汉金凯瑞。
[0042]
2、主要仪器
[0043]
cfx connect实时荧光定量pcr仪(bio-rad，美国)；verititm 96-well thermal cycler(abi，美国)；高速冷冻离心机(beckman，德国)；超低温mdf-u73v冰箱(sanyo，日本)；多功能酶链仪(方统，广州)；研磨器(洛尚，宁波)；恒温震荡器(is-rdv1，美国)；制冰机(圣海，苏州)；全自动孵化箱(威亚，德州)；冰箱(海尔，青岛)；1220tanon凝胶成像系统(天能，上海)；电热恒温水浴锅(一恒，上海)；涡旋混合器、桌面迷你型离心机(生工，上海)；dyy-6c型电泳仪(六一，北京)；超净工作台(净化、苏州)；graphpad prism 9软件。小型垂直电泳转印系统(伯乐，美国)，olympus荧光显微镜系统(奥林巴斯，日本)，mk3型酶标仪(热电，上海)，医用冷藏冷冻冰箱(海尔，青岛)，双人双面垂直工作台(智净，苏州)，二氧化碳细胞培养箱(博迅，上海)，全自动智能工业孵化机(威亚，德州)，掌上离心机(吉迪)，mx-s可调式混匀仪(蓝恒)，电子天平(良平，上海)，数显水平摇床(六一生物，北京)，生化培养箱(博迅，上海)，多功能酶链仪(方统，广州)，luc-pair
tm
duo-luciferase hs assay kit(a11ee1304)购自genecopoeia公司，mirna 1st strand cdna synthesis kit(mr101)、chamq universal sybr qpcr master mix(q711)、mirna universal sybr qpcr master mix(mq101)购自诺维赞，mirna-nc购自武汉金凯瑞。
[0044]
3、主要试剂配制
[0045]
lb液体培养基：取tryptone 10g，yest extract 10g，nacl 10g溶解于1l去离子水，加naoh调节ph至7.0，高温高压灭菌后加入抗生素，4℃保存。
[0046]
lb固体培养基：取tryptone 10g，yest extract 10g，nacl 10g，琼脂粉溶解于1l去离子水，加naoh调节ph至7.0，高温高压灭菌后加抗生素，4℃保存。
[0047]
rpmi 1640完全培养基：在rpmi medium 1640基础培养中加入20％的胎牛血清和1％的青霉素-链霉素，混匀后4℃保存。
[0048]
分化培养基：在rpmi medium 1640基础培养中加入2％的孕马血清和1％的青霉素-链霉素，混匀后4℃保存。
[0049]
实施例1鸡circslc2a13的全长克隆及表达特征分析
[0050]
一、实验方法
[0051]
1、鸡circslc2a13的全长克隆
[0052]
(1)引物设计
[0053]
鸡circslc2a13核苷酸序列如seq id no：1所示，用primer5.0设计引物，内参基因选用gapdh，具体引物信息见表1。
[0054]
表1鸡circslc2a13全长克隆，成环验证及定量引物信息
[0055]
[0056][0057]
(2)rna提取
[0058]
用hipure universal rna kit(r4130)美基提取麒麟鸡肝脏、心脏、胸肌、腿肌组织中rna，使用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性，分光光度计检测rna的纯度，置于-80℃冰箱中保存。
[0059]
(3)反转录及pcr
[0060]
用全式金的one-step gdna removal and cdna synthesis super mix进行rna反转录，得cdna。分两步程序：首先模板rna、试剂盒中的引物与去离子水混匀，65℃孵育5min后冰浴2min。再加入表2其它组分，第二步反应程序为：25℃孵育10min；42℃，15min；85℃，5s。
[0061]
表2鸡circslc2a13逆转录反应体系
[0062][0063]
以前述得到的cdna为模板，用表3的pcr体系进行pcr反应，引物为表1中的circslc2a13-full引物对。pcr反应程序为：94℃3min；94℃30s，tm30s，72℃30s，40cycles；72℃5min。克隆circslc2a13全长，测序。
[0064]
表3
[0065]
[0066][0067]
针对circslc2a13的成环位置设计对向引物(表1中的circslc2a13-d)，进行pcr扩增。pcr反应程序和体系与前述克隆circslc2a13全长相同。使用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，将含有目的条带的样品测序。
[0068]
用东盛生物的green qpcr mix进行实时荧光定量pcr反应，所用引物为表1中的circslc2a13-d和slc2a13-x，反应程序为：94℃3min；94℃15s，60℃15s，72℃20s，40个循环。内参基因为gapdh(引物见表1)。反应体系见表4，每条引物用量0.4μl。
[0069]
表4鸡circslc2a13 qpcr反应体系
[0070][0071]
2、鸡circslc2a13环状性质分析
[0072]
rnase r可以消化几乎全部的线性rna，但环状rna由于自身特殊的环状结构，不易被rnase r消化，为了探究circslc2a13对rnase r的耐受性，用rnase r对肝脏组织总rna消化，消化反应条件为：37℃10min，70℃10min。反应体系见表5。用前面所述的荧光定量pcr方法，检测经rnase r处理和未处理的circslc2a13和slc2a13 mrna的表达水平。
[0073]
使用前述获得的肝脏cdna模板，用前述的荧光定量pcr方法，检测circslc2a13的反转录效率，以此来分析circslc2a13的环状性质。
[0074]
表5鸡circslc2a13 rnase r消化体系
[0075][0076][0077]
3、鸡circslc2a13的时空表达规律与核质定量分析
[0078]
按照步骤1的方法，分别提取麒麟鸡14、16、18胚龄以及1～8周龄的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸肌和腿肌等组织总rna，逆转录获得cdna，用荧光定量pcr使用表1中circslc2a13-d、slc2a13-x和gapdh引物，检测circslc2a13和slc2a13 mrna在不同组织和
不同时间的表达水平。
[0079]
用cytoplasmic&nuclear rna purification kit试剂盒提取鸡原代成肌细胞中细胞质和细胞核rna，逆转录后按照上述方法进行qpcr实验。
[0080]
4、统计分析
[0081]
所有数值用平均值
±
标准误表示，每组设4个重复，使用graphpadprism9软件进行统计学分析，采用t检验分析数据。*p＜0.05表示差异显著，**p＜0.01表示差异极显著。
[0082]
二、实验结果
[0083]
1、在163bp位置处产生了符合预期结果的条带(图1中a)，测序结果表明circslc2a13成环位置包含slc2a13第2外显子和第5外显子序列(图1中b)，与高通量测序结果吻合。circslc2a13全长642bp(图1中c)，由slc2a13mrna的外显子2、外显子3、外显子4和外显子5环化而成(图1中d)。
[0084]
2、鸡circslc2a13环状性质分析
[0085]
在使用rnase r消化后的模板qpcr实验结果显示，slc2a13 mrna的表达量变化差异显著(p＜0.05)，而circslc2a13的表达量无明显变化(图2)。
[0086]
3、鸡circslc2a13的时空表达规律与核质定量分析
[0087]
circrna的表达量具有组织和时序特异性。circslc2a13在麒麟鸡不同组织中稳定表达(图3中a)，而且circslc2a13与slc2a13 mrna的组织表达规律趋于一致，两者都在1周龄麒麟鸡脾脏、肺脏中存在较高的表达水平，在胸肌和腿肌中的低表达(图3中b)。circslc2a13和slc2a13 mrna时序表达规律实验结果显示，circslc2a13在胚胎期存在较高的表达水平，而出生后表达量迅速下降(图3中c、d)。slc2a13 mrna分别在14胚龄的胸肌和16胚龄的腿肌高表达，出生后低表达(图3中e、f)。
[0088]
slc2a13 mrna在原代成肌细胞细胞核和细胞质均有分布，但差异不显著。鸡circslc2a13主要分布于细胞质中(图4)。
[0089]
实施例2鸡circslc2a13对鸡成纤维细胞(df-1)增殖分化的影响
[0090]
一、实验方法
[0091]
1、df-1细胞的培养与传代
[0092]
在37℃5％ co2的培养箱中，用含10％血清和1％双抗的dmem培养基培养df-1细胞，待细胞密度达到90％左右时进行传代、冻存等实验。具体操作步骤参考：冷奇颖.鸡circznf609蛋白编码能力分析及其在细胞增殖中的作用[d].广东海洋大学,2020.中的4.2.3。
[0093]
2、鸡circslc2a13过表达载体的构建
[0094]
环状rna过表达空载体为pcd2.1-cir，以实施例1中反转录的麒麟鸡肝脏组织的cdna为模板，在circslc2a13全长扩增引物的两端分别加上保护序列和kpn i和bamh i酶切位点(具体见表6)。再按照实施例1的方法，pcr扩增circslc2a13全长序列。用胶回收试剂盒将pcr扩增产物(即circslc2a13)纯化后，连接到pmd19-t载体，16℃孵育10～12h，连接体系见表7。然后将连接体系(即连接circslc2a13的pmd19-t载体，circslc2a13-t)转化大肠杆菌，具体转化步骤参考：冷奇颖.鸡circznf609蛋白编码能力分析及其在细胞增殖中的作用[d].广东海洋大学,2020.。第二天挑取单克隆菌落进行pcr阳性鉴定。
[0095]
用美基的去内毒素质粒提取试剂盒，提取单克隆阳性菌落的circslc2a13-t载体，
用kpn i和bamh i进行双酶切反应，37℃孵育1h，双酶切反应体系见表8。将双酶切后的产物(circslc2a13)切胶回收后，用t4 dna连接酶使circslc2a13与空载体pcd2.1-cir相连，4℃连接过夜，得到pcd2.1-circslc2a13，连接体系见表9。将pcd2.1-circslc2a13重新转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆菌落37℃扩繁后，菌液pcr阳性鉴定，将含有目的条带的菌液测序，使用25％甘油保存含有circslc2a13正确序列的菌液。
[0096]
表6circslc2a13过表达载体引物构建信息
[0097][0098]
注：加粗为酶切位点，下划线为保护序列。
[0099]
表7pmd19-t载体连接体系
[0100][0101]
表8双酶切反应体系
[0102][0103]
表9重组质粒连接体系
[0104][0105]
3、细胞增殖实验
[0106]
(1)细胞转染
[0107]
①
转染细胞培养：选择生长状态良好的细胞，待细胞密度达到90％以上时，用胰酶消化20s后，1000转离心5min，去除上清液，使用完全培养基制成细胞悬液，接种于12孔板
中，置于细胞培养箱中继续培养。
[0108]
②
用lipofectaminetm3000试剂盒进行转染：用100μl opti-mem培养基稀释2μl lipofectamine
tm
3000试剂，用100μl opti-mem培养基稀释2μg待转染dna和2μl p3000试剂，将稀释后的待转染dna加入到稀释的lipofectamine
tm
3000中，轻轻混匀，室温孵育15min，每孔加入100μl dna脂质体复合物，放入细胞培养箱中继续培养。
[0109]
(2)cck-8检测细胞增殖：取生长状态良好的df-1，接种于96孔板中，每个组设6个重复，待df-1细胞密度长至80％左右，用转染试剂分别转入pcd2.1-circslc2a13和pcd2.1-cir，分别培养0h、12h、24h、36h、48h和60h，每孔加入10μl cck-8检测试剂避光孵育2h，检测在450nm波长下的od值。
[0110]
(3)edu实验检测细胞增殖：
[0111]
①
将df-1细胞接种于12孔板，每个处理组设4个重复，待df-1细胞密度长至80％，转染pcd2.1-circslc2a13和pcd2.1-cir，培养48h后，每孔加入500μl edu培养基孵育2h，pbs清洗2次。
[0112]
②
在步骤
①
处理后的每孔加入250μl细胞固定液室温固定30min，然后加入0.25μl 2mg/ml的甘氨酸脱色摇床5min，pbs清洗5min，加入500μl 0.5％tritionx-100的pbs通透10min。
[0113]
③
向步骤
②
处理后的每孔加入500μl现配的apollo反应液，避光孵育30min，再次加入500μl 0.5％tritionx-100的pbs通透10min，pbs清洗一次。
[0114]
④
向步骤
③
处理后的每孔加入500μl hoechast 22242反应液，进行细胞核染色，室温避光孵育30min后，使用荧光显微镜观察拍照。
[0115]
(4)流式细胞术检测细胞周期：将df-1接种于12孔板，待df-1细胞密度长至80％，转染pcd2.1-circslc2a13和pcd2.1-cir，48h后用胰酶消化细胞，1000转离心5min，弃上清。用1ml预冷的pbs重悬细胞，1000转离心5min后弃上清。再次加入1.5ml的pbs，涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，4℃固定30min。将样品进行检测。
[0116]
5、分化标记基因的表达
[0117]
配置含有2％孕马血清的完全培养基诱导分化，提取细胞总rna、逆转录和荧光定量pcr实验检测分化标记基因的表达。
[0118]
具体步骤见实施例1，引物信息见表10。
[0119]
表10增殖和分化标记基因引物信息
[0120]
[0121][0122]
6、统计分析：与实施例1相同。
[0123]
二、实验结果
[0124]
1、鸡circslc2a13过表达载体构建及转染效率分析
[0125]
测序结果显示：circslc2a13成功连接到pcd2.1-cir上(图5中a)，基因定量结果显示鸡circslc2a13(pcd2.1-circslc2a13)在df-1细胞中显著过表达(图5中b)。
[0126]
2、鸡circslc2a13对df-1细胞增殖的影响
[0127]
edu实验结果表明，过表达circslc2a13可显著增加df-1阳性细胞的数量(图6中a)。细胞周期检测结果表明，与对照组(pcd2.1-cir)相比，过表达circslc2a13显著增加df-1细胞s期的细胞数量(图6中b)。cck-8实验结果表明，过表达circslc2a13的df-1细胞在培养36h和48h的活力显著高于对照组(图6中c)。过表达circslc2a13后cdk2和pcna的mrna表达水平无明显变化，而ccnd1的mrna的表达水平显著高于对照组(图6中d)。
[0128]
实施例3鸡circslc2a13对原代成肌细胞增殖分化的影响
[0129]
一、实验方法
[0130]
1、鸡原代成肌细胞的分离培养
[0131]
(1)取11胚龄左右的受精蛋，小心去除皮肤和骨骼，pbs清洗2次，20min剪碎腿肌20min。
[0132]
(2)步骤(1)将剪碎的腿肌转移至15ml的离心管中，加入3倍体积的胰酶，37℃消化20min，期间每隔5min摇晃一下，得胰酶消化体系。
[0133]
(3)向离心管加入与步骤(1)胰酶消化体系等倍体积的完全培养基终止消化，过100目的尼龙网筛，再过200目的尼龙网筛，过70μm滤芯后，收集滤液，移入新的50ml离心管。
[0134]
(4)将步骤(3)装有滤液的离心管，于1500转离心5min，去除上清液，收集细胞，用完全培养基重悬细胞至细胞培养皿中，于细胞培养箱中培养40min，进行第一次差速贴壁。转移上清液至新的培养皿中，再次培养40min，进行第二次差速贴壁，取细胞悬液至新的培养皿中，培养传代。
[0135]
原代成肌细胞的传代：待细胞密度达到90％以上后，胰酶消化20s，加入2倍体积的完全培养基终止消化，1000转离心5min后，去上清夜，加入2ml完全培养基重悬细胞转移至新的培养皿中继续培养。
[0136]
2、按照实施例2的方法构建鸡circslc2a13过表达载体
[0137]
3、细胞增殖实验方法与实施例2相同。
[0138]
4、细胞分化实验
[0139]
配置含有2％孕马血清的完全培养基诱导分化，用细胞免疫荧光、qpcr和western blot检测过表达组和对照组分化标记基因的表达。
[0140]
(1)myhc细胞免疫荧光实验：
[0141]
①
将成肌细胞接种于12孔板，待细胞生长至80％后转染pcd2.1-circslc2a13和pcd2.1-cir，继续培养细胞密度至90％，更换分化培养基诱导分化，得分化时期的细胞。
[0142]
②
取步骤
①
分化时期的细胞，用pbs将其清洗3次后，加入500μl 4％的多聚甲醛固定20min后，用pbs将其清洗三次，每孔加300μl免疫染色通透液室温通透10min，用pbs清洗3次，封闭液室温封闭60min。
[0143]
③
按照体积比1：100稀释myh6抗体，得稀释后的myh6抗体，向步骤
②
的每孔加入300μl一抗(稀释后的myh6抗体)，4℃孵育过夜。回收一抗，用pbs清洗3次，加入300μl fitc或cy3标记山羊抗兔，室温避光孵育60min，pbs清洗3次。每孔加入300μl dapi细胞核染色3min，用pbs清洗3次，用荧光显微镜进行拍照观察。
[0144]
(2)western blot实验：将pcd2.1-circslc2a13和pcd2.1-cir转染成肌细胞后，用ripa裂解液提取成肌细胞分化期的蛋白质并测定其浓度，与上样缓冲液体积比4：1混匀后，100℃变性3min，后续进行电泳，转膜，抗体孵育等步骤，具体步骤参考：冷奇颖.鸡circznf609蛋白编码能力分析及其在细胞增殖中的作用[d].广东海洋大学,2020.的4.2.4。
[0145]
(3)检测分化标记基因的表达实验与实施例2相同。
[0146]
5、统计分析：与实施例1相同。
[0147]
二、实验结果
[0148]
1、鸡circslc2a13对鸡成肌细胞增殖的影响
[0149]
circslc2a13的过表达效率显著高于对照组，slc2a13 mrna的表达量无明显变化(图7中a)。转染circslc2a13的成肌细胞培养48h后，细胞活力显著高于对照组(图7中b)，edu细胞阳性比例差异显著(图7中c)，表明circslc2a13可以促进细胞增殖。
[0150]
流式细胞检测结果显示，过表达circslc2a13成肌细胞的s期数量显著增多(图8中a)，qrt-pcr和western blot实验检测增殖标记基因的表达，结果显示，过表达circslc2a13的组的增殖标记基因ccnd1在mrna和蛋白质水平表达量都显著提高，而cdk2和pcna的表达量无明显变化(8中b、c)。以上实验证明鸡circslc2a13促进成肌细胞增殖。
[0151]
2、鸡circslc2a13对成肌细胞分化的影响
[0152]
过表达circslc2a13显著促进分化标记基因myog和myhc的表达，而myomaker的表达量无明显变化，并且myhc蛋白的表达量显著高于对照组(图9中a、b)。细胞免疫荧光实验结果显示，与对照组相比，过表达circslc2a13显著促进myhc的表达量和肌管的形成(图9中c)。以上结果说明circslc2a13促进成肌细胞分化。
[0153]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的
精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

技术特征：
1.鸡环状rna circslc2a13在促进鸡肌肉形成中的应用，其特征在于，所述鸡环状rna circslc2a13的核苷酸序列如seq id no：1所示。2.鸡环状rna circslc2a13在促进成肌细胞的增殖和/或分化、鸡成纤维细胞增殖中的应用，其特征在于，所述鸡环状rna circslc2a13的核苷酸序列如seq id no：1所示。3.含有鸡环状rna circslc2a13的重组载体在促进鸡肌肉形成中的应用，其特征在于，所述鸡环状rna circslc2a13的核苷酸序列如seq id no：1所示。4.含有鸡环状rna circslc2a13的重组载体在促进成肌细胞和/或分化、鸡成纤维细胞增殖的增殖的应用，其特征在于，所述鸡环状rna circslc2a13的核苷酸序列如seq id no：1所示。5.含有鸡环状rna circslc2a13的重组工程菌在促进鸡肌肉形成中的应用，其特征在于，所述鸡环状rna circslc2a13的核苷酸序列如seq id no：1所示。6.含有鸡环状rna circslc2a13的重组工程菌在促进成肌细胞的增殖和/或分化、鸡成纤维细胞增殖中的应用，其特征在于，所述鸡环状rna circslc2a13的核苷酸序列如seq id no：1所示。7.检测鸡环状rna circslc2a13表达量的试剂在鸡分子育种中的应用，其特征在于，所述鸡环状rna circslc2a13的核苷酸序列如seq id no：1所示。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂为核苷酸如seq id no：2和3所示的引物。9.检测鸡环状rnacircslc2a13表达量的试剂在评估鸡肌肉率方面的应用，其特征在于，所述鸡环状rna circslc2a13的核苷酸序列如seq id no：1所示。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述试剂为核苷酸如seq id no：2和3所示的引物。

技术总结
本发明公开了鸡环状RNA circSLC2A13在促进鸡肌肉形成中的应用。本发明通过实验确定了circSLC2A13表达于麒麟鸡组织中，在脾脏和肺脏中高表达，在胸肌和腿肌中低表达，在胚胎期的表达量高于出生后组织中的表达。circSLC2A13的表达规律与SLC2A13mRNA的表达规律趋势一致。在DF-1细胞和成肌细胞分别过表达circSLC2A13，circSLC2A13显著提高了DF-1细胞活力和标记基因CCND1的表达，促进DF-1细胞增殖。同样，circSLC2A13促进成肌细胞增殖和分化。化。化。


技术研发人员：张丽 焦振海 林树带 安立龙 效梅 王晓彤 郭东雪 李磊
受保护的技术使用者：广东海洋大学
技术研发日：2023.06.19
技术公布日：2023/10/5