通过SIRP-α衔接体的先天免疫细胞沉默

通过sirp-α
衔接体的先天免疫细胞沉默
1.i.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35u.s.c.
§
119(e)要求对于2020年12月7日提交的美国临时申请号63/122,465的优先权，所述临时申请通过提及而以其整体合并入本文。
3.ii.发明领域
4.本发明提供了当与具有未修饰的sirpα衔接(engagement)功能的亲本细胞相相比较时具有增加的信号调节蛋白α(sirpα；signal regulatory protein alpha)衔接功能的细胞(sirpα衔接体(engager)细胞)，其在被移植到受试者中时抵抗先天免疫。在一些实施方案中，所述sirpα衔接体细胞为低免疫性细胞。在另一些实施方案中，所述sirpα衔接体细胞为经分化的体细胞。在另一些实施方案中，所述sirpα衔接体细胞为低免疫性多能(hip)细胞。在进一步的实施方案中，所述hip细胞是o血型的(hipo)，猕猴因子(rh)阴性的(hip-)，或者o血型和rh-的(hipo-)。在另一些实施方案中，所述sirpα衔接体细胞衍生或分化自hip、hip-或hipo-细胞。在另一些实施方案中，所述sirpα衔接体细胞包含抗体fc受体以针对抗体依赖性细胞毒性(adcc)或补体依赖性细胞毒性(cdc)进行保护。
5.iii.发明背景
6.天然杀伤细胞或nk细胞是对于先天免疫系统来说关键性的细胞毒性淋巴细胞。nk细胞所起的作用与细胞毒性t细胞在脊椎动物适应性免疫应答中的那种类似。nk细胞提供了对于受病毒感染的细胞和癌症细胞的快速应答。典型地，nk细胞通过下调主要组织相容性复合体(mhc)的靶细胞而变成是激活的，因为mhc是一个主要的抑制性nk细胞信号。nk细胞激活触发细胞因子释放，从而导致裂解或凋亡。nk细胞是独特的，因为它们可以识别受应激的细胞，因为它们上调其他刺激性nk细胞信号并且不需要事先暴露于某些细胞表位。这使得它们是非常快速的应答者。它们也可以快速地对于负载有抗体的细胞作出应答，因为游离抗体fc的结合是强的刺激性nk细胞信号。nk细胞不需要大的激活来杀伤丢失i类mhc的“自我”标志物而不是一些细胞因子暴露例如il-2或il-15的细胞。该作用是尤其重要的，因为已经下调或丢失mhc i标志物的有害细胞无法被其他免疫细胞例如t淋巴细胞检测和破坏。
7.nk细胞是从生成b和t淋巴细胞的共同的淋巴祖细胞分化出的大的颗粒淋巴细胞。它们在骨髓、淋巴结、脾脏、扁桃体和胸腺中分化和成熟，然后它们从那里进入循环。
8.sirpα是信号调节蛋白(sirp)家族的成员并且也属于免疫球蛋白超家族。sirp家族成员是已知在受体酪氨酸激酶偶联的信号传导过程的负调节中所牵涉的受体型跨膜糖蛋白。sirpα可以被酪氨酸激酶磷酸化。磷酸酪氨酸残基募集包含sh2结构域的酪氨酸磷酸酶(ptp)并且充当其底物。sirpα参与由各种生长因子受体介导的信号转导。
9.cd47是关于sirpα的配体。cd47是可以横跨肿瘤类型广泛地过表达的“自我标志物(marker-of-self)”蛋白。它作为用于癌症免疫疗法的新的强有力的巨噬细胞免疫检查点而出现。在肿瘤细胞中的cd47发送“不要吃我”信号，其抑制巨噬细胞吞噬作用。这为cd47抑制剂提供了机会和挑战，作为用于血液学癌症和实体肿瘤的单一疗法和联合治疗。这些试剂中的一些目前处于临床试验中。
10.cd47的胞质信号传导可以由通过其细胞内结构域(icd)来介导，虽然迄今还很少鉴定到与cd47胞质尾区直接相互作用的蛋白质(lamy l.,j biol chem.278:23915-21(2003)；wu a.l.,mol cell.4:619-25(1999))。遍在蛋白相关性早老作用蛋白(ubiquilin)-1(一种此类结合伙伴)结合gβγ并且由此将异三聚体g蛋白系缚至cd47(n'diaye e.n,.j cell biol.163:1157-65(2003))。在该情景下，遍在蛋白相关性早老作用蛋白-1抑制由gi-偶联的受体cxcr4传导信号的趋化作用(sick e.,glia.59:308-19(2011))。上述文献通过提及而以其整体合并入本文。
11.人原代nk细胞显示出在刺激后表达sirpα并且与cd47相结合。这降低了其对于表达cd47的细胞的杀伤效力(参见pct/us20/39220，其通过提及而以其整体合并入本文)。
12.自体的诱导型多能干细胞(ipsc)在理论上构成用于基于患者特异性细胞的器官修复策略的无限细胞源。然而，它们的生成具有技术和制备挑战，并且是一个在概念上阻止任何急性治疗样式的漫长过程。基于同种异体的ipsc的疗法或基于胚胎干细胞的疗法从制备角度来说是更容易的，并且允许生成经充分筛选的、经标准化的、高质量的细胞产品。因为多能干细胞可以分化为三个胚层中的任何细胞类型，因此干细胞疗法的潜在应用是广范围的。分化可以离体或在体内进行，通过移植将会在植入位点的器官环境中继续分化和成熟的祖细胞。离体分化允许研究者或临床医生紧密地监测操作程序并且确保在移植之前生成恰当的细胞群体。然而，由于其同种异体来源，此类细胞产品可能经历排斥。
13.iv.发明概述
14.本发明提供了当与具有未修饰的sirpα衔接功能的亲本细胞相相比较时具有增加的信号调节蛋白α(sirpα)衔接功能的细胞(sirpα衔接体细胞)，其在被移植到受试者中时抵抗先天免疫。在一些实施方案中，所述sirpα衔接体细胞为低免疫性多能(hip)细胞。在进一步的实施方案中，所述hip细胞是o血型的(hipo)，猕猴因子(rh)阴性的(hip-)，或者o血型和rh-的(hipo-)。在另一些实施方案中，所述sirpα衔接体细胞衍生或分化自hip、hip-或hipo-细胞。
15.因此，本发明提供了sirp-α衔接体细胞，其包含与在免疫细胞上的信号调节蛋白α(sirpα)这种蛋白质相衔接的在细胞表面上的衔接体分子，其中所述衔接阻止所述衔接体细胞被所述免疫细胞杀伤，其中所述细胞表面分子缺乏有功能的cd47细胞内结构域。
16.在本发明的一些方面，所述衔接体分子为蛋白质。在另一些方面，所述蛋白质为融合蛋白。在另一些方面，所述融合蛋白包含cd47细胞外结构域(ecd)。在另一些方面，所述cd47 ecd与seq id no:3具有至少90％序列同一性。在一个优选的方面，所述cd47 ecd包含seq id no:3的序列。
17.在本发明的一些方面，所述sirp-α衔接体细胞包含免疫球蛋白超家族结构域。在另一些方面，所述免疫球蛋白超家族结构域与seq id no:4具有至少90％序列同一性。在一个优选的方面，所述免疫球蛋白超家族结构域包含seq id no:4的序列。
18.在本发明的一些方面，所述衔接体分子包含与sirpα相结合的抗体fab或单链可变片段(scfv)。在另一些方面，所述fab或scfv以通过其解离常数(kd)而测量的亲和力与sirpα相结合，其中所述kd在大约10-7
和10-13
m之间。
19.在本发明的一些方面，所述衔接体分子包含一个或多个与sirpα相结合的抗体互补性决定区(cdr)。在另一些方面，所述一个或多个cdr与seq id no:5至12中任一个具有至
少90％序列同一性。在优选的方面，所述一个或多个cdr包含seq id no:5至12中任一个的序列。在另一些方面，所述一个或多个cdr与seq id no:5具有至少90％序列同一性。在优选的方面，所述一个或多个cdr包含seq id no:5的序列。在另一些方面，所述一个或多个cdr与seq id no:9具有至少90％序列同一性。在优选的方面，所述一个或多个cdr包含seq id no:9的序列。
20.在本发明的一些实施方案中，所述衔接体分子为包含异源跨膜结构域(tmd)的融合蛋白。在另一些方面，所述tmd包含单个α螺旋、多个α螺旋或卷起的β片层。在另一些方面，所述异源tmd选自由下列各项组成的组：cd85f、cd349、cd284、cd261、cd172b、cd277、cd186、cd156c、cd304、cd254、cd263、cd267、cd337、cd170、cd283、cd133、cd327、cd205、cd232、cd282、cd16b、cd85i、cd85a、cd85c、cd275、cd108、cd358、cd335、cd218b、cd355、cd336、cd160、cd25、cd4、cd8a、cd235a、cd233、cd230、cd90、cd74、cd3d、cd340、cd236、cd61、cd18、cd54、cd29、cd1a、cd5、cd220、cd2、cd66e、cd51、cd141、cd115、cd42b、cd221、cd271、cd55、cd243、cd98、cd10、cd41、cd14、cd45、cd228、cd16a、cd49e、cd126、cd63、cd48、cd7、cd140b、cd3g、cd117、cd28、cd8b、cd37、cd11b、cd107a、cd331、cd222、cd20、cd79a、cd64、cd32、cd143、cd324、cd42c、cd107b、cd56、cd102、cd49d、cd66a、cd142、cd59、cd62l、cd121a、cd122、cd13、cd155、cd119、cd19、cd116、cd46、cd1e、cd1d、cd227、cd44、cd62p、cd104、cd43、cd140a、cd31、cd152、cd326、cd62e、cd36、cd127、cd49b、cd105、cd35、cd223、cd138、cd325、cd58、cd106、cd53、cd120a、cd224、cd21、cd33、cd22、cd120b、cd11a、cd11c、cd363、cd73、cd88、cd204、cd332、cd9、cd203a、cd334、cd333、cd206、cd49f、cd238、cd252、cd89、cd124、cd181、cd182、cd24、cd95、cd40、cd49c、cd159a、cd159c、cd314、cd27、cd123、cd26、cd82、cd121b、cd34、cd38、cd30、cd1b、cd1c、cd154、cd6、cd52、cd132、cd32、cd66b、cd171、cd191、cd197、cd185、cd131、cd50、cd70、cd153、cd144、cd80、cd362、cd68、cd361、cd147、cd309、cd135、cd292、cd103、cd130、cd42d、cd66d、cd66c、cd96、cd110、cd79b、cd200、cd192、cd231、cd86、cd212、cd118、cd146、cd134、cd158a、cd158b1、cd158b2、cd158e、cd158k、cd158j、cd158i、cd178、cd295、cd151、cd97、cd183、cd39、cd239、cd193、cd194、cd195、cd196、cdw198、cdw199、cd296、cd298、cd49a、cd322、cd85g、cd184、cd172a、cd156a、cd339、cd156b、cd213a1、cd129、cd83、cd125、cd241、cd269、cd202b、cd87、cd164、cd136、cd137、cd249、cd69、cd91、cdw210b、cd167a、cd300c、cd47、cd157、cd317、cd148、cd161、cd215、cd150、cd11d、cd218a、cd210、cd166、cd162、cd213a2、cd242、cd158g、cd158h、cd279、cd111、cd281、cd226、cd234、cd167b、cd300e、cd276、cd305、cd300g、cd300d、cd109、cd272、cd163、cd302、cd158f1、cd85h、cd85d、cd177、cd158z、cd158f2、cd85j、cd300f、cd92、cd351、cd112、cd100、cd270、cd101、cd297、cd316、cd352、cd217、cd307b、cd307a、cd307c、cd307d、cd307e、cd114、cd180、cd158d、cd273、cd290、cd244、cd169、cd299、cd318、cd360、cd229、cd248、cd354、cd320、cd93、cd319、cd113、cd163b、cd289、cd288、cd329、cd274、cd353、cd172g、cd315、cd280、cd264、cd300a、cd312、cd84、cd344、cd350、cd246、cd201、cd338、cd208、cd257、cd328、cd286、cd357、cd294、cd321、cd265、cd278、itga7、itga8、itga9、itga10、itga11、cd51、cd41、cd29、cd18、cd61、cd104和pdgf。
21.在另一些方面，所述tmd包含与seq id no:13、seq id no:14或seq id no:27具有至少90％序列同一性的序列。在优选的方面，所述tmd包含seq id no:13、seq id no:14或
seq id no:27的序列。
22.在本发明的一些方面，所述衔接体分子不具有细胞内结构域(icd)。在本发明的另一些方面，所述衔接体分子具有来自cd16、cd32、cd64、cd8、cd3、cd28或cd137的细胞内结构域。在本发明的另一些方面，所述衔接体分子包含icd，所述icd包含由于在seq id no:15序列中的一个或多个突变而产生的无功能的cd47icd。在本发明的另一些方面，所述衔接体分子包含icd，所述icd包含由于在seq id no:15序列中的一个或多个缺失或插入而产生的无功能的cd47 icd。
23.在本发明的一些方面，所述衔接体分子具有一个或多个联结ecd、tmd或icd序列的连接体或铰链区。
24.在本发明的另一些方面，所述tmd来自7次跨膜蛋白(7tm)或免疫球蛋白细胞表面蛋白。
25.在本发明的一些方面，所述细胞表面蛋白为抗体、受体、配体或黏着蛋白。在另一些方面，所述sirpα衔接体细胞产生自锚固到所述细胞表面上的cd47融合蛋白。在另一些方面，所述衔接体分子经由来自免疫球蛋白g(igg)的cd64相互作用结构域与cd64相互作用。
26.在本发明的一些方面，所述衔接体分子包含与seq id no:20或seq id no:22具有至少90％序列同一性的蛋白质。在优选的方面，所述衔接体分子包含具有seq id no:20或seq id no:22的序列的蛋白质。
27.在本发明的一些方面，所述衔接体分子包含与seq id no:23或seq id no:24具有至少90％序列同一性的蛋白质。在优选的方面，所述衔接体分子包含具有seq id no:23或seq id no:24的序列的蛋白质。
28.在本发明的一些方面，所述衔接体分子包含与seq id no:28具有至少90％序列同一性的蛋白质。在优选的方面，所述衔接体分子包含具有seq id no:28的序列的蛋白质。
29.在本发明的一些方面，在本文中所公开的sirp-α衔接体细胞进一步包含减少或消除的hla-i或hla-ii表达。在另一些方面，所述细胞是abo血型o型的。在另一些方面，所述细胞是猕猴因子阴性的(rh-)。在另一些方面，所述细胞具有减少或消除的从由下列各项组成的组中选择的abo血型抗原：a1、a2和b。在另一些方面，所述细胞具有减少或消除的从由下列各项组成的组中选择的rh蛋白抗原表达：rh c抗原、rh e抗原、kell k抗原(kel)、duffy(fy)fya抗原、duffy fy3抗原、kidd(jk)jkb抗原、mns抗原u和mns抗原s。
30.在本发明的一些方面，在本文中所公开的sirp-α衔接体细胞为低免疫原性(hi)细胞，其包含：当与未修饰的亲本细胞相比较时降低的内源性i类主要组织相容性复合体(hla-i)功能，和当与所述未修饰的亲本细胞相比较时降低的内源性ii类主要组织相容性复合体(hla-ii)功能。
31.在本发明的一些方面，在本文中所公开的sirp-α衔接体细胞包含相对于野生型干细胞而言下列中的一种或多种的经调制的表达：hla-i人白细胞抗原、hla-ii人白细胞抗原、cd64、cd47、cd38、ccr5、cxcr4、nlrc5、ciita、b2m、hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-g、pd-l1、ctla-4-ig、cd47、ci-抑制剂、il-35、rfx-5、rfxap、rfxank、nfy-a、nfy-b、nfy-c、irf-1、ox40、gitr、4-1bb、cd28、b7-1、b7-2、icos、cd27、hvem、slam、cd226、pd1、ctl4、lag3、tigit、tim3、cd160、btla、cd244、cd30、tlt、vista、b7-h3、pd-l2、lfa-1、cd2、cd58、icam-3、tcra、tcrb、foxp3、helios、st2、pcsk9、apoc3、cd200、faslg、clc21、mfge8、serpin b9、tgf
β、cd73、cd39、lag3、il1r2、ackr2、tnfrsf22、tnfrsf23、tnfrs10、dad1和/或ifnγr1 d39，其中所述衔接体细胞是abo血型o型的或猕猴因子阴性的(rh-)。
32.在本发明的一些方面，在本文中所公开的sirp-α衔接体细胞进一步包含在细胞表面上的抗体fc受体的升高的表达，其中所述fc受体帮助逃避抗体依赖性细胞毒性(adcc)或补体介导的细胞毒性(cdc)。在一些方面，所述fc受体为cd16、cd32或cd64。
33.在本发明的一些方面，在本文中所公开的sirp-α衔接体细胞是多能的。在另一些方面，所述sirp-α衔接体细胞为低免疫性多能(hip)细胞。在另一些方面，它们为具有abo血型o的低免疫性多能细胞(hipo)，或者为rh因子阴性的低免疫性多能细胞(hip-)。在优选的方面，在本文中所公开的sirp-α衔接体细胞具有abo血型o并且是rh因子阴性的(hipo-)。在另一些方面，在本文中所公开的sirp-α衔接体细胞为多能干细胞(psc)、诱导型psc(ipsc)或胚胎干细胞(esc)。
34.在本发明的一些方面，在本文中所公开的sirp-α衔接体细胞是特定组织类型的。在另一些方面，所述细胞为嵌合抗原受体(car)细胞、t细胞、nk细胞、内皮细胞、多巴胺能神经元、心脏细胞、胰岛细胞或视网膜色素上皮细胞。在优选的方面，所述car细胞为car-t或car-nk细胞。
35.在本发明的一些方面，在本文中所公开的sirp-α衔接体细胞分化自多能细胞。
36.本发明提供了药学组合物，其包含在本文中所公开的sirp-α衔接体细胞，和在药学上可接受的承载体。
37.本发明提供了药物，其包含在本文中所公开的sirp-α衔接体细胞，和在药学上可接受的承载体。
38.本发明提供了在受试者中治疗疾病的方法，其包括将在本文中所公开的sirp-α衔接体细胞移植到所述受试者中。在一些实施方案中，所述疾病为1型糖尿病、心脏疾病、神经学疾病、内分泌疾病、癌症、失明或血管疾病。
39.本发明提供了在本文中所公开的sirp-α衔接体细胞在制备药学组合物中的用途，所述药学组合物用于在受试者中治疗疾病。
40.本发明提供了在本文中所公开的sirp-α衔接体细胞用于在受试者中治疗疾病的用途。在一些方面，所述疾病为1型糖尿病、心脏疾病、神经学疾病、内分泌疾病、癌症、失明或血管疾病。
41.v.附图简述
42.图1a至1c显示了针对p815的重定向抗体依赖性细胞毒性测定法。图1a显示了用il-2刺激72小时的原代人cd3-cd7+cd56+nk细胞。sirpα表达通过流式细胞术来进行评估(两个独立实验的代表性直方图)。在图1b和1c中，向表达萤火虫萤光素酶(fluc+)的靶p815细胞添加这些经刺激的cd3-cd7+cd56+nk细胞并且通过生物发光成像(bli)来评估靶细胞杀伤。靶细胞杀伤与bli信号的下降相关。在一些情况下，与针对cd16(图1b)或nkg2d(图1c)的激活性抗体一起添加nk细胞。抗-sirpα抵消激活信号的效应通过与激活性抗体同时地给予它来进行评估。针对cd56(其在nk细胞上表达但不具有激活或抑制途径)的抗体充当对照(平均值
±
s.d.，三个独立实验/组，具有bonferroni事后检验的anova)。抗-sirpα抗体不仅完全取消了经由cd16或nkg2d的激活性刺激，而且它还阻止了任何针对p815靶标的细胞毒性nk细胞功能。
43.图2显示了sirpα衔接体功能的原理。结合至靶细胞表面的抗-sirpα抗体(sirpα衔接体)阻止hla-缺陷型靶细胞的nk细胞杀伤。将表达cd64的fluc+人b2m-/-ciita-/-ipsc-衍生的内皮细胞(iec)与抗-sirpα抗体一起进行温育，所述抗-sirpα抗体被cd64捕获和结合并因此覆盖细胞表面。将这些细胞，以及对照即b2m-/-ciita-/-ipsc-衍生的ec，与用il-2刺激72小时的cd3-cd7+cd56+nk细胞一起进行温育。通过bli来评估靶细胞杀伤(平均值
±
s.d.，3个独立实验/组，student's t检验)。在b2m-/-ciita-/-cd64转基因(tg)iec细胞上的所捕获的抗-sirpα抗体衔接nk细胞sirpα并且抑制细胞毒性nk细胞应答。
44.图3.所述sirpα衔接体是合成的融合蛋白，其在经改造的细胞上表达。所述融合蛋白的组成为：细胞外结构域(ecd)，跨膜结构域(tmd)，并且可以或可以不包含细胞内结构域(icd)。所述结构域可以直接地或经由连接体连接在一起。所述sirpα衔接体融合蛋白的ecd以激动方式与在免疫细胞上的sirpα相衔接，这导致sirpα信号传导，具有相关联的免疫细胞效应子功能的抑制。所述tmd将该蛋白质锚固在细胞膜中。任选的icd可以在经改造的细胞中提供信号传导，如果这样的信号传导有益于所述经改造的细胞的功能性。
45.图4.表达cd47-cd64杂合蛋白的fluc+b2m-/-ciita-/-iec细胞被保护免于被用il-2刺激72小时的原代人nk细胞杀伤。将保护作用记录为当与fluc+b2m-/-ciita-/-iec细胞相比较时更小的bli信号下降。cd47-cd64杂合肽的表达输送了一些免疫保护。
46.图5.表达合成的抗-sirpα-cd64融合蛋白(抗体融合物1)的fluc+b2m-/-ciita-/-iec细胞被保护免于被用il-2刺激72小时的原代人nk细胞杀伤。将保护作用记录为当与fluc+b2m-/-ciita-/-iec细胞相比较时更小的bli信号下降。抗体融合物1蛋白输送了一些针对nk细胞杀伤的免疫保护。
47.图6.表达合成的抗-sirpα-cd64融合蛋白(抗体融合物2)的fluc+b2m-/-ciita-/-iec细胞被保护免于被用il-2刺激72小时的原代人nk细胞杀伤。将保护作用记录为当与fluc+b2m-/-ciita-/-iec细胞相比较时更小的bli信号下降。抗体融合物2蛋白输送了一些针对nk细胞杀伤的免疫保护。
48.图7.用两种慢病毒(其携带关于经由曲妥珠单抗结构序列与cd64 tmd相融合的抗-sirpα抗体的重链和轻链的转基因)转导fluc+b2m-/-ciita-/-iec细胞。该抗-sirpα-tras-cd64融合蛋白的表达显示出针对用il-2刺激72小时的原代人nk细胞的保护作用。将保护作用记录为当与fluc+b2m-/-ciita-/-iec细胞相比较时更小的bli信号下降。
49.图8.转导fluc+b2m-/-ciita-/-iec细胞以表达更小的抗-sirpα-scfv-cd8-pdgf融合蛋白。该抗-sirpα-scfv-cd8-pdgf融合蛋白的表达显示出针对用il-2刺激72小时的原代人nk细胞的保护作用。将保护作用记录为当与fluc+b2m-/-ciita-/-iec细胞相比较时更小的bli信号下降。
50.vi.发明详述
51.本发明提供了当与具有未修饰的sirpα衔接功能的亲本细胞相相比较时具有增加的信号调节蛋白α(sirpα)衔接功能的细胞(sirpα衔接体细胞)，其在被移植到受试者中时抵抗先天免疫。在一些实施方案中，所述sirpα衔接体细胞为低免疫性细胞。在另一些实施方案中，所述sirpα衔接体细胞为经分化的体细胞。在另一些实施方案中，所述sirpα衔接体细胞为低免疫性多能(hip)细胞。在进一步的实施方案中，所述hip细胞是o血型的(hipo)，猕猴因子(rh)阴性的(hip-)，或者o血型和rh-的(hipo-)。在另一些实施方案中，所述sirpα
衔接体细胞衍生或分化自hip、hip-或hipo-细胞。在另一些实施方案中，所述sirpα衔接体细胞包含抗体fc受体以针对抗体依赖性细胞毒性(adcc)或补体依赖性细胞毒性(cdc)进行保护。
52.在另一些实施方案中，所述sirpα衔接体细胞衍生或分化自上面提及的细胞。作为例子，经分化的sirpα衔接体细胞可以为内皮细胞、心肌细胞、肝细胞、多巴胺能神经元、胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞和其他用于移植和医学疗法的细胞类型。这些可以包括嵌合抗原受体(car)细胞，例如car-t细胞、nk细胞和car-nk细胞。
53.如在本文中所使用的，术语“受试者”或“患者”是指任何动物，例如家养动物、动物园动物或人。“受试者”或“患者”可以为哺乳动物，例如狗、猫，鸟类、家畜或人。“受试者”和“患者”的具体例子包括但不限于：具有与肝脏、心脏、肺、肾脏、胰腺、脑、神经组织、血液、骨、骨髓等相关的疾病或病症的个体(特别是人)。
54.哺乳动物细胞可以来自人或非人哺乳动物。示例性的非人哺乳动物包括但不限于：小鼠、大鼠、猫、狗、兔子、豚鼠、仓鼠、绵羊、猪、马、牛和非人灵长类动物(例如，黑猩猩、猕猴和猿)。
55.在本文中“低免疫原性”细胞或“hi”细胞意指当被转移到同种异体宿主中时产生减小的免疫排斥应答的细胞。在优选的实施方案中，hi细胞不产生免疫应答。因此，“低免疫原性(的)”是指当与在免疫改造之前的亲本(即，“wt”)细胞的免疫应答相比较时显著减小的或消除的免疫应答。
56.在本文中“低免疫原性o
‑”
细胞、“低免疫原性orh
‑”
细胞或“hio
‑”
细胞意指还是abo血型o和猕猴因子rh-的hi细胞。hio-细胞可以从o-细胞生成，经酶促修饰成为o-，或者经遗传改造成为o-。
57.在本文中“hla”或“人白细胞抗原”意指编码人中的主要组织相容性复合体(mhc)蛋白的基因复合体。构成hla复合体的这些细胞表面蛋白质负责调节对于抗原的免疫应答。在人中，存在两种mhc，i类和ii类，“hla-i”和“hla-ii”。hla-i包括三种蛋白质，hla-a、hla-b和hla-c，其呈递来自细胞内部的肽，并且由hla-i复合体呈递的抗原吸引杀伤t细胞(也称为cd8+t-细胞或细胞毒性t细胞)。hla-i蛋白与β-2微球蛋白(b2m)相关联。hla-ii包括五种蛋白质，hla-dp、hla-dm、hla-dob、hla-dq和hla-dr，其向t淋巴细胞呈递来自细胞外部的抗原。这刺激cd4+细胞(也称为t-辅助细胞)。应当理解的是，使用“mhc”或“hla”并不意味着是限制性的，因为它取决于所述基因来自人(hla)还是非人(mhc)。因此，当它涉及哺乳动物细胞时，这些术语可以在本文中可互换使用。
58.在本文中“基因敲除”意指这样的过程，其使得在宿主细胞中的特定基因(所述特定基因居留在所述宿主细胞中)变得无活性，导致不产生目的蛋白或无活性形式。如由本领域技术人员将会意识到的和下面进一步描述的，这可以以许多不同的方式来实现，包括从基因中去除核酸序列，或用其他序列间断所述序列，改变阅读框，或改变所述核酸的调控组分。例如，可以去除目的基因的所有或部分编码区或者用“无义”序列替换，可以去除或替换所有或部分调控序列例如启动子，可以去除或替换翻译起始序列，等等。
59.在本文中“基因敲入”意指向宿主细胞添加遗传功能的过程。这引起所编码的蛋白质的增加的水平。如由本领域技术人员将会意识到的，这可以以几种方式来实现，包括向宿主细胞添加一个或多个拷贝的所述基因，或者改变内源基因的调控组分，从而增加所制备
的蛋白质的表达。这可以通过修饰启动子、添加不同的启动子、添加增强子或修饰其他基因表达序列来实现。“β-2微球蛋白”或“β2m”或“b2m”蛋白是指具有下面所显示的氨基酸和核酸序列的人β2m蛋白；所述人基因具有登录号refseq nm_004048.4。
[0060]“cd47蛋白”是指具有下面所显示的氨基酸和核酸序列的人cd47蛋白；所述人基因具有登录号refseq nm_001777.4。
[0061]
在经改造的细胞上的cd47表达已显示出提供针对先天免疫细胞杀伤和吞噬的保护作用(deuse t.nat biotechnol.2019mar,37:252-258)。然而，在其配体sirpα连接后，cd47可以在经改造的细胞中启动下游信号传导，其生理学可能受到不想要的扰乱。仅为了取得针对免疫细胞杀伤的保护作用，本发明的一些方面将细胞外sirpα-结合功能与在经改造的细胞中的细胞内信号传导相分开。在另一些方面，本发明提供了sirpα衔接体融合蛋白，其具有激动性sirpα结合活性但缺乏不想要的在经改造的细胞中的细胞内信号传导。其他方面提供了包含cd47 ecd的sirpα衔接体融合蛋白。
[0062]
本发明提供了sirpα衔接体融合蛋白，其在经改造的细胞上表达并且被设计成以激动方式与在免疫细胞上的sirpα相结合，这激活sirpα信号传导。所述效应免疫细胞可以为任何表达sirpα的免疫细胞，并且可以来自髓谱系(例如，单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞)以及淋巴谱系(例如，t细胞、b细胞或nk细胞)。
[0063]
在本文中所提供的融合蛋白包含细胞外结构域(ecd)和跨膜结构域(tmd)，并且可以或可以不包含细胞内结构域(icd)。所述融合蛋白典型地不具有icd并且限于ecd和tmd。
[0064]
在一些方面，所述ecd包含cd47 ecd、cd47免疫球蛋白超家族(igsf)结构域、激动性抗-sirpα抗体的互补性决定区(cdr)或者激动性抗-sirpα抗体的单链可变片段(scfv)。在所述ecd上的目的区域包括至少一个cdr序列，其中cdr可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个氨基酸的。备选地，目的ecd包含多于一个抗体可变区(参见例如，seq id no:5和9)。抗-sirpα抗体的cdr例如公开在wo2016/205042(其通过提及而以其整体合并入本文)中。
[0065]
本发明的特别方面提供了下面的示例性序列：
[0066]
表1
[0067]
[0068][0069]
在本发明的一些方面，所述ecd包含一个、两个或三个抗-sirpαcdr。在优选的方面，所述ecd包含seq id no:6-8或10-12中的一个或多个。
[0070]
在一些方面，改变序列的一个或多个残基以修饰结合，以取得更有利的结合的结合速率(on-rate)、更有利的结合的解离速率(off-rate)或者两者，从而取得经优化的结合。
[0071]
在另一些方面，所述ecd包含将所提供的序列与tmd或者彼此相联结的连接体区或铰链区。在另一些方面，在所述连接体区或铰链区中的一个或多个内进行修饰，只要这些修饰不消除所述融合蛋白与sirpα的结合亲和力。
[0072]
在一些方面，ecd具有seq id no:5或seq id no:9中任一个之中所示的至少大约10个氨基酸，至少大约15个氨基酸，至少大约20个氨基酸，至少大约25个氨基酸，至少大约30个氨基酸的连续序列，直至完整的所提供的区域。ecd还包括与seq id no:5或9中任一个之中所示的氨基酸序列相比较而言相差直至1、2、3、4、5、6或更多个氨基酸的序列。在另一些实施方案中，ecd与seq id no:5或9中任一个之中所示的氨基酸序列具有至少大约80％、85％、90％、95％或大约99％序列同一性。
[0073]
通常，所述sirpα衔接体融合蛋白的跨膜结构域(tmd)不限于特定的tmd序列。优选地，所述tmd允许所述融合蛋白稳定锚固在表达所述融合蛋白的细胞(例如，内皮细胞、心肌细胞、胰腺β细胞、t细胞、nk细胞或造血细胞，等等)的膜中。它进一步允许ecd与sirpα相结合。在一些方面，所述融合蛋白包含icd，并且与sirpα的结合允许经由所述icd的信号传导。这对于经改造的细胞来说可能是有益的，如果这样的信号传导增强该细胞的固有功能。经增强的功能可以例如通过经由激活整联蛋白而增强的黏附来取得。在另一些方面，所述融合蛋白不包含icd，而是在tmd后被截短。在后一种情况下，所述融合蛋白与sirpα的结合不导致在经改造的细胞中的细胞内信号传导。
[0074]
作为单个α螺旋、作为多个α螺旋或作为卷起的β片层，tmd延伸横跨细胞膜脂质双层。这些“单次穿过”和“多次穿过”蛋白质中的一些具有共价附接的脂肪酸链，其插入到胞质溶胶脂质单层中。其他膜蛋白暴露在膜的仅一侧处。这些中的一些通过两亲性α螺旋而锚固至胞质溶胶表面，所述两亲性α螺旋通过所述螺旋的疏水面而分配入脂质双层的胞质溶胶单层中。其他的仅通过在胞质溶胶单层中的共价附接的脂质链(脂肪酸链或异戊二烯基
基团)附接至双层，或者经由寡糖连接体附接至在非胞质溶胶单层中的磷脂酰肌醇(alberts b,johnson a,lewis j等人,molecular biology of the cell.第4版.new york:garland science,isbn-10:0-8153-3218-1(2002))。
[0075]
在一些方面，所述融合蛋白的示例性tmd来自cd16、cd8、cd335、cd25、cd1a、cd220、cd45、cd11a-d、cd64、cd32、cd62、cd40、cd49a-f、cd47、cd32、cd68、cd85、cd300、cd344、cd350、cd54、cd56、cd137、itga7、itga8、itga9、itga10、itga11、cd51、cd41、cd29、cd18、cd61或cd104。在其他方面，所述融合蛋白的tmd来自cd47(seq id no:13)或cd64(seq id no:14)或pdgf(seq id no:27)。
[0076]
在其他方面，所述sirpα衔接体融合蛋白不具有细胞内结构域(icd)以避免在经改造的细胞中的信号传导。然而，如果认为是有益的，那么所述融合蛋白的icd可以为来自cd16、cd32、cd64、cd8、cd3、cd28或cd137的icd。
[0077]“ciita蛋白”是指具有下面所显示的氨基酸和核酸序列的人ciita蛋白；所述人基因具有refseq登录号nm_000246.4。
[0078]
在细胞的情景下“野生型”意指在自然界中发现的细胞。然而，在天然杀伤(nk)细胞的情景下，如在本文中所使用的，它还意指，所述细胞可以包含导致永生的核酸变化，但是未经历本发明的基因编辑操作程序以取得低免疫原性。
[0079]
在本文中“同种同基因(的)”是指宿主生物和细胞移植物的遗传相似性或同一性，其中存在免疫相容性，例如不生成免疫应答。
[0080]
在本文中“同种异体(的)”是指宿主生物和细胞移植物的遗传相异性，其中生成免疫应答。
[0081]
在本文中“b2m-/
‑”
意指在两条染色体中都具有失活的b2m基因的二倍体细胞。如在本文中所描述的，这可以以各种各样的方式来进行。
[0082]
在本文中“ciita-/
‑”
意指在两条染色体中都具有失活的ciita基因的二倍体细胞。如在本文中所描述的，这可以以各种各样的方式来进行。
[0083]
在本文中“cd47 tg”、“cd47转基因”或“cd47+”意指，所述宿主细胞表达cd47，在一些情况下通过具有至少一个另外的拷贝的cd47基因。
[0084]
在两个或更多个核酸或多肽序列的情景下，术语“同一性”百分比是指两个或更多个这样的序列或子序列，其具有所指定的百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基，当就最大对应性进行比较和比对时，如通过使用下面所描述的序列比较算法(例如，blastp和blastn，或者其他对于技术人员来说可得的算法)之一或者通过目视检查所测量的。取决于应用，“同一性”百分比可以存在于进行比较的序列的一个区域上，例如在功能结构域上，或者备选地，存在于待比较的两个序列的全长上。对于序列比较，典型地，一个序列担当参考序列，受试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将受试序列和参考序列输入计算机，指定子序列坐标，如果需要，并且指定序列算法程序参数。然后，所述序列比较算法基于所指定的程序参数来计算相对于参考序列而言的关于受试序列的序列同一性百分比。
[0085]
可以进行用于比较的序列的最佳比对，例如通过smith&waterman,adv.appl.math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过needleman&wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过pearson&lipman,proc.nat'l.acad.sci.usa 85:2444(1988)的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化实施(在wisconsin genetics软件包
denhardt's溶液，经超声处理的鲑精dna(50μl/m1)、0.1％ sds和10％硫酸葡聚糖的溶液中过夜杂交，在42℃在0.2x ssc(氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤10分钟，随后在55℃下进行10分钟由包含edta的0.1x ssc构成的高严紧性洗涤。
[0094]
如在本文中所使用的，“在药学上可接受的承载体”或“治疗有效的承载体”是水性的或非水性的(固体)，例如含醇的或油性的，或者其混合物，并且可以包含表面活性剂、软化剂、润滑剂、稳定剂、染料、香料、防腐剂、用于ph调节的酸或碱、溶剂、乳化剂、胶凝剂、增湿剂、稳定剂、湿润剂、定时释放试剂、致湿剂或其他在特定形式的药学组合物中通常包括的组分。在药学上可接受的承载体是本领域中熟知的，并且包括，例如，水性溶液例如水或生理学缓冲盐水或者其他溶剂或载料例如二醇类、甘油和油类例如橄榄油。在药学上可接受的承载体可以包含在生理学上可接受的化合物，其例如起稳定特定抑制剂或增加特定抑制剂的吸收的作用，例如，碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化剂例如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂，低分子量蛋白质，或者其他稳定剂或赋形剂。
[0095]
所述药学组合物可以是以无菌可注射制备物的形式，例如作为无菌可注射水性或油性悬浮液。该悬浮液可以根据本领域中已知的技术使用合适的分散剂或湿润剂(例如，tween 80)和悬浮剂来进行配制。所述无菌可注射制备物也可以为在非毒性的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如，作为在1,3-丁二醇中的溶液。在可以采用的可接受的载料和溶剂之中包括甘露醇、水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。另外，常规地采用无菌不挥发油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何温和的不挥发油，包括合成的单或二甘油酯。脂肪酸例如油酸及其甘油酯衍生物在制备可注射物中是有用的，以及还有天然的在药学上可接受的油类，例如橄榄油或蓖麻油，尤其是以其聚氧乙基化形式。这些油状溶液或悬浮液也可以包含长链醇稀释剂或分散剂例如ph.helv或类似的醇。
[0096]
所意欲的是，整个本说明书中给出的每个最大数值界限包括每个较低的数值界限，如同这样的较低的数值界限在本文中被明确写出。在整个本说明书中给出的每个最小数值界限将会包括每个较高的数值界限，如同这样的较高的数值界限在本文中被明确写出。在整个本说明书中给出的每个数值范围将会包括落在这样的较宽的数值范围内的每个较窄的数值范围，如同这样的较窄的数值范围均在本中被明确写出。
[0097]
如在本文中所使用的，术语“修饰”是指这样的改变，其使经修饰的分子在物理上不同于亲本分子。在一些实施方案中，根据在本文中所描述的和本领域中已知的方法制备了在sirpα、cd47、cd316、cd32、cd64、hsvtk、ec-cd或icasp9变体多肽中的插入、缺失、置换或其他类型的氨基酸变化。此类修饰使它们不同于未根据在本文中所描述的方法进行修饰的相应的亲本，例如，野生型蛋白质，天然出现的突变型蛋白质，或者不包含此类变体多肽的修饰的另一些经改造的蛋白质。在另一个实施方案中，变体多肽包含使所述变体多肽的功能不同于未修饰的多肽的一个或多个修饰。例如，在变体多肽中的氨基酸变化影响其受体结合特性谱。在另一些实施方案中，变体多肽包含置换、缺失或插入修饰，或者其组合。在另一个实施方案中，变体多肽包含相比于未修饰的多肽的亲和力而言增加其对于受体的亲和力的一个或多个修饰。
[0098]
在一个实施方案中，变体多肽包含一个或多个相对于相应的天然或亲本序列而言的置换、插入或缺失。在某些实施方案中，变体多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31-40、41至50或51个或者更多
个修饰。
[0099]
在本文中“附加型载体”意指可以在细胞的胞质中存在和自主复制的遗传载体；例如，它不被整合到宿主细胞的基因组dna中。许多附加型载体是本领域中已知的并且在下面进行了描述。
[0100]
在基因情景下“敲除”意指，拥有所述敲除的宿主细胞不产生所述基因的功能性蛋白产物。如在本文中所概述的，敲除可以以各种各样的方式产生自下面那些：去除所有或部分的编码序列，引入移码突变从而不产生功能性蛋白质(截短的或无义的序列)，去除或改变调控组分(例如，启动子)从而基因不被转录，通过与mrna相结合来阻止翻译，等等。通常，敲除在基因组dna水平上进行，从而细胞的后代也永久携带所述敲除。
[0101]
在基因情景下“敲入”意指，拥有所述敲入的宿主细胞具有更多的在所述细胞中有活性的功能性蛋白质。如在本文中所概述的，敲入可以以各种各样的方式来进行，通常通过将至少一个拷贝的编码所述蛋白质的转基因(tg)引入到细胞中，虽然这也可以通过替换调控组分来进行，例如通过向内源基因添加组成型启动子。通常，敲入技术导致所述转基因的额外拷贝整合到宿主细胞中。
[0102]
vii.本发明的细胞
[0103]
本发明提供了sirpα衔接体细胞，其为低免疫性细胞。在另一些实施方案中，所述sirpα衔接体细胞为经分化的体细胞。在另一些实施方案中，所述sirpα衔接体细胞为低免疫性多能(hip)细胞。在进一步的实施方案中，所述hip细胞是o血型的(hipo)，猕猴因子(rh)阴性的(hip-)，或者o血型和rh-的(hipo-)。在另一些实施方案中，所述sirpα衔接体细胞衍生或分化自hip、hip-或hipo-细胞。在另一些实施方案中，所述sirpα衔接体细胞包含抗体fc受体以针对抗体依赖性细胞毒性(adcc)或补体依赖性细胞毒性(cdc)进行保护。
[0104]
本发明提供了用于生成sirpα衔接体细胞的组合物和方法。在一些方面，所述细胞为低免疫性细胞。在另一些方面，所述细胞为经分化的体细胞。在另一些方面，所述细胞为多能细胞，例如hip细胞、hip-细胞、hipo-细胞。在另一些方面，所述sirpα衔接体细胞为适合于移植和/或分化的多能干细胞(psc)。所述psc细胞包括诱导型psc(ipsc)或胚胎干细胞(esc)。在另一些方面，所述细胞是特定组织类型的，并且分化自上面提及的sirpα衔接体细胞。作为例子，所述经分化的sirpα衔接体细胞可以为内皮细胞、心肌细胞、肝细胞、多巴胺能神经元、胰岛细胞、视网膜色素上皮细胞和其他用于移植和医学疗法的细胞类型。这些可以包括嵌合抗原受体(car)细胞，例如car-t细胞、car-nk细胞和其他经改造的细胞群体。参见wo2018/132783、wo2020/018620、wo2020/018615、pct/us2020/032272以及美国专利申请号16/870,959和16/870,960，其通过提及以其整体而合并入本文。
[0105]
本发明提供了sirpα衔接体细胞，其具有与在nk细胞表面上的sirpα相互作用并且阻止细胞杀伤和先天免疫的sirpα衔接体蛋白。在一些实施方案中，所述sirpα衔接体蛋白为系缚至所述sirpα衔接体细胞的表面的抗-sirpα抗体。在一些实施方案中，所述抗-sirpα抗体经由其可结晶片段(fc)部分系缚至细胞表面cd。在另一些实施方案中，所述抗-sirpα抗体的抗原结合部分(scfv)经由跨膜结构域(tmd)结合至细胞表面。在优选的实施方案中，所述tmd包含一个或多个α-螺旋。在另一些优选的实施方案中，所述tmd来自7次跨膜蛋白(7tm)。在另一些优选的实施方案中，所述tmd来自免疫球蛋白细胞表面蛋白。在更优选的实施方案中，所述免疫球蛋白细胞表面蛋白为抗体、受体、配体或黏着蛋白。在一些实施方案
中，所述sirpα衔接体细胞产生自锚固到所述细胞表面上的cd47融合蛋白。
[0106]
sirpα衔接体蛋白表达可以以几种方式来实现，如本领域技术人员将会意识到的，使用“敲入”或转基因技术。在一些情况下，sirpα衔接体蛋白表达产生自一个或多个转基因。
[0107]
因此，在一些实施方案中，向所述sirpα衔接体细胞添加一个或多个拷贝的sirpα衔接体蛋白表达基因，在诱导型或组成型启动子(后者是优选的)的控制下。在一些实施方案中，采用慢病毒构建体，如在本文中所描述的或本领域中已知的。所述基因可以整合到宿主细胞的基因组中，在合适的启动子的控制下，如本领域中已知的。
[0108]
在一些实施方案中，所述基因的表达可以通过改变内源基因座位的调控序列来增加，例如通过将内源启动子交换为组成型启动子或不同的诱导型启动子。这通常可以通过使用已知技术例如crispr来进行。
[0109]
一旦被改变，就可以通过使用已知的技术例如在实施例中所描述的那些(例如，使用合适的抗体的western印迹、elisa测定法或facs测定法)来检定充足的sirpα衔接体蛋白表达的存在。一般而言，在该情景下“充足”意指使nk细胞杀伤沉默的在细胞表面上sirpα衔接体蛋白表达的增加。
[0110]
作为抗体的多肽也在本发明的范围内。术语“抗体”意在包括单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、抗体片段(例如，fc结构域)、fab片段、单链抗体、双或多特异性抗体、美洲驼抗体、纳米抗体(nano-bodies)、双链抗体、亲和抗体(affibodies)、fv、fab、f(ab')2、fab'、scfv、scfv-fc等。抗体融合蛋白，例如ig嵌合体，也包括在该术语中。优选的抗体包括人源化的或完全人的单克隆抗体或其片段。
[0111]
术语“抗体”和“免疫球蛋白”可以包括单克隆抗体(例如，全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、单价抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们展现出所希望的生物学活性)，并且还可以包括某些抗体片段(如在本文中更详细地描述的)。抗体可以是嵌合的、人的、人源化的和/或经亲和力成熟的。
[0112]
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用以指处于其实质上完整的形式的抗体，而不是下面所定义的抗体片段。这些术语特别地是指具有包含fc区的重链的抗体。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，该部分优选地包含其抗原结合区域。抗体片段的例子包括：fab、fab'、f(ab')2和fv片段；双链抗体；线性抗体；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。如在本文中所使用的，术语“单克隆抗体”是指从实质上同质的抗体的群体中获得的抗体，即在所述群体中所包含的独个抗体是相同的，除了可能的突变外，例如天然出现的突变，其可以以较小的量存在。因此，经修饰语“单克隆抗体(的)”将所述抗体的特征指明为不是离散的抗体的混合物。
[0113]
在某些实施方案中，这样的单克隆抗体典型地包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中所述靶标结合多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单个靶标结合多肽序列的过程来获得。例如，所述选择过程可以为从多个克隆(例如，杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组dna克隆的汇集物)中选择唯一的克隆。应当理解的是，可以进一步改变选择出的靶标结合序列，例如以改善对于靶标的亲和力，使所述靶标结合序列人源化，改善其在细胞培养中的产生，降低其体内免疫原性，产生多特异性抗体，等等；并且包含经改变的靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆
抗体制备物相反，单克隆抗体制备物中的每个单克隆抗体针对在抗原上的单一决定簇。除了其特异性外，单克隆抗体制备物也是有利的，因为它们典型地不被其他免疫球蛋白污染。
[0114]
与抗原特异性地结合的抗体对于那个抗原具有高亲和力。抗体亲和力可以通过解离常数(kd)来测量。在某些实施方案中，在本文中所提供的抗体具有等于或小于大约100nm、10nm、1nm、0.1nm、0.01nm或0.001nm(例如，10-7
m或更小，10-7
m至10-13
m，10-8
m至10-13
m，或10-9
m至10-13
m)的解离常数(kd)。
[0115]
在一个实施方案中，kd通过放射性标记抗原结合测定法(ria)来进行测量，该测定法用目的抗体的fab形式和其抗原来施行，如通过下面的测定法来描述的。对于抗原的fab的溶液结合亲和力通过下述方式来进行测量：在未标记的抗原的滴定系列存在下用最小浓度的经(
125
i)标记的抗原对fab进行平衡，然后用包被有抗-fab抗体的平板捕获所结合的抗原(参见例如，chen等人,j.mol.biol.293:865-881(1999))。为了建立对于所述测定法的条件，用在50mm碳酸钠(ph 9.6)中的5μg/ml的捕获性抗-fab抗体(cappel labs)包被多孔平板(thermo scientific)过夜，随后在室温(大约23℃)下用在pbs中的2％(w/v)牛血清白蛋白封闭二至五个小时。在非吸附性平板(nunc#269620)中，将100μm或26μm[
125
i]-抗原与目的fab的系列稀释物相混合(例如，与抗-vegf抗体fab-12的评估相一致，在presta等人,cancer res.57:4593-4599(1997)中)。然后，将目的fab温育过夜；然而，温育可以继续更长的时间段(例如，大约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获平板以在室温下进行温育(例如，一个小时)。然后，移除溶液并且将所述平板用在pbs中的0.1％聚山梨酯20洗涤八次。当平板已干燥时，添加150μl/孔的闪烁体(microscint-20
tm
；packard)，并且将平板在topcount
tm
γ计数器(packard)上计数十分钟。选择给出小于或等于最大结合的20％的每种fab的浓度以用于在竞争结合测定法中使用。
[0116]
根据另一个实施方案，kd通过使用表面等离子体共振测定法来进行测量，其中使用或(biacore,inc.,piscataway,n.j.)，在25℃下，用例如经固定化的抗原cm5芯片，以～10个响应单位(ru)。简而言之，按照供应商的说明书，用盐酸n-乙基-n
′‑
(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)来活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(cm5，biacore,inc.)。用10mm乙酸钠(ph 4.8)将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μm)，之后以5μl/分钟的流速进行注射，以取得大约10个响应单位(ru)的经偶联的蛋白质。在注射抗原后，注射1m乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃下以大约25μl/分钟的流速在具有0.05％聚山梨酯20(tween-20
tm
)表面活性剂的pbs(pbst)中注射fab的两倍系列稀释物(0.78nm至500nm)。使用简单的一对一朗缪尔(langmuir)结合模型(评价软件3.2版)，通过同时拟合缔合和解离传感图(sensorgram)来计算缔合速率(k
on
)和解离速率(k
off
)。平衡解离常数(kd)被计算为koff/kon比例。参见例如，chen等人,j.mol.biol.293:865-881(1999)。如果通过上面的表面等离子体共振测定法结合速率超过106m-1
s-1
，那么结合速率可以通过使用荧光猝灭技术来测定，所述荧光猝灭技术测量在25℃下在渐增浓度的抗原存在下在pbs(ph 7.2)中的20nm抗抗原抗体(fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减小，如在分光计例如配备有停流的分光光度计(aviv instruments)或具有搅拌小杯的8000-系列
slm-aminco
tm
分光光度计(thermospectronic)中所测量的。代替上面所描述的胺偶联方法(cm5芯片)，其他用于靶抗原至芯片表面的偶联化学(例如，链霉抗生物素蛋白/生物素、疏水相互作用或二硫化物化学)也是容易地可得的，如本领域技术人员将会理解的。
[0117]
修饰语“单克隆(的)”将所述抗体的特征指明为获得自实质上同质的抗体群体，而不应被解释为需要通过任何特定方法来产生所述抗体。例如，待根据本发明待进行使用的单克隆抗体可以通过各种各样的技术来制备，包括例如杂交瘤方法(例如，kohler等人,nature,256:495(1975)；harlow等人,antibodies:a laboratory manual,(cold spring harbor laboratory press,第2版.1988)；hammerling等人,monoclonal antibodies and t-cell hybridomas,第563-681页(elsevier,n.y.,1981))，重组dna方法(参见例如，美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如，clackson等人,nature,352:624-628(1991)；marks等人,j.mol.biol.222:581-597(1992)；sidhu等人,j.mol.biol.338(2):299-310(2004)；lee等人,j.mol.biol.340(5):1073-1093(2004)；fellouse,proc.natl.acad.sci.usa 101(34):12467-12472(2004)；和lee等人,j.immunol.methods 284(1-2):119-132(2004))，和用于在具有部分或所有的编码人免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白座位或基因的动物中产生人或人样抗体的技术(参见例如，wo98/24893；wo96/34096；wo96/33735；wo91/10741；jakobovits等人,proc.natl.acad.sci.usa 90:2551(1993)；jakobovits等人,nature 362:255-258(1993)；bruggemann等人,year in immunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016；marks等人,bio.technology 10:779-783(1992)；lonberg等人,nature 368:856-859(1994)；morrison,nature 368:812-813(1994)；fishwild等人,nature biotechnol.14:845-851(1996)；neuberger,nature biotechnol.14:826(1996)；和lonberg和huszar,intern.rev.immunol.13:65-93(1995))。上面的专利、出版物和参考文献通过提及而以其整体合并入本文。
[0118]
非人(例如，鼠类)抗体的“人源化”形式为嵌合抗体，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。在一个实施方案中，人源化抗体为其中来自受者的高变区的残基被来自具有所希望的特异性、亲和力和/或能力的非人物种(例如，小鼠、大鼠、兔子或非人灵长类)的高变区(供者抗体)的残基替换的人免疫球蛋白(受者抗体)。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区(fr)残基被相应的非人残基替换。进一步地，人源化抗体可以包含未在受者抗体或供者抗体中发现的残基。可以进行这些修饰以进一步精制抗体性能。一般而言，人源化抗体将会包含实质上所有的至少一个和典型地两个可变结构域，其中所有和实质上所有的高变环都相应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有和实质上所有的fr都为人免疫球蛋白序列的那些。任选地，人源化抗体还将会包含免疫球蛋白恒定区(fc)(典型地，人免疫球蛋白的那种)的至少一部分。对于进一步的细节，参见jones等人,nature321:522-525(1986)；riechmann等人,nature 332:323-329(1988)；和presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992)。还可参见下面的综述文章和其中所引用的参考文献：vaswani和hamilton,ann.allergy,asthma&immunol.1:105-115(1998)；harris,biochem.soc.transactions 23:1035-1038(1995)；hurle和gross,curr.op.biotech.5:428-433(1994)。上述参考文献通过提及而以其整体合并入本文。
[0119]“人抗体”为这样的抗体，其包含相应于由人产生的抗体的那种的氨基酸序列，和/
或是通过使用任何在本文中所公开的用于制备人抗体的技术来制备的。此类技术包括：筛选源自人的组合文库，例如噬菌体展示文库(参见例如，marks等人,j.mol.biol,222:581-597(1991)；和hoogenboom等人,nucl.acids res.,19:4133-4137(1991))；使用人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系来产生人单克隆抗体(参见例如，kozbor,j.immunol,133:3001(1984)；brodeur等人,monoclonal antibody production techniques and applications,第55-93页(marcel dekker,inc.,new york,1987)；和boerner等人,j.immunol,147:86(1991))；和在能够在内源免疫球蛋白产生不存在下产生整个全套人抗体的转基因动物(例如，小鼠)中生成单克隆抗体(参见例如，jakobovits等人,proc.natl.acad.sci usa,90:2551(1993)；jakobovits等人,nature,362:255(1993)；bruggermann等人,year in immunol.,7:33(1993))。人抗体的该定义特别地排除了包含来自非人动物的抗原结合残基的人源化抗体。
[0120]
a.用于遗传改变的方法
[0121]
本发明包括在细胞内或在无细胞条件下修饰核酸序列以生成sirpα衔接体细胞的方法。示例性的技术包括同源重组、敲入、zfn(锌指核酸酶)、talen(转录激活因子样效应子核酸酶)、crispr(成簇规律间隔短回文重复序列)/cas9和其他位点特异性核酸酶技术。这些技术使得在所希望的座位位点处的双链dna断裂成为可能。这些受控的双链断裂促进在特定座位位点处的同源重组。该过程聚焦于靶向核酸分子(例如染色体)的特定序列，用识别和结合所述序列并且诱导在所述核酸分子中的双链断裂的核酸内切酶。所述双链断裂通过易错非同源末端连接(nhej)或通过同源重组(hr)来进行修复。
[0122]
如本领域技术人员将会意识到的，许多不同的技术可以用于改造本发明的经修饰的细胞，以及将它们改造成为低免疫原性的，如在本文中所概述的。
[0123]
通常，这些技术可以单独地或相组合地进行使用。例如，在生成sirpα衔接体细胞中，crispr可以用于表达sirpα衔接体蛋白，例如抗-sirpα免疫球蛋白。在另一个例子中，将病毒技术(例如，慢病毒)用于表达sirpα衔接体蛋白。
[0124]
a.crispr技术
[0125]
在一个实施方案中，使用成簇规律间隔短回文重复序列/cas(“crispr”)技术来操作所述细胞，如本领域中已知的。crispr可以用于生成sirpα衔接体细胞。存在大量的基于crispr的技术，参见例如doudna和charpentier,science doi:10.1126/science.1258096，其特此通过提及而合并。crispr技术和试剂盒是在商业上有售的。
[0126]
b.talen技术
[0127]
在一些实施方案中，本发明的细胞通过使用转录激活因子样效应子核酸酶(talen)方法来制备。talen为与核酸酶相组合的限制酶，所述核酸酶可以被改造成实际上结合和切割任何所希望的dna序列。talen试剂盒是在商业上有售的。
[0128]
c.锌指技术
[0129]
在一个实施方案中，使用锌指核酸酶技术来操作所述细胞。锌指核酸酶是通过将锌指dna结合结构域与dna切割结构域相融合而生成的人工限制酶。锌指结构域可以被改造成靶向特定的所希望的dna序列，并且这使得锌指核酸酶能够靶向在复杂的基因组内的独特序列。通过利用内源dna修复机器，这些试剂可以用于精确地改变高等生物的基因组，类似于crispr和talen。
stem cell registry)和霍华德
·
休斯医学研究所(howard hughes medical institute)hues保藏中心而可得的那些(如在cowan,c.a.等人,new england j.med.350:13.(2004)中所描述的，其通过提及而以其整体合并入本文)。
[0137]
如在本文中所使用的“多能干细胞”具有分化成三个胚层中的任一个的潜力：内胚层(例如，胃连接、胃肠道、肺等)、中胚层(例如，肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖组织等)或外胚层(例如，表皮组织和神经系统组织)。如在本文中所使用的，术语“多能干细胞”还涵盖“诱导型多能干细胞”或“ipsc”，一种源自非多能细胞的多能干细胞类型。亲本细胞的例子包括已通过各种手段进行重编程以诱导多能的、未分化的表型的体细胞。此类“ips”或“ipsc”细胞可以通过诱导某些调控基因的表达或者通过某些蛋白质的外源应用来产生。用于诱导ips细胞的方法是本领域中已知的并且在下面进行进一步描述(参见例如，zhou等人,stem cells 27(11):2667-74(2009)；huangfu等人,nature biotechnol.26(7):795(2008)；woltjen等人,nature 458(7239):766-770(2009)；和zhou等人,cell stem cell8:381-384(2009)；其各自通过提及而以其整体合并入本文)。诱导型多能干细胞(ipsc)的生成在下面进行概述。如在本文中所使用的，“hipsc”为人诱导型多能干细胞，和“mipsc”为鼠类诱导型多能干细胞。
[0138]“多能干细胞特征”是指使多能干细胞区别于其他细胞的细胞的特征。产生这样的子代的能力为多能干细胞特征，所述子代能够在适当条件下分化为全体显现出与来自所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞谱系相关联的特征的细胞类型。某些分子标志物组合的表达或不表达也是多能干细胞特征。例如，人多能干细胞表达至少几个，和在一些实施方案中，所有的来自下面的非限制性列表的标志物：ssea-3、ssea-4、tra-1-60、tra-1-81、tra-2-49/6e、alp、sox2、e-钙黏着蛋白、utf-1、oct4、rex1和nanog。与多能干细胞相关联的细胞形态学也是多能干细胞特征。如在本文中所描述的，细胞不需要通过多能性来被重编程为内胚层祖细胞和/或肝细胞。
[0139]
b.低免疫原性sirpα衔接体细胞的生成
[0140]
用少至三次遗传变化来进行生成hi细胞，其导致细胞活性的最小破坏但是赋予细胞以免疫沉默。所述技术描述在wo2018/132783、wo2020/018620、wo2020/018615、pct/us2020/032272和美国专利申请号16/870,959和16/870,960(其通过提及而以其整体合并入本文)中。所述技术在下面进行简短讨论。
[0141]
如在本文中所讨论的，一个实施方案使用mhc i和ii(hla i和ii，当所述细胞是人的时)的蛋白质活性的降低或消除。这可以通过改变编码其组分的基因来进行。在一个实施方案中，使用crispr来破坏所述基因的编码区或调控序列。在另一个实施方案中，使用干扰rna技术来减少基因翻译。另一个实施方案为在调控对于巨噬细胞吞噬作用的易感性的基因中的变化。这可以为通过使用病毒技术来“敲入”基因。
[0142]
1.hla-i降低
[0143]
本发明的hi sirpα衔接体细胞包含mhc i(hla i，当所述细胞源自人细胞时)功能的降低。
[0144]
如本领域技术人员将会意识到的，功能降低可以以许多方式来实现，包括从基因中去除核酸序列，用其他序列间断所述序列，或者改变所述核酸的调控组分。例如，可以去除目的基因的所有或部分编码区或者用“无义”序列替换，可以制造移码突变，可以去除或
替换所有或部分调控序列例如启动子，可以去除或替换翻译起始序列，等等。
[0145]
如本领域技术人员将会意识到的，在所述sirpα衔接体细胞中mhc i(hla i，当所述细胞源自人细胞时)功能的成功降低可以通过使用本领域中已知的和下面所描述的技术来进行测量；例如使用经标记的结合hla复合体的抗体的facs技术；例如，使用与人主要组织相容性i类hla抗原的α链相结合的商购可得的hla-a,b,c抗体。
[0146]
a.b2m改变
[0147]
在一个实施方案中，hla-i活性的降低通过破坏在所述hi sirpα衔接体细胞中的β-2微球蛋白基因的表达来进行，如在本文中所公开的。该改变在本文中通常被称为基因“敲除”，并且在本发明的细胞中，在宿主细胞的两个等位基因上都进行敲除。通常，用于进行这两个破坏的技术是相同的。
[0148]
一个特别有用的实施方案使用crispr技术来破坏所述基因。另一个实施方案使用通过基于crispr的外因基因组编辑的可编程转录记忆(jk,cell.184:2503-2519(2021)，其通过提及而以其整体合并入本文)。在一些情况下，使用crispr技术来将小的缺失/插入引入到所述基因的编码区中，从而不产生功能性蛋白质，这常常是移码突变的结果，其导致生成终止密码子，从而制备出经截短的非功能性蛋白质。
[0149]
因此，一种有用的技术是使用被设计成靶向小鼠中的b2m基因或人中的b2m基因的编码序列的crispr序列。在基因编辑后，将经转染的sirpα衔接体细胞培养物解离成单细胞。使单细胞扩展为全尺寸集落，并且通过筛选从crispr切割位点起的异常序列的存在来就crispr编辑进行测试。挑选在两个等位基因中都具有缺失的克隆。此类克隆不表达b2m，如通过pcr所证实的，并且不表达hla-i，如通过facs分析所证实的。
[0150]
用于测试b2m基因是否已被失活的测定法是已知的并且在本文中进行了描述。在一个实施方案中，所述测定法为细胞裂解物的western印迹，其用针对b2m蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链式反应(rt-pcr)确证了失活性改变的存在。
[0151]
另外，可以对细胞进行测试以确证，在细胞表面上不表达hla i复合体。这可以通过facs分析来进行检定，其中使用针对一种或多种hla细胞表面组分的抗体，如上面所讨论的。
[0152]
2.hla-ii降低
[0153]
在一些实施方案中，除了hla i的降低外，本发明的hi sirpα衔接体细胞还可以缺乏mhc ii功能(来自源自人的细胞的hla ii)。
[0154]
如本领域技术人员将会意识到的，功能降低可以以许多方式来实现，包括从基因中去除核酸序列，向基因添加核酸序列，破坏阅读框，用其他序列间断所述序列，或者改变所述核酸的调控组分。在一个实施方案中，可以去除目的基因的所有或部分编码区或者用“无义”序列替换。在另一个实施方案中，可以去除或替换调控序列例如启动子，可以去除或替换翻译起始序列，等等。
[0155]
在所述sirpα衔接体细胞或其衍生物中mhc ii(hla ii)功能的成功降低可以通过使用本领域中已知的技术来进行测量，例如使用针对所述蛋白质的抗体的western印迹、facs技术、rt-pcr技术等。
[0156]
a.ciita改变
[0157]
在一个实施方案中，hla-ii活性的降低通过破坏在所述sirpα衔接体细胞中的
ciita基因的表达来进行，如在本文中所显示的。该改变在本文中通常被称为基因“敲除”，并且在本发明的sirpα衔接体细胞中，在宿主细胞的两个等位基因上都进行敲除。
[0158]
用于测试ciita基因是否已被失活的测定法是已知的并且在本文中进行了描述。在一个实施方案中，所述测定法为细胞裂解物的western印迹，其用针对ciita蛋白的抗体进行探测。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链式反应(rt-pcr)确证了失活性改变的存在。
[0159]
另外，可以对细胞进行测试以确证，在细胞表面上不表达hla ii复合体。再次，该测定法如本领域中已知的那样来进行。示例性的分析包括western印迹或facs分析，其使用与人ii类hla hla-dr、dp和大多数dq抗原相结合的商业抗体，如在下面所概述的。
[0160]
一个特别有用的实施方案使用crispr技术来破坏ciita基因。将crispr设计成靶向ciita基因(一种对于所有mhc ii分子来说必不可少的转录因子)的编码序列。在基因编辑后，将经转染的细胞培养物解离成单细胞。使它们扩展为全尺寸集落，并且通过筛选从crispr切割位点起的异常序列的存在来就成功的crispr编辑进行测试。不表达ciita的具有缺失的克隆通过pcr来确定，并且可以显示出不表达mhc ii/hla-ii(通过facs分析)。另一个实施方案使用通过基于crispr的外因基因组编辑的可编程转录记忆。
[0161]
3.o血型rh阴性细胞
[0162]
根据在人身体中在每个红细胞的表面上抗原的存在或不存在，可以将血液制品分类为不同的组(abo血型)。a、b、ab和a1抗原通过在红细胞的糖蛋白上的寡糖的顺序来确定。血型抗原组中的基因提供了关于制备抗原蛋白的指导。血型抗原蛋白服务于在红细胞的细胞膜内的各种各样的功能。这些蛋白质功能包括：将其他蛋白质和分子转运入或转运出细胞，维持细胞结构，附着至其他细胞和分子，和参与化学反应。
[0163]
猕猴因子(rh)血型是在abo血型系统之后第二个最重要的血型系统。rh血型系统由49个确定的血型抗原组成，其中五个抗原d、c、c、e和e是最重要的。个体的rh(d)状态通常用在abo型后面的正或负后缀来描述。术语“rh因子”、“rh阳性”和“rh阴性”仅是指rh(d)抗原。针对rh抗原的抗体可以牵涉在溶血性输血反应中，并且针对rh(d)和rh(c)抗原的抗体赋予胎儿和新生儿的溶血性疾病的显著风险。abo抗体在每个人中在早期生活中发展。然而，在rh-人中的猕猴抗体仅在当人被致敏时才发展。这通过生育rh+婴儿或通过接受rh+血液输血而发生。
[0164]
本发明提供了具有abo血型o和/或猕猴因子阴性(o-)多能细胞(psco-)群体的sirpα衔接体细胞，其适合于移植和/或分化。所述psco-细胞包括诱导型ipsc(ipsco-)、胚胎esc(esco-)和从那些细胞分化出的细胞，包括o-内皮细胞、o-心肌细胞、o-肝细胞、o-多巴胺能神经元、o-胰岛细胞、o-视网膜色素上皮细胞和其他用于移植和医学疗法的o-细胞类型。这些将会包括o-嵌合抗原受体(car)细胞，例如car-t细胞、car-nk细胞和其他经改造的细胞群体。在一些实施方案中，所述细胞不是造血干细胞。本发明进一步提供了普遍可接受的“现货”esco-和psco-及其衍生物，以用于生成或再生特定的组织和器官。
[0165]
本发明的另一个方面提供了生成用于移植的psco-、ipsco-、esco-和其他o-细胞的群体的方法。本发明还提供了治疗从多能或经分化的细胞的移植中获益的疾病、病症和状况的方法。
[0166]
在本发明的一些实施方案中，所述abo血型o型产生自减少的abo血型蛋白表达。在
另一些方面，所述abo血型内源地是o型的。在本发明的一些方面，所述hipo-细胞具有产生自在abo基因的人外显子7中的破坏的abo血型o型。在一些实施方案中，abo基因的外显子7的两个等位基因都被破坏。在一些实施方案中，在abo基因的外显子7的两个等位基因中的破坏均产生自成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)/cas9反应，其破坏所述两个等位基因。另一个实施方案使用通过基于crispr的外因基因组编辑的可编程转录记忆来使该基因失活。
[0167]
在另一些方面，所述abo血型o型产生自在细胞表面上的abo基因产物的酶促修饰。在一个优选的方面，所述酶促修饰从abo基因产物上去除碳水化合物。在另一个优选的方面，所述酶促修饰从abo a1抗原、a2抗原或b抗原上去除碳水化合物。
[0168]
在本发明的一些实施方案中，所述rh血型内源地是rh-型的。在另一个方面，所述rh-血型产生自减少或消除rh蛋白表达。在另一个方面，所述rh-型产生自破坏编码rh c抗原、rh e抗原、kell k抗原(kel)、duffy(fy)fya抗原、duffy fy3抗原、kidd(jk)jkb抗原和/或kidd slc14a1的基因。在一些实施方案中，所述破坏产生自crispr/cas9反应，其破坏编码rh c抗原、rh e抗原、kell k抗原(kel)、duffy(fy)fya抗原、duffy fy3抗原、kidd(jk)jkb抗原和/或kidd slc14a1的基因的两个等位基因。
[0169]
在本发明的一些实施方案中，本发明的o-细胞(例如，psco-、ipsco-、esco-和从其衍生的细胞)是哺乳动物来源的，例如人、牛、猪、鸡、火鸡、马、绵羊、山羊、驴、骡、鸭子、鹅、野牛、骆驼、牦牛、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠或豚鼠来源的。
[0170]
在一个特别的实施方案中，本发明提供了具有abo血型o、猕猴因子阴性(hipo-)细胞的低免疫性sirpα衔接体细胞，其逃避由宿主同种异体免疫系统进行的排斥并且避免血液抗原类型排斥。在一些实施方案中，所述hipo-细胞经改造以减少或消除hla-i和hla-ii表达，增加降低多能细胞对于巨噬细胞吞噬作用的易感性的内源蛋白质的表达，并且包含通用血型o rh-(“o
‑”
)血型。所述通用血型可以通过消除abo血型a和b抗原和rh因子表达，或者通过以o-细胞系开始来取得。这些新型hipo-细胞逃避宿主免疫排斥，因为它们具有受损的抗原呈递能力、具有免于先天免疫清除的保护作用并且没有血型排斥。
[0171]
4.自杀基因
[0172]
在一些实施方案中，本发明提供了包含“自杀基因”或“自杀开关”的hi sirpα衔接体细胞。掺入这些以作为“安全开关”起作用，其可以在细胞以不希望的方式进行生长和分裂之时引起所述细胞死亡。所述“自杀基因”切除方法包括在基因转移载体中的自杀基因，其编码仅在当通过特定化合物激活时导致细胞杀伤的蛋白质。自杀基因可以编码选择性地将非毒性化合物转化为高毒性代谢物的酶。结果是特异地消除表达所述酶的细胞。在一些实施方案中，所述自杀基因为疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)基因并且所述触发物为更昔洛韦。在另一些实施方案中，所述自杀基因为大肠杆菌(escherichia coli)胞嘧啶脱氨酶(ec-cd)基因并且所述触发物为5-氟胞嘧啶(5-fc)(barese等人,mol.therap.20(10):1932-1943(2012)；xu等人,cell res.8:73-8(1998)，两者均通过提及而以其整体合并入本文)。
[0173]
在另一些实施方案中，所述自杀基因为可诱导的胱天蛋白酶蛋白。可诱导的胱天蛋白酶蛋白包含能够诱导凋亡的胱天蛋白酶蛋白的至少一部分。在优选的实施方案中，所述可诱导的胱天蛋白酶蛋白为icasp9。它包含具有f36v突变的人fk506结合蛋白fkbp12的
序列，其通过一系列氨基酸联结至编码人胱天蛋白酶9的基因。fkbp12-f36v以高亲和力与小分子二聚化试剂ap1903相结合。因此，在本发明中icasp9的自杀功能通过施用二聚化化学诱导物(cid)来触发。在一些实施方案中，所述cid为小分子药物ap1903。二聚化引起凋亡的快速诱导。(参见wo2011146862；stasi等人,n.engl.j.med 365,18(2011)；tey等人,biol.blood marrow transplant.13:913-924(2007)，其各自通过提及而以其整体合并入本文。
[0174]
5.fc隔绝
[0175]
如果抗体经由其fab区与未保护的细胞相结合，那么fc可以被nk细胞(大部分经由其cd16受体)、巨噬细胞(大部分经由cd16、cd32或cd64)、b-细胞(大部分经由cd32)或粒细胞(大部分经由cd16、cd32或cd64)结合。这些可以介导抗体依赖性细胞毒性(adcc)。如果补体与fc相结合，那么它可以引起补体依赖性细胞毒性(cdc)。
[0176]
在一些实施方案中，本发明的sirpα衔接体细胞包含升高水平的识别igg的fc部分的受体。识别igg的fc部分的受体划分为四个不同的类别：fcγri(cd64)、fcγrii(cd32)、fcγriii(cd16)和fcγriv。这降低了细胞移植受者的免疫系统排斥同种异体材料的倾向。表达升高的cd16、cd32或cd64的细胞逃避adcc或cdc。fc隔绝公开在wo2021076427(其通过提及而以其整体合并入本文)中。
[0177]
6.关于hi表型的测定法
[0178]
一旦生成了hi细胞，就可以关于其低免疫原性对它们进行检定，如在本文中通常所描述的。
[0179]
例如，使用许多技术来检定低免疫原性。一个示例性的例子包括移植到同种异体宿主中并且监测hi sirpα衔接体细胞存活。可以转导所述细胞以表达萤光素酶，然后可以使用生物发光成像来追踪。类似地，测试宿主动物对于所述hi sirpα衔接体细胞的t细胞或b细胞应答，以确证它们不在宿主动物中引起免疫反应。t细胞功能通过elispot、elisa、facs、pcr或质谱流式细胞术(cytof)来进行评估。b细胞应答或抗体应答通过使用facs或luminex来进行评估。另外地或备选地，可以就其避免先天免疫应答(例如，nk细胞杀伤)的能力来对所述细胞进行检定。nk细胞溶细胞活性通过使用本领域中已知的技术在体外或在体内进行评估。
[0180]
c.低免疫性(hi)o-sirpα衔接体细胞的生成
[0181]
在本发明的一些方面，如上面所生成的sirpα衔接体细胞将会已经是abo血型o和rh因子阴性(-)细胞，因为所述过程将会已用具有o-血型的nk细胞开始。
[0182]
本发明的另一些方面涉及a和b抗原的酶促转换。在优选的方面，使用酶来将b抗原转换为o。在更优选的方面，所述酶为α-半乳糖苷酶。该酶消除b抗原的末端半乳糖残基。本发明的其他方面涉及将a抗原酶促转换为o。在优选的实施方案中，使用α-n-乙酰半乳糖胺酶来将a抗原转换为o。酶促转换在例如下面的文献中进行了讨论：olsson等人,transfusion clinique et biologique 11:33-39(2004)；美国专利号4,427,777、5,606,042、5,633,130、5,731,426、6,184,017、4,609,627和5,606,042；和国际公开号wo9923210，其各自通过提及而以其整体合并入本文。
[0183]
本发明的另一些实施方案涉及通过敲除abo基因外显子7或使slc14a1(jk)基因沉默来遗传改造所述细胞。本发明的另一些实施方案涉及敲除rh血型系统(rh)的c和e抗原，
kell系统(kel)中的k，duffy系统(fy)中的fya和fy3，kidd系统(jk)中的jkb，或者mns血型系统中的u和s。可以采用本领域中已知的或在本文中所描述的任何敲除方法，例如crispr、talens或同源重组。
[0184]
用于生成低免疫性abo血型o rh因子(-)细胞的方法描述在临时申请号62/846,399(其通过提及而以其整体合并入本文)中。
[0185]
d.本发明的实施方案
[0186]
本发明的sirpα衔接体细胞或其衍生物可以用于治疗例如1型糖尿病、心脏疾病、神经学疾病、癌症、失明、血管疾病和其他对于再生医学疗法作出应答的疾病/病症。特别地，本发明考虑使用所述sirpα衔接体细胞来分化为任何细胞类型。因此，在本文中提供了ipsc、esc、hip、ipsco、esco、hipo、ipsco-、esco-和hipo-sirpα衔接体细胞，或者其衍生物或经分化的细胞，其展现出多能性但在当被移植到同种异体宿主(例如人患者)中时不导致宿主先天免疫应答。
[0187]
在一个方面，本发明提供了sirpα衔接体细胞或其衍生物，其包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸，其中已消除了内源β-2微球蛋白(b2m)基因活性和内源ii类反式激活蛋白(ciita)基因活性，并且在细胞表面上提供了sirpα衔接体分子。所述car可以包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞外结构域与从由下列各项组成的组中选择的抗原相结合：cd19、cd20、cd22、cd38、cd123、cs1、cd171、bcma、muc16、ror1和wt1。在某些实施方案中，所述细胞外结构域包含单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包含cd3ζ、cd4、cd8α、cd28、4-1bb、ox40、icos、ctla-4、pd-1、lag-3和btla。在某些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含cd3ζ、cd28、4-1bb、ox40、icos、ctla-4、pd-1、lag-3和btla。
[0188]
在某些实施方案中，所述car包含抗-cd19 scfv结构域、cd28跨膜结构域和cd3ζ信号传导细胞内结构域。在一些实施方案中，所述car包含抗-cd19 scfv结构域、cd28跨膜结构域、4-1bb信号传导细胞内结构域和cd3ζ信号传导细胞内结构域。
[0189]
在本发明的另一个方面，提供了分离的sirpα衔接体car-t细胞或低免疫性car-t细胞，其通过在本文中所描述的多能细胞中的任一种的体外分化而产生。在一些实施方案中，所述car-t细胞为细胞毒性hipo-car-t细胞。
[0190]
在一些方面，本发明提供了sirpα衔接体nk或car-nk细胞。
[0191]
在各种实施方案中，所述体外分化包括在包含一种或多种从由下列各项组成的组中选择的生长因子或细胞因子的培养基中培养携带car构建体的sirpα衔接体细胞或其衍生物：bfgf、epo、flt3l、igf、il-3、il-6、il-15、gm-csf、scf和vegf。在一些实施方案中，所述培养基进一步包含一种或多种从由下列各项组成的组中选择的生长因子或细胞因子：bmp激活剂、gsk3抑制剂、rock抑制剂、tgfβ受体/alk抑制剂和notch激活剂。
[0192]
在特别的实施方案中，所述分离的sirpα衔接体car-t或car-nk细胞通过携带car-t构建体的ipsc、esc、hip、ipsco、esco、hipo、ipsco-、esco-或hipo-sirpα衔接体细胞中任一种的体外分化而产生。在另一些实施方案中，它们用于治疗癌症。
[0193]
在本发明的另一个方面，提供了通过施用包含治疗有效量的在本文中所描述的分离的sirpα衔接体car-t car-nk细胞中任一种的组合物来治疗具有癌症的患者的方法。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含在治疗上有效的承载体。
[0194]
在一些实施方案中，所述施用步骤包括静脉内施用、皮下施用、节内施用、肿瘤内施用、鞘内施用、胸膜内施用和腹膜内施用。在某些情况下，所述施用进一步包括推注或连续输注。
[0195]
在一些实施方案中，所述癌症为从由下列各项组成的组中选择的血液癌症：白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。在各种实施方案中，所述癌症为实体肿瘤癌症或液体肿瘤癌症。
[0196]
在另一个方面，本发明提供了制备在本文中所描述的分离的sirpα衔接体car-t car-nk细胞中任一种的方法。所述方法包括本发明的ipsc、esc、hip、ipsco、esco、hipo、ipsco-、esco-或hipo-sirpα衔接体细胞中任一种的体外分化。体外分化可以包括在包含一种或多种从由下列各项组成的组中选择的生长因子或细胞因子的培养基中培养所述细胞：bfgf、epo、flt3l、igf、il-2、il-3、il-6、il-7、il-15、gm-csf、scf和vegf。在一些实施方案中，所述培养基进一步包含一种或多种从由下列各项组成的组中选择的生长因子或细胞因子：bmp激活剂、gsk3抑制剂、rock抑制剂、tgfβ受体/alk抑制剂和notch激活剂。
[0197]
在一些实施方案中，所述体外分化包括在饲养细胞上培养所述ipsc、esc、hip、ipsco、esco、hipo、ipsco-、esco-或hipo-sirpα衔接体细胞。在各种实施方案中，所述体外分化包括在模拟的微重力中进行培养。在某些情况下，在模拟的微重力中进行的培养持续至少72小时。
[0198]
在一些方面，在本文中提供了分离的、经改造的低免疫性心脏细胞(低免疫原性心脏细胞)，例如心肌细胞，其分化自ipsc、esc、hip、ipsco、esco、hipo、ipsco-、esco-或hipo-sirpα衔接体细胞。
[0199]
以前心肌细胞被认为缺乏abo血型抗原。观察到abo血型b型人胚胎干细胞系分化为心肌细胞样细胞导致b抗原的丢失，这暗示这些抗原的丢失可以早期地在人胚胎发生期间发生。参见例如等人,transplantation.86(10):1407-13(2008)，其通过提及以其整体合并入本文。另一些研究也报道，诱导型人多能干细胞分化为心肌细胞样细胞引起在这些细胞中abo血型a型抗原的逐渐丢失。参见例如等人,scientific reports.13072:1-14(2017)。然而，令人惊讶地，发明人确定，心肌细胞表达abo血型抗原，其可以引起此类细胞对于不匹配的受者的排斥。
[0200]
因此，在一些方面，在本文中提供了治疗罹患心脏状况或疾病的患者的方法。所述方法包括施用组合物，所述组合物包含治疗有效量的衍生自在本文中所描述的ipsc、esc、hip、ipsco、esco、hipo、ipsco-、esco-或hipo-sirpα衔接体细胞的分离的sirpα衔接体心脏细胞中任一种的群体。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含在治疗上有效的承载体。
[0201]
在一些实施方案中，所述施用包括植入到患者的心脏组织中、静脉内注射、动脉内注射、冠状动脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、心肌内注射、经心内膜注射、经心外膜注射或输注。
[0202]
在一些实施方案中，所述心脏状况或疾病选自由下列各项组成的组：儿科心肌病、年龄相关心肌病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病、慢性缺血性心肌病、围产期心肌病、炎性心肌病、其他心肌病、心肌炎、心肌缺血再灌注损伤、心室功能障碍、心力衰竭、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、终末期心脏病、动脉粥样硬化、缺血、高血压、再狭窄、心绞痛、风湿性心脏病、动脉炎症或心血管疾病。
[0203]
在一些方面，在本文中提供了通过体外分化从sirpα衔接体细胞群体产生心脏细
胞群体的方法，其中已消除了内源β-2微球蛋白(b2m)基因活性和内源ii类反式激活蛋白(ciita)基因活性，并且在细胞表面上提供了sirpα衔接体分子。所述方法包括：(a)在包含gsk抑制剂的培养基中培养sirpα衔接体细胞群体；(b)在包含wnt拮抗剂的培养基中培养所述sirpα衔接体细胞群体，以产生前心脏细胞群体；和(c)在包含胰岛素的培养基中培养所述前心脏细胞群体，以产生o-低免疫性心脏细胞群体。在一些实施方案中，所述gsk抑制剂为chir-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，所述gsk抑制剂处于从大约2μm至大约10μm变动的浓度。在一些实施方案中，所述wnt拮抗剂为iwr1、其衍生物或其变体。在一些情况下，所述wnt拮抗剂处于从大约2μm至大约10μm变动的浓度。
[0204]
在一些方面，在本文中提供了分离的、经改造的sirpα衔接体内皮细胞，其分化自ipsc、esc、hip、ipsco、esco、hipo、ipsco-、esco-或hipo-sirpα衔接体细胞。在另一些方面，所述分离的、经改造的o-或o-低免疫性内皮细胞选自由下列各项组成的组：毛细血管内皮细胞、血管内皮细胞、主动脉内皮细胞、脑内皮细胞和肾脏内皮细胞。
[0205]
在一些方面，在本文中提供了治疗罹患血管状况或疾病的患者的方法。在一些实施方案中，所述方法包括施用包含治疗有效量的分离的、经改造的sirpα衔接体内皮细胞群体的组合物。
[0206]
在一些实施方案中，所述方法包括施用组合物，所述组合物包含治疗有效量的在本文中所描述的分离的、经改造的sirpα衔接体内皮中任一种的群体。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含在治疗上有效的承载体。在一些实施方案中，所述施用包括植入到患者的心脏组织中、静脉内注射、动脉内注射、冠状动脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、心肌内注射、经心内膜注射、经心外膜注射或输注。
[0207]
在一些实施方案中，所述血管状况或疾病选自由下列各项组成的组：血管损伤、心血管疾病、血管疾病、缺血性疾病、心肌梗死、充血性心力衰竭、高血压、缺血性组织损伤、肢端缺血、中风、神经病和脑血管疾病。
[0208]
在一些方面，在本文中提供了通过体外分化从ipsc、esc、hip、ipsco、esco、hipo、ipsco-、esco-或hipo-sirpα衔接体细胞群体产生sirpα衔接体内皮细胞群体的方法，其中已消除了内源β-2微球蛋白(b2m)基因活性和内源ii类反式激活蛋白(ciita)基因活性，并且在细胞表面上提供了sirpα衔接体分子。所述方法包括：(a)在包含gsk抑制剂的第一培养基中培养所述细胞；(b)在包含vegf和bfgf的第二培养基中培养所述细胞群体，以产生前内皮细胞群体；和(c)在包含rock抑制剂和alk抑制剂的第三培养基中培养所述前内皮细胞群体，以产生低免疫性内皮细胞群体。
[0209]
在一些实施方案中，所述gsk抑制剂为chir-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，所述gsk抑制剂处于从大约1μm至大约10μm变动的浓度。在一些实施方案中，所述rock抑制剂为y-27632、其衍生物或其变体。在一些情况下，所述rock抑制剂处于从大约1μm至大约20μm变动的浓度。在一些实施方案中，所述alk抑制剂为sb-431542、其衍生物或其变体。在一些情况下，所述alk抑制剂处于从大约0.5μm至大约10μm变动的浓度。
[0210]
在一些实施方案中，所述第一培养基包含2μm至大约10μm的chir-99021。在一些实施方案中，所述第二培养基包含50ng/ml vegf和10ng/ml bfgf。在另一些实施方案中，所述第二培养基进一步包含y-27632和sb-431542。在各种实施方案中，所述第三培养基包含10μm y-27632和1μm sb-431542。在某些实施方案中，所述第三培养基进一步包含vegf和bfgf。
在特别的情况下，所述第一培养基和/或所述第二培养基没有胰岛素。
[0211]
在一些方面，在本文中提供了分离的、经改造的sirpα衔接体多巴胺能神经元(dn)，其分化自sirpα衔接体细胞，其中已消除了内源β-2微球蛋白(b2m)基因活性和内源ii类反式激活蛋白(ciita)基因活性，在细胞表面上提供了sirpα衔接体分子，并且所述神经元是o血型和rh-的。
[0212]
在一些实施方案中，所述分离的sirpα衔接体多巴胺能神经元选自由下列各项组成的组：神经元干细胞、神经元祖细胞、未成熟的多巴胺能神经元和成熟的多巴胺能神经元。
[0213]
在一些方面，在本文中提供了治疗罹患神经变性疾病或状况的患者的方法。在一些实施方案中，所述方法包括施用组合物，所述组合物包含治疗有效量的所述分离的sirpα衔接体多巴胺能神经元中任一种的群体。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含在治疗上有效的承载体。在一些实施方案中，所述分离的低免疫性多巴胺能神经元群体在生物可降解的支架上。在一些实施方案中，所述施用可以包括移植或注射。在一些实施方案中，所述神经变性疾病或状况选自由下列各项组成的组：帕金森病、亨廷顿病和多发性硬化。
[0214]
在一些方面，在本文中提供了通过体外分化从sirpα衔接体细胞群体产生sirpα衔接体多巴胺能神经元群体的方法，其中已消除了内源β-2微球蛋白(b2m)基因活性和内源ii类反式激活蛋白(ciita)基因活性，在细胞表面上提供了sirpα衔接体分子，并且血型是o和rh-的。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)在包含一种或多种从由下列各项组成的组中选择的因子的第一培养基中培养所述细胞群体以产生未成熟的多巴胺能神经元群体：音猬因子(sonic hedgehog；shh)、bdnf、egf、bfgf、fgf8、wnt1、视黄酸、gsk3β抑制剂、alk抑制剂和rock抑制剂；和(b)在与所述第一培养基不同的第二培养基中培养未成熟的多巴胺能神经元群体以产生多巴胺能神经元群体。
[0215]
在一些实施方案中，所述gskβ抑制剂为chir-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，所述gskβ抑制剂处于从大约2μm至大约10μm变动的浓度。在一些实施方案中，所述alk抑制剂为sb-431542、其衍生物或其变体。在一些情况下，所述alk抑制剂处于从大约1μm至大约10μm变动的浓度。在一些实施方案中，所述第一培养基和/或第二培养基没有动物血清。
[0216]
在一些实施方案中，所述方法还包括从非多巴胺能神经元分离低免疫性多巴胺能神经元群体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括冷冻保存分离的低免疫性多巴胺能神经元群体。
[0217]
在一些方面，在本文中提供了分离的sirpα衔接体低免疫性胰岛细胞，其分化自sirpα衔接体细胞，其中已消除了内源β-2微球蛋白(b2m)基因活性和内源ii类反式激活蛋白(ciita)基因活性，在细胞表面上提供了sirpα衔接体分子，并且血型是o和rh-的。
[0218]
在一些实施方案中，所述分离的sirpα衔接体胰岛细胞选自由下列各项组成的组：胰岛祖细胞、未成熟的胰岛细胞和成熟的胰岛细胞。
[0219]
在一些方面，在本文中提供了治疗罹患糖尿病的患者的方法。所述方法包括施用组合物，所述组合物包含治疗有效量的在本文中所描述的分离的sirpα衔接体胰岛细胞中任一种的群体。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含在治疗上有效的承载体。在一些实施方案中，所述分离的低免疫性胰岛细胞群体在生物可降解的支架上。在一些情况下，所
述施用包括移植或注射。
[0220]
在一些方面，在本文中提供了通过体外分化从hipo-细胞群体产生sirpα衔接体胰岛细胞群体的方法，其中已消除了内源β-2微球蛋白(b2m)基因活性和内源ii类反式激活蛋白(ciita)基因活性，在细胞表面上提供了sirpα衔接体分子，并且血型是o和rh-的(在所述hipo-细胞中)。所述方法包括：(a)在包含一种或多种从由下列各项组成的组中选择的因子的第一培养基中培养所述sirpα衔接体细胞群体以产生未成熟的胰岛细胞群体：胰岛素样生长因子(igf)、转化生长因子(tgf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、表皮生长因子(egf)、肝细胞生长因子(hgf)、音猬因子(shh)和血管内皮生长因子(vegf)、转化生长因子-β(tgfβ)超家族、骨形态发生蛋白-2(bmp2)、骨形态发生蛋白-7(bmp7)、gsk3β抑制剂、alk抑制剂、bmp 1型受体抑制剂和视黄酸；和(b)在与所述第一培养基不同的第二培养基中培养未成熟的胰岛细胞群体以产生低免疫性胰岛细胞群体。
[0221]
在一些实施方案中，所述gsk抑制剂为chir-99021、其衍生物或其变体。在一些情况下，所述gsk抑制剂处于从大约2μm至大约10μm变动的浓度。在一些实施方案中，所述alk抑制剂为sb-431542、其衍生物或其变体。在一些情况下，所述alk抑制剂处于从大约1μm至大约10μm变动的浓度。在一些实施方案中，所述第一培养基和/或第二培养基没有动物血清。
[0222]
在一些实施方案中，所述方法还包括从非胰岛细胞分离sirpα衔接体胰岛细胞群体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括冷冻保存分离的低免疫性胰岛细胞群体。
[0223]
在一些方面，在本文中提供了分离的、经改造的sirpα衔接体视网膜色素上皮(rpe)细胞，其分化自sirpα衔接体细胞，其中已消除了内源β-2微球蛋白(b2m)基因活性和内源ii类反式激活蛋白(ciita)基因活性，在细胞表面上提供了sirpα衔接体分子，并且血型是o和rh-的。
[0224]
在一些实施方案中，所述分离的sirpα衔接体细胞rpe细胞选自由下列各项组成的组：rpe祖细胞、未成熟的rpe细胞、成熟的rpe细胞和功能性rpe细胞。
[0225]
在一些方面，在本文中提供了治疗罹患眼睛状况的患者的方法。所述方法包括施用组合物，所述组合物包含治疗有效量的在本文中所描述的分离的sirpα衔接体细胞rpe细胞中任一种的群体。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含在治疗上有效的承载体。在一些实施方案中，所述分离的低免疫性rpe细胞群体在生物可降解的支架上。在一些实施方案中，所述施用包括向患者的视网膜进行移植或注射。在一些实施方案中，所述眼睛状况选自由下列各项组成的组：湿性黄斑变性、干性黄斑变性、青少年黄斑变性、莱伯先天性黑矇、色素性视网膜炎和视网膜脱离。
[0226]
在一些方面，在本文中提供了通过体外分化从sirpα衔接体细胞群体产生sirpα衔接体视网膜色素上皮(rpe)细胞群体的方法，其中已消除了内源β-2微球蛋白(b2m)基因活性和内源ii类反式激活蛋白(ciita)基因活性，并且在细胞表面上提供了sirpα衔接体分子。所述方法包括：(a)在包含从由下列各项组成的组中选择的因子中任一种的第一培养基中培养所述sirpα衔接体细胞群体以产生前-rpe细胞群体：激活素a、bfgf、bmp4/7、dkk1、igf1、头发生素、bmp抑制剂、alk抑制剂、rock抑制剂和vegfr抑制剂；和(b)在与所述第一培养基不同的第二培养基中培养所述前-rpe细胞群体以产生低免疫性rpe细胞群体。
[0227]
在一些实施方案中，所述alk抑制剂为sb-431542、其衍生物或其变体。在一些情况
1640ec培养基，即包含2％ b-27减去胰岛素加上50ng/ml人血管内皮生长因子(vegf；r&d systems,minneapolis,mn，目录号293-ve-010)、10ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(fgfb；r&d systems，目录号233-fb-010)、10μm y-27632(sigma-aldrich,st.louis,mo，目录号y0503)和1μm sb 431542(sigma-aldrich,st.louis,mo，目录号s4317)的rpmi-1640。从第7天起可看见内皮细胞簇，并且将细胞维持在内皮细胞基础培养基2(promocell,heidelberg,germany，目录号c-22010)加上补充物，10％ fcs hi(gibco，目录号16-140-071)、1％pen/strep、25ng/ml vegf、2ng/ml fgfb、10μm y-27632和1μm sb 431542中。分化实验方案在14天后当在分化过程期间未分化的细胞脱落时完成。将tryple express(gibco，目录号12605010)用于每3至4天以1:3传代细胞。然后，用表达cd64的慢病毒载体转导b2m-/-ciita-/-ipsc-衍生的上皮细胞。在经预包被的12-孔平板中，将1.5
×
105个人b2m-/-ciita-/-iec在细胞特异性培养基中进行铺板，然后在37℃下在5％ co2下温育过夜。次日，以4的感染复数，将细胞与携带关于人cd64的转基因的慢病毒颗粒(nm_000566，origene，目录号rc207487l2v)一起温育过夜。向培养基添加polybrene(8μg/ml，millipore,burlington,ma)，并且在过夜温育之前将平板以800g离心30分钟。使用经bv421标记的抗人cd64抗体(克隆10.1，bd biosciences,san jose,ca，目录号305002)，在facsaria(bd biosciences)上分选细胞群体。
[0245]
当使用抗-sirpα抗体时的iec bli杀伤测定法。对fluc+b2m-/-ciita-/-iec和b2m-/-ciita-/-cd64转基因(tg)iec进行计数并且以1
×
103个细胞/96-孔平板的浓度进行铺板。将b2m-/-ciita-/-cd64 tg iec与抗-sirpα抗体(克隆p362，人igg1，creative biolabs，10μg/ml)一起温育30分钟。平行地，将cd3-cd7+cd56+原代人nk细胞与人il-2(life technologies)(以1μg/ml的浓度)一起预温育72小时。然后，将它们与抗-cd16 fab(克隆3g8，10μg/ml，ancell,bayport,mn)一起进行温育以封闭cd16并且防止随后的adcc。然后，将所有靶细胞与cd3-cd7+cd56+原代人nk细胞以10:1的e:t比例相混合。在bli杀伤测定法中4小时后，通过添加d-萤光素(promega，目录号p1041)来检测萤光素酶表达。作为对照，使靶细胞保持未处理，或者用在细胞特异性培养基中的2％ triton x-100进行处理。用ami ht(spectral instruments imaging)以p/s/cm2/sr来定量信号。
[0246]
实施例3：表达合成的sirpα衔接体融合蛋白的b2m-/-ciita-/-iec的生成
[0247]
用表达下列蛋白质的慢病毒载体转导b2m-/-ciita-/-iec：
[0248]
·
cd47-cd64 sirpα衔接体杂合蛋白：将cd47细胞外结构域(ecd)与cd64跨膜结构域(tmd)相融合(seq id no:16，cd47-cd64杂合体)；
[0249]
·
抗-sirpα-cd64衔接体融合蛋白：将三个抗-sirpαcdr与cd64 tmd相融合(seq id no:17，抗体融合物1)；
[0250]
·
抗-sirpα-cd64衔接体融合蛋白：将三个抗-sirpαcdr与cd64 tmd相融合(seq id no:18，抗体融合物2)。
[0251]
携带所述杂合体和融合物序列的慢病毒定购自gentarget,san diego,ca。在经预包被的12-孔平板中，将1.5
×
105个人b2m-/-ciita-/-iec在细胞特异性培养基中进行铺板，然后在37℃下在5％co2下温育过夜。次日，以4的感染复数，将细胞与携带sirpα衔接体融合蛋白的序列之一的慢病毒颗粒一起进行温育。次日，向培养基添加polybrene(8μg/ml，millipore)，并且在过夜温育之前将平板以800g离心30分钟。使用包括在慢病毒载体中的
rfp标签，在facsaria(bd biosciences)上分选细胞群体。
[0252]
实施例4：表达合成的sirpα衔接体融合蛋白的iec的bli杀伤测定法
[0253]
对表达cd47-cd64杂合蛋白、抗体融合物1蛋白或抗体融合物2蛋白的fluc+b2m-/-ciita-/-iec和b2m-/-ciita-/-iec进行计数并且以1
×
103个细胞/96-孔平板的浓度进行铺板。平行地，将原代人nk细胞与人il-2(life technologies)(以1μg/ml的浓度)一起预温育72小时。然后，将所有靶细胞与原代人nk细胞以10:1的e:t比例相混合。在bli杀伤测定法中4小时后，通过添加d-萤光素(promega，目录号p1041)来检测萤光素酶表达。作为对照，使靶细胞保持未处理，或者用在细胞特异性培养基中的2％ triton x-100进行处理。用ami ht(spectral instruments imaging)以p/s/cm2/sr来定量信号。
[0254]
当然后将nk细胞与fluc+b2m-/-ciita-/-iec一起进行温育时，大约85％的靶细胞在4小时内被快速杀伤，如通过其生物发光成像(bli)信号的下降所显示的。fluc+b2m-/-ciita-/-表达cd47-cd64杂合肽的iec被保护免于这样的强杀伤，并且观察到bli信号的显著更小的下降。cd47-cd64杂合肽的表达输送了免疫保护(图4)。
[0255]
用il-2刺激原代人nk细胞72小时。当然后将nk细胞与fluc+b2m-/-ciita-/-iec一起进行温育时，大约85％的靶细胞在4小时内被快速杀伤，如通过其bli信号的下降所显示的。然而，表达合成的抗-sirpα-cd64融合蛋白(抗体融合物1或抗体融合物2)的fluc+b2m-/-ciita-/-iec的杀伤显著减少。抗-sirpα-cd64融合蛋白输送了针对nk细胞杀伤的免疫保护(图5和6)。
[0256]
实施例5：表达具有sirpα衔接体功能的膜结合型抗-sirpα-tras-cd64融合蛋白的b2m-/-ciita-/-iec的生成
[0257]
两种分别携带抗-sirpα-tras-cd64融合蛋白重链或抗-sirpα-tras轻链的慢病毒定购自gentarget,san diego,ca。分开地包装重链和轻链以取得所述融合蛋白的良好的表达功效。在经预包被的12-孔平板中，将1.5
×
105个人b2m-/-ciita-/-iec在细胞特异性培养基中进行铺板，然后在37℃下在5％ co2下温育过夜。次日，将细胞与所述两种慢病毒颗粒(各自以4的感染复数)一起进行温育。次日，向培养基添加polybrene(8μg/ml，millipore)，并且在过夜温育之前将平板以800g离心30分钟。使用包括在慢病毒载体中的rfp标签，在facsaria(bd biosciences)上分选细胞群体。
[0258]
bli杀伤测定法如在实施例4中所概述的那样来进行。用il-2刺激原代人nk细胞72小时。当然后将nk细胞与fluc+b2m-/-ciita-/-iec一起进行温育时，大约85％的靶细胞在4小时内被快速杀伤，如通过其bli信号的下降所显示的。表达抗-sirpα-cd64融合蛋白的fluc+b2m-/-ciita-/-iec的杀伤显著减少。这显示，膜结合型抗-sirpα-tras-cd64融合蛋白在针对nk细胞杀伤对经改造的细胞进行保护方面是有效的(图7)。
[0259]
实施例6：表达具有sirpα衔接体功能的膜结合型抗-sirpα-scfv-cd8a-pdgf融合蛋白的b2m-/-ciita-/-iec的生成
[0260]
使用il-2信号肽来设计基于更小的scfv的融合蛋白(更小的sirpα衔接体分子)。经由与cd8a铰链肽和pdgf tmd相融合的(ggggs)3连接体将重链cdr连接至轻链cdr。由gentarget,san diego,ca将所述转基因包装入慢病毒中。如在实施例3中所概述的那样来进行转导。
[0261]
bli杀伤测定法如在实施例4中所描述的那样来进行。用il-2刺激原代人nk细胞72
小时。当然后将nk细胞与fluc+b2m-/-ciita-/-iec一起进行温育时，大约85％的靶细胞在4小时内被快速杀伤。表达抗-sirpα-scfv-cd8a-pdgf融合蛋白的fluc+b2m-/-ciita-/-iec的杀伤显著减少，这显示，膜结合型抗-sirpα-scfv-cd8a-pdgf融合蛋白在针对nk细胞杀伤对经改造的细胞进行保护方面是有效的(图8)。
[0262]
示例性序列：
[0263]
seq id no:1-人sirpα
[0264]
》np_001317657.1酪氨酸蛋白磷酸酶非受体型底物1同种型2前体[智人]
[0265]
mepagpapgrlgpllclllaascawsgvageeelqviqpdksvlvaagetatlrctatslipvgpiqwfrgagpgreliynqkeghfprvttvsdltkrnnmdfsirignitpadagtyycvkfrkgspddvefksgagtelsvrakpsapvvsgpaaratpqhtvsftceshgfsprditlkwfkngnelsdfqtnvdpvgesvsysihstakvvltredvhsqvicevahvtlqgdplrgtanlsetirvpptlevtqqpvraenqvnvtcqvrkfyp
[0266]
qrlqltwlengnvsrtetastvtenkdgtynwmswllvnvsahrd
[0267]
dvkltcqvehdgqpavskshdlkvsahpkeqgsntaaentgsnern
[0268]
iyivvgvvctllvallmaalylvrirqkkaqgstsstrlhepeknar
[0269]
eitqvqsldtndityadlnlpkgkkpapqaaepnnhteyasiqtspqp
[0270]
asedtltyadldmvhlnrtpkqpapkpepsfseyasvqvprk
[0271]
seq id no:2-人cd47
[0272]
》np_001768.1白细胞表面抗原cd47同种型1前体[智人]mwplvaalllgsaccgsaqllfnktksveftfcndtvvipcfvtnmeaqnttevyvkwkfkgrdiytfdgalnkstvptdfssakievsqllkgdaslkmdksdavshtgnytcevteltregetiielkyrvvswfspnenilivifpifaillfwgqfgiktlkyrsggmdektiallvaglvitvivivgailfvpgeyslknatglglivtstgilillhyyvfstaigltsfviailviqviayilavvglslciaacipmhgpllisglsilalaqllglvymkfvasnqktiqpprkaveeplnafkeskgmmnde
[0273]
seq id no:3：cd47细胞外结构域(ecd)
[0274]
qllfnktksveftfcndtvvipcfvtnmeaqnttevyvkwkfkgrd
[0275]
iytfdgalnkstvptdfssakievsqllkgdaslkmdksdavshtgn
[0276]
ytcevteltregetiielkyrvvswfspne
[0277]
seq id no:4：cd47免疫球蛋白超家族结构域qllfnktksveftfcndtvvipcfvtnmeaqnttevyvkwkfkgrdiytfdgalnkstvptdfssakievsqllkgdaslkmdksdavshtgnytcevteltregetiielkyrvv
[0278]
seq id no:5：抗-sirpαcdr(包含seq id no:6-8)
[0279]
qvqlvesegglvqpggslrlscaasgftfssyemnwvrqapgkgle
[0280]
wvsyisssgstiyyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavy
[0281]
ycareakgyyygmdvwgqgttvtvss
[0282]
seq id no:6：抗-sirpαcdr
[0283]
ftfssyemn
[0284]
seq id no:7：抗-sirpαcdr
[0285]
wvsyisssgstiyy
[0286]
seq id no:8：抗-sirpαcdr
[0287]
reakgyyygmdv
[0288]
seq id no:9：抗-sirpαcdr(包含seq id no:10-12)
[0289]
qpvltqspsvsvspgqtasitcsgdklgdtyacwyqqkpgqspvlviyqdtkrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqamdeadyycqawdsstvvfgggtkltvl
[0290]
seq id no:10：抗-sirpαcdr
[0291]
klgdtyac
[0292]
seq id no:11：抗-sirpαcdr
[0293]
lviyqdtkrps
[0294]
seq id no:12：抗-sirpαcdr
[0295]
qawdsstv
[0296]
seq id no:13：cd47跨膜结构域(tmd)
[0297]
nilivifpifaillfwgqfgiktlkyrsggmdektiallvaglvitvivivgailfvpgeyslknatglglivtstgilillhyyvfstaigltsfviailviqviayilavvglslciaacipmhgpllisglsilalaqllglvym
[0298]
seq id no:14：cd64跨膜结构域(tmd)
[0299]
vlfylavgimflvntvlwvti
[0300]
seq id no:15：cd47细胞内结构域(icd)
[0301]
kfvasnqktiqpprkaveeplnafkeskgmmnde
[0302]
seq id no:16：与cd64 tmd相融合的cd47 ecd
[0303]
qllfnktksveftfcndtvvipcfvtnmeaqnttevyvkwkfkgrdiytfdgalnkstvptdfssakievsqllkgdaslkmdksdavshtgnytcevteltregetiielkyrvvswfspnevlfylavgimflvntvlwvti
[0304]
seq id no:17：与cd64 tmd相融合的三个抗-sirpαcdr(抗体融合物1)
[0305]
qvqlvesegglvqpggslrlscaasgftfssyemnwvrqapgkglewvsyisssgstiyyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycareakgyyygmdvwgqgttvtvssvlfylavgimflvntvlwvti
[0306]
seq id no:18：与cd64 tmd相融合的三个抗-sirpαcdr(抗体融合物2)
[0307]
qpvltqspsvsvspgqtasitcsgdklgdtyacwyqqkpgqspvlviyqdtkrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqamdeadyycqawdsstvvfgggtkltvlvlfylavgimflvntvlwvti
[0308]
seq id no:19：cd8a信号肽
[0309]
malpvtalllplalllhaarp
[0310]
seq id no:20：曲妥珠单抗重链
[0311]
stkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0312]
seq id no:21：l1信号肽
[0313]
mdmrvpaqllgllllwlsgarc
[0314]
seq id no:22：曲妥珠单抗轻链
[0315]
vaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0316]
seq id no:23：抗-sirpα-tras-cd64融合蛋白重链
[0317]
malpvtalllplalllhaarpqvqlvesegglvqpggslrlscaasgftfssyemnwvrqapgkglewvsyisssgstiyyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycareakgyyygmdvwgqgttvtvssstkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkvlfylavgimflvntvlwvti
[0318]
seq id no:24：抗-sirpα-tras-轻链
[0319]
mdmrvpaqllgllllwlsgarcqpvltqspsvsvspgqtasitcsgdklgdtyacwyqqkpgqspvlviyqdtkrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqamdeadyycqawdsstvvfgggtkltvlrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0320]
seq id no:25：il-2信号肽
[0321]
myrmqllscialslalvtns
[0322]
seq id no:26：cd8a铰链
[0323]
tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyc
[0324]
seq id no:27：pdgf跨膜结构域(tmd)
[0325]
aavlvllviviislivlvviw
[0326]
seq id no:28：抗-sirpα-scfv-cd8a-pdgf融合蛋白
[0327]
myrmqllscialslalvtnsqvqlvesegglvqpggslrlscaasgftfssyemnwvrqapgkglewvsyisssgstiyyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycareakgyyygmdvwgqgttvtvssggggsggggsggggsqpvltqspsvsvspgqtasitcsgdklgdtyacwyqqkpgqspvlviyqdtkrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqamdeadyycqawdsstvvfgggtkltvltttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycaavlvllviviislivlvviw
[0328]
在本文中所公开或提及的所有出版物和专利文献均通过提及而以其整体合并。上面的说明书仅为了举例说明和描述的目的而呈现。该说明书并不意欲将本发明限制于所公开的精确形式。所意欲的是，本发明的范围由所附的权利要求书来定义。

技术特征：
1.sirp-α衔接体细胞，其包含与在免疫细胞上的信号调节蛋白α(sirpα)这种蛋白质相衔接的在细胞表面上的衔接体分子，其中所述衔接阻止所述衔接体细胞被所述免疫细胞杀伤，其中所述细胞表面分子缺乏有功能的cd47细胞内结构域。2.权利要求1的sirp-α衔接体细胞，其中所述衔接体分子为蛋白质。3.权利要求2的sirp-α衔接体细胞，其中所述蛋白质为融合蛋白。4.权利要求3的sirp-α衔接体细胞，其中所述融合蛋白包含cd47细胞外结构域(ecd)。5.权利要求4的sirp-α衔接体细胞，其中所述cd47 ecd与seq id no:3具有至少90％序列同一性。6.权利要求5的sirp-α衔接体细胞，其中所述cd47 ecd包含seq id no:3的所述序列。7.权利要求1-5中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述衔接体分子包含免疫球蛋白超家族结构域。8.权利要求7的sirp-α衔接体细胞，其中所述免疫球蛋白超家族结构域与seq id no:4具有至少90％序列同一性。9.权利要求7的sirp-α衔接体细胞，其中所述免疫球蛋白超家族结构域包含seq id no:4的序列。10.权利要求1-3中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述衔接体分子包含与sirpα相结合的抗体fab或单链可变片段(scfv)。11.权利要求10的sirp-α衔接体细胞，其中所述fab或scfv以通过其解离常数(kd)而测量的亲和力与sirpα相结合，其中所述kd在大约10-7
和10-13
m之间。12.权利要求1-3中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述衔接体分子包含一个或多个与sirpα相结合的抗体互补性决定区(cdr)。13.权利要求12的sirp-α衔接体细胞，其中所述一个或多个cdr与seq id no:5至12中任一个具有至少90％序列同一性。14.权利要求12的sirp-α衔接体细胞，其中所述一个或多个cdr包含seq id no:5至12中任一个的序列。15.权利要求12的sirp-α衔接体细胞，其中所述一个或多个cdr与seq id no:5具有至少90％序列同一性。16.权利要求12的sirp-α衔接体细胞，其中所述一个或多个cdr包含seq id no:5的序列。17.权利要求12的sirp-α衔接体细胞，其中所述一个或多个cdr与seq id no:9具有至少90％序列同一性。18.权利要求12的sirp-α衔接体细胞，其中所述一个或多个cdr包含seq id no:9的序列。19.权利要求1-18中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述衔接体分子为包含异源跨膜结构域(tmd)的融合蛋白。20.权利要求19的sirp-α衔接体细胞，其中所述tmd包含单个α螺旋、多个α螺旋或卷起的β片层。21.权利要求19的sirp-α衔接体细胞，其中所述异源tmd选自由下列各项组成的组：cd85f、cd349、cd284、cd261、cd172b、cd277、cd186、cd156c、cd304、cd254、cd263、cd267、
cd337、cd170、cd283、cd133、cd327、cd205、cd232、cd282、cd16b、cd85i、cd85a、cd85c、cd275、cd108、cd358、cd335、cd218b、cd355、cd336、cd160、cd25、cd4、cd8a、cd235a、cd233、cd230、cd90、cd74、cd3d、cd340、cd236、cd61、cd18、cd54、cd29、cd1a、cd5、cd220、cd2、cd66e、cd51、cd141、cd115、cd42b、cd221、cd271、cd55、cd243、cd98、cd10、cd41、cd14、cd45、cd228、cd16a、cd49e、cd126、cd63、cd48、cd7、cd140b、cd3g、cd117、cd28、cd8b、cd37、cd11b、cd107a、cd331、cd222、cd20、cd79a、cd64、cd32、cd143、cd324、cd42c、cd107b、cd56、cd102、cd49d、cd66a、cd142、cd59、cd62l、cd121a、cd122、cd13、cd155、cd119、cd19、cd116、cd46、cd1e、cd1d、cd227、cd44、cd62p、cd104、cd43、cd140a、cd31、cd152、cd326、cd62e、cd36、cd127、cd49b、cd105、cd35、cd223、cd138、cd325、cd58、cd106、cd53、cd120a、cd224、cd21、cd33、cd22、cd120b、cd11a、cd11c、cd363、cd73、cd88、cd204、cd332、cd9、cd203a、cd334、cd333、cd206、cd49f、cd238、cd252、cd89、cd124、cd181、cd182、cd24、cd95、cd40、cd49c、cd159a、cd159c、cd314、cd27、cd123、cd26、cd82、cd121b、cd34、cd38、cd30、cd1b、cd1c、cd154、cd6、cd52、cd132、cd32、cd66b、cd171、cd191、cd197、cd185、cd131、cd50、cd70、cd153、cd144、cd80、cd362、cd68、cd361、cd147、cd309、cd135、cd292、cd103、cd130、cd42d、cd66d、cd66c、cd96、cd110、cd79b、cd200、cd192、cd231、cd86、cd212、cd118、cd146、cd134、cd158a、cd158b1、cd158b2、cd158e、cd158k、cd158j、cd158i、cd178、cd295、cd151、cd97、cd183、cd39、cd239、cd193、cd194、cd195、cd196、cdw198、cdw199、cd296、cd298、cd49a、cd322、cd85g、cd184、cd172a、cd156a、cd339、cd156b、cd213a1、cd129、cd83、cd125、cd241、cd269、cd202b、cd87、cd164、cd136、cd137、cd249、cd69、cd91、cdw210b、cd167a、cd300c、cd47、cd157、cd317、cd148、cd161、cd215、cd150、cd11d、cd218a、cd210、cd166、cd162、cd213a2、cd242、cd158g、cd158h、cd279、cd111、cd281、cd226、cd234、cd167b、cd300e、cd276、cd305、cd300g、cd300d、cd109、cd272、cd163、cd302、cd158f1、cd85h、cd85d、cd177、cd158z、cd158f2、cd85j、cd300f、cd92、cd351、cd112、cd100、cd270、cd101、cd297、cd316、cd352、cd217、cd307b、cd307a、cd307c、cd307d、cd307e、cd114、cd180、cd158d、cd273、cd290、cd244、cd169、cd299、cd318、cd360、cd229、cd248、cd354、cd320、cd93、cd319、cd113、cd163b、cd289、cd288、cd329、cd274、cd353、cd172g、cd315、cd280、cd264、cd300a、cd312、cd84、cd344、cd350、cd246、cd201、cd338、cd208、cd257、cd328、cd286、cd357、cd294、cd321、cd265、cd278、itga7、itga8、itga9、itga10、itga11、cd51、cd41、cd29、cd18、cd61、cd104和pdgf。22.权利要求19的sirp-α衔接体细胞，其中所述tmd包含与seq id no:13、seq id no:14或seq id no:27具有至少90％序列同一性的序列。23.权利要求19的sirp-α衔接体细胞，其中所述tmd包含seq id no:13、seq id no:14或seq id no:27的序列。24.权利要求1-23中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述衔接体分子不具有细胞内结构域(icd)。25.权利要求1-23中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述衔接体分子具有来自cd16、cd32、cd64、cd8、cd3、cd28或cd137的细胞内结构域。26.权利要求1的sirp-α衔接体细胞，其中所述衔接体分子包含icd，所述icd包含由于在seq id no:15序列中的一个或多个突变而产生的无功能的cd47 icd。
27.权利要求1的sirp-α衔接体细胞，其中所述衔接体分子包含icd，所述icd包含由于在seq id no:15序列中的一个或多个缺失或插入而产生的无功能的cd47 icd。28.权利要求2-27中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述衔接体分子具有一个或多个联结ecd、tmd或icd序列的连接体或铰链区。29.权利要求19的sirp-α衔接体细胞，其中所述tmd来自7次跨膜蛋白(7tm)或免疫球蛋白细胞表面蛋白。30.权利要求2-29中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述细胞表面蛋白为抗体、受体、配体或黏着蛋白。31.权利要求1-6中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述sirpα衔接体细胞产生自锚固到所述细胞表面上的cd47融合蛋白。32.权利要求1-18中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述衔接体分子经由来自免疫球蛋白g(igg)的cd64相互作用结构域与cd64相互作用。33.权利要求1-3中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述衔接体分子包含与seq id no:20或seq id no:22具有至少90％序列同一性的蛋白质。34.权利要求33的sirp-α衔接体细胞，其中所述衔接体分子包含具有seq id no:20或seq id no:22的序列的蛋白质。35.权利要求1-3中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述衔接体分子包含与seq id no:23或seq id no:24具有至少90％序列同一性的蛋白质。36.权利要求35的sirp-α衔接体细胞，其中所述衔接体分子包含具有seq id no:23或seq id no:24的序列的蛋白质。37.权利要求1-3中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述衔接体分子包含与seq id no:28具有至少90％序列同一性的蛋白质。38.权利要求1-3中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述衔接体分子包含具有seq id no:28的序列的蛋白质。39.权利要求1-38中任一项的sirp-α衔接体细胞，其进一步包含减少或消除的hla-i或hla-ii表达。40.权利要求1-39中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述细胞是abo血型o型的。41.权利要求1-40中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述细胞是猕猴因子阴性的(rh-)。42.权利要求1-41中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述细胞具有减少或消除的从由下列各项组成的组中选择的abo血型抗原：a1、a2和b。43.权利要求1-42中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述细胞具有减少或消除的从由下列各项组成的组中选择的rh蛋白抗原表达：rh c抗原、rh e抗原、kell k抗原(kel)、duffy(fy)fya抗原、duffy fy3抗原、kidd(jk)jkb抗原、mns抗原u和mns抗原s。44.权利要求1-43中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述细胞为低免疫原性(hi)细胞，其包含：当与未修饰的亲本细胞相比较时降低的内源性i类主要组织相容性复合体(hla-i)功能，和当与所述未修饰的亲本细胞相比较时降低的内源性ii类主要组织相容性复合体(hla-ii)功能。45.权利要求1-44中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述衔接体细胞包含相对于野
生型干细胞而言下列中的一种或多种的经调制的表达：hla-i人白细胞抗原、hla-ii人白细胞抗原、cd64、cd47、cd38、ccr5、cxcr4、nlrc5、ciita、b2m、hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-g、pd-l1、ctla-4-ig、cd47、ci-抑制剂、il-35、rfx-5、rfxap、rfxank、nfy-a、nfy-b、nfy-c、irf-1、ox40、gitr、4-1bb、cd28、b7-1、b7-2、icos、cd27、hvem、slam、cd226、pd1、ctl4、lag3、tigit、tim3、cd160、btla、cd244、cd30、tlt、vista、b7-h3、pd-l2、lfa-1、cd2、cd58、icam-3、tcra、tcrb、foxp3、helios、st2、pcsk9、apoc3、cd200、faslg、clc21、mfge8、serpin b9、tgfβ、cd73、cd39、lag3、il1r2、ackr2、tnfrsf22、tnfrsf23、tnfrs10、dad1和/或ifnγr1 d39，其中所述衔接体细胞是abo血型o型的或猕猴因子阴性的(rh-)。46.权利要求1-45中任一项的sirp-α衔接体细胞，其进一步包含在细胞表面上的抗体fc受体的升高的表达，其中所述fc受体帮助逃避抗体依赖性细胞毒性(adcc)或补体介导的细胞毒性(cdc)。47.权利要求46的sirp-α衔接体细胞，其中所述fc受体为cd16、cd32或cd64。48.权利要求1-47中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述细胞是多能的。49.权利要求48的sirp-α衔接体细胞，其中所述细胞为低免疫性多能(hip)细胞。50.权利要求49的sirp-α衔接体细胞，其中所述细胞为具有abo血型o的低免疫性多能细胞(hipo)。51.权利要求48的sirp-α衔接体细胞，其中所述细胞为rh因子阴性的低免疫性多能细胞(hip-)。52.权利要求48的衔接体细胞，其中所述细胞为具有abo血型o的低免疫性多能细胞并且是rh因子阴性的(hipo-)。53.权利要求48的sirp-α衔接体细胞，其中所述细胞为多能干细胞(psc)、诱导型psc(ipsc)或胚胎干细胞(esc)。54.权利要求1-47中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述衔接体细胞是特定组织类型的。55.权利要求54的sirp-α衔接体细胞，其中所述细胞为嵌合抗原受体(car)细胞、t细胞、nk细胞、内皮细胞、多巴胺能神经元、心脏细胞、胰岛细胞或视网膜色素上皮细胞。56.权利要求55的sirp-α衔接体细胞，其中所述car细胞为car-t或car-nk细胞。57.权利要求1-47或54-56中任一项的sirp-α衔接体细胞，其中所述衔接体细胞分化自多能细胞。58.药学组合物，其包含权利要求54-57中任一项的sirp-α衔接体细胞，和在药学上可接受的承载体。59.药物，其包含权利要求54-57中任一项的sirp-α衔接体细胞，和在药学上可接受的承载体。60.在受试者中治疗疾病的方法，其包括将权利要求54-57中任一项的sirp-α衔接体细胞移植到所述受试者中。61.权利要求54的方法，其中所述疾病为1型糖尿病、心脏疾病、神经学疾病、内分泌疾病、癌症、失明或血管疾病。62.权利要求54-57中任一项的sirp-α衔接体细胞在制备药学组合物中的用途，所述药学组合物用于在受试者中治疗疾病。
63.权利要求54-57中任一项的sirp-α衔接体细胞用于在受试者中治疗疾病的用途。64.权利要求62或63中任一项的用途，其中所述疾病为1型糖尿病、心脏疾病、神经学疾病、内分泌疾病、癌症、失明或血管疾病。

技术总结
本发明提供了当与具有未修饰的SIRPα衔接功能的亲本细胞相相比较时具有增加的信号调节蛋白α(SIRPα)衔接功能的细胞(SIRPα衔接体细胞)，其在被移植到受试者中时抵抗先天免疫。所述SIRPα衔接体细胞缺乏完整的CD47胞质信号传导功能。在一些实施方案中，所述SIRPα衔接体细胞为低免疫性细胞。在另一些实施方案中，所述SIRPα衔接体细胞为经分化的体细胞。在另一些实施方案中，所述SIRPα衔接体细胞为低免疫性多能(HIP)细胞。在进一步的实施方案中，所述HIP细胞是O血型的(HIPO)，猕猴因子(Rh)阴性的(HIP-)，或者O血型和Rh-的(HIPO-)。在另一些实施方案中，所述SIRPα衔接体细胞衍生或分化自HIP、HIP-或HIPO-细胞。在另一些实施方案中，所述SIRPα衔接体细胞包含抗体Fc受体以针对抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)进行保护。在另一些实施方案中，所述SIRPα衔接体细胞通过升高的细胞表面CD16、CD32或CD64表达来逃避ADCC或CDC。CDC。CDC。


技术研发人员：T
受保护的技术使用者：加利福尼亚大学董事会
技术研发日：2021.12.06
技术公布日：2023/10/5