一种用于显微操作的流水线悬浮细胞转运方法及平台

1.本发明涉及自动化显微操作领域，尤其涉及一种用于显微操作的流水线悬浮细胞转运平台。


背景技术：

2.近些年显微操作技术，如细胞微操作、显微注射等，在生命科学领域相关的研究与实践中得到广泛应用。然而，从事显微注射的相关人员培养训练周期长，以及手工操作存在精度低、可控性低、稳定性低以及重复性差等局限性，限制了相关研究与实践的效率。为提升显微操作的精度、可控性、稳定性及重复性，以及减少对专业人员的依赖，自动化显微操作得到广泛研究。但是自动化显微操作过程由于对于被操作细胞的位置控制要求较高难以实现真正的自动化。因此，如何实现流水线悬浮细胞转运十分关键。现有的细胞转运方法和平台，无法用于流水线操作，只适用于小批量的细胞，即当细胞完成培养之后，操作人员手动地移动显微镜附带的载物台，利用图像反馈筛选合适的细胞，再进行捕获和转移，重复上述过程，直至所有的细胞都完成了固定和转移才会进入显微操作过程，期间会进行多次的物镜转换、电动平台的移动和焦距的调节，过程不具备连续性，限制了显微操作效率。


技术实现要素：

3.本发明针对现有技术的不足，提出了一种用于显微操作的流水线悬浮细胞转运平台。在本发明中，由数码相机获取液滴在光学显微镜下的成像，通过机器视觉获取液滴的位置信息，基于机器视觉获取的液滴在二维平面内的位置信息包含两部分，一部分为液滴在转运平台中的绝对位置信息，另一部分为液滴相对于微流控芯片上微通道的曲面位置信息。通过流量传感器可获取液滴在转运平台内的移动参数。结合机器视觉与流量传感器的反馈信息，获得液体在转运平台中的压力信息。基于上述信息以及压力控制器反馈的压力信息，改变压力控制器和微量注射泵的压力输出，控制细胞在转运平台中的运动速度，使细胞在转运平台中的运动路径和运动趋势可控，实现流水线细胞转运。微量注射泵是一新型泵力仪器，将少量流体精确、微量、均匀、持续地输出。微量注射泵由控制器，执行机构和注射器组成，同时能提供负压或正压用于吸取细胞，是显微操作中常用的器件。
4.本发明是通过以下技术方案实现的：
5.一种用于显微操作的流水线悬浮细胞转运方法，其本质是在细胞运动过程中基于液滴检测获取的反馈信息，进行液滴控制，并最终实现流水线细胞转运；该方法首先制备悬浮细胞悬液并吸取部分液体至微流控芯片，将所述微流控芯片放置于光学显微镜载物台上，并利用压力控制器对微流控芯片实施灌流操作使液体保持流动状态，具体包括以下步骤：
6.液滴检测：利用数码相机获取运动液滴在光学显微镜下的成像，通过机器视觉获取液滴在二维平面内的位置信息；通过流量传感器获取液滴在微流控芯片内的移动参数；通过压力控制器获取灌流的压力信息；
7.液滴控制：基于液滴在二维平面内的位置信息，获得液滴在微流控芯片中的压力信息；结合液滴在微流控芯片中的压力信息、液滴在微流控芯片内的移动参数以及灌流的压力信息，改变压力控制器和微量注射泵的压力输出，控制液滴大小不变同时使液滴在转运平台(微流控芯片)中的运动速度趋近于期望的细胞运动速度；
8.重复执行液滴检测和液滴控制，使细胞在转运平台中的移动速度(液体在转运平台中的运动速度)与期望的细胞运动速度一致，从而保证细胞始终处于理想的位置，实现流水线细胞转运过程。
9.上述技术方案中，进一步地，所述二维平面内的位置信息包含两部分，一部分为细胞在转运平台中的绝对位置信息，另一部分为液滴相对于微流控芯片微通道的曲面位置信息。
10.进一步地，所述通过流量传感器获取液滴在微流控芯片内的移动参数具体方法为，通过流量传感器的液体流量信息，获取悬浮细胞的运动方向、速度和距离。
11.进一步地，所述液滴相对于微流控芯片微通道的曲面位置信息具体包括：液滴的大小信息、曲率半径信息和压力信息。
12.进一步地，所述转运方法具体包括如下步骤：
13.细胞的初始状态为静止状态，且位于转运平台的入口；
14.基于压力控制器的输出压力p和微量注射泵的输出压力pc，细胞跟随液体开始流动；
15.待细胞开始运动后，基于数码相机反馈的图像信息，基于模板匹配算法检测t时刻细胞的位置信息d
t
和液滴的曲面位置信息dm；
16.计算因表面张力改变，t时刻液滴的压力信息pb：p0为大气压力，γ为液体的表面张力系数；
17.根据流量传感器反馈的流量信息，计算细胞的速度信息u：其中，q为流量传感器反馈的流量，d为管道的直径；
18.计算因管道摩擦阻力和连接件引入的压力误差信息，其中，μ为液体的粘性系数，l为管道的长度；
19.基于误差信息δp，计算微量注射泵的输出压力其中，ρ为液体的密度，改变微量注射泵的压力输出，控制液滴大小和相对位置不变；
20.根据微量注射泵的输出压力p
cnew
，改变压力控制器的输出压力p
new
：：其中，uc是期望的液滴速度，实现细胞运动速度的控制；
21.重复执行上述步骤，直至细胞运动速度与期望的细胞速度一致。
22.其中，压力控制器的压力与微量注射泵的压力调整顺序并不固定，可互换。
23.本发明另一方面提供了一种用于显微操作的流水线悬浮细胞控制系统，系统包括液滴检测系统以及液滴控制系统。
24.所述液滴检测系统：由ccd相机获取光学显微镜成像，通过机器视觉获取液滴在二维平面内的位置信息；通过流量传感器获取细胞运动信息，通过压力控制器获取灌流的压
力信息；
25.所述液滴控制系统，基于液滴在二维平面内的位置信息，获得液滴在微流控芯片中的压力信息；结合液滴在微流控芯片中的压力信息、液滴在微流控芯片内的移动参数以及灌流的压力信息，改变压力控制器和微量注射泵的压力输出，控制细胞在微流控芯片中的运动速度，使细胞在转运平台中的运动路径和运动趋势可控。
26.更进一步地，所述的微流控芯片微通道用于保证在满足细胞转运的同时实现显微操作，所述微流控芯片微通道由横向微通道和纵向微通道构成；
27.所述横向微通道位于微流控芯片内部，用于细胞的转运；所述横向微通道的两端与两个贯通所述微流控芯片的通孔相连，所述横向微通道的一端与储液池的出口相连，另一端与微量注射泵相连；
28.所述纵向微通道为首尾相通的通道，所述纵向微通道的顶部贯通微流控芯片，其余部分位于微流控芯片内部，所述纵向微通道可吸纳多余的液体，防止液体渗漏影响环境和器材；所述横向微通道与纵向微通道十字交叉部分相通，用于辅助定位注射微针的显微操作区域。
29.本发明的有益效果如下：
30.本发明的一种用于显微操作的流水线悬浮细胞转运方法，液滴检测基于ccd相机传感器反馈信息，同时融合了流量传感器的反馈信息，保证细胞在任意运动下，都可实现液滴检测，同时可避免繁琐的操作步骤；其中，液滴检测的关键点在于利用表面张力及时地根据液滴的曲面位置信息的变化计算当时液滴的压力信息，然后根据液滴的压力信息和伯努利方程去调整微量注射泵的压力输出，控制液滴相对位置不变，优点在于可以根据图像反馈及时的做出调整，而且计算的过程简单，可以显著提高效率。同时控制液滴的位置有利于显微操作的进行，提高其成功率；对于细胞转运，由于本发明方法可实现流水线转运，故转运的速度要明显比现有手动转运更快。本发明提供一种结构简单、调试方便、可基于现有商用器件实现的光学显微镜下悬浮细胞的流水线转运平台，可应用于基于光学显微镜搭建的显微操作平台，在细胞微操、显微注射以及其他相关生命科学领域具备广泛的应用前景。
附图说明
31.图1为本发明的转运方法流程图；
32.图2为转运平台控制系统示意图；
33.图3为液滴表面的力学示意图；
34.图4为微流控芯片的结构图；
35.图5为微流控芯片的流动仿真图。
具体实施方式
36.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
37.如图1所示为本发明的用于显微操作的流水线悬浮细胞转运方法流程图，首先，制备悬浮细胞悬液并吸取部分液体至微流控芯片，将所述微流控芯片放置于光学显微镜载物
台上，并利用压力控制器对微流控芯片实施灌流操作使液体保持流动状态；该方法包括以下步骤：
38.液滴检测：利用ccd相机传感器获取显微镜成像、传输图像至计算机提取液滴在二维平面内的位置信息、流量传感器获取细胞运动信息、通过压力传感器获取灌流的压力信息并传输至计算机；
39.液滴控制：基于液滴在二维平面内的位置信息，获得液滴在微流控芯片中的压力信息；结合液滴在微流控芯片中的压力信息、液滴在微流控芯片内的移动参数以及灌流的压力信息，改变压力控制器和微量注射泵的压力输出，控制液滴大小不变同时使液滴在转运平台(微流控芯片)中的运动速度趋近于期望的细胞运动速度。
40.重复上述液滴检测和液滴控制，实现光学显微镜下细胞的稳定控制。
41.实际操作时，可以先改变压力控制器的输出压力，控制液滴大小不变，再根据预先设定的流速调整微量注射泵的压力信息，不断使得转运平台内的液滴流速靠近设定值，重复上述步骤直至流速达到预期。改变压力控制器的输出压力，控制液滴大小不变，具体方法是：通过改变压力控制器的输出压力，以此实现减小液滴的膨胀速度从而保持相对的稳定状态。
42.所述ccd相机传感器获取显微镜成像过程，由光学显微镜负责成像，ccd相机拍摄。
43.所述计算机提取细胞位置信息和液滴曲面位置信息过程，由计算机通过模板匹配算法对ccd相机拍摄图像进行处理，提取细胞位置信息和液滴曲面位置信息。
44.所述流量传感器获取转运平台内细胞运动信息。
45.所述计算机与ccd相机传感器反馈信息融合并提取液滴在二维平面内的位置信息，基于图像反馈获取的液滴在二维平面内的位置信息包含两部分，一部分为细胞在转运平台中的绝对位置信息，另一部分为液滴相对于微流控芯片微通道的曲面位置信息。通过流量传感器，可获取细胞在转运平台内的移动参数。结合机器视觉与流量传感器的反馈信息，和压力控制器反馈的压力信息，改变压力控制器和微量注射泵的压力输出，控制细胞在微流控芯片中的运动速度，使细胞在转运平台中的运动路径和运动趋势可控。
46.用于显微操作的流水线悬浮细胞转运平台，包括液滴检测系统以及液滴控制系统；所述各系统组成一个反馈控制环路。
47.所述液滴检测系统，由ccd相机传感器获取显微镜成像，并通过机器视觉提取液滴的曲面位置信息，通过流量传感器获取液滴在微流控芯片内的移动参数，通过压力控制器获取灌流的压力信息。
48.所述液滴控制系统，基于液滴在二维平面内的位置信息，计算液滴在二维平面内的位置信息的压力信息；结合液滴在微流控芯片中的压力信息、液滴在微流控芯片内的移动参数以及灌流的压力信息，改变压力控制器和微量注射泵的压力输出，控制细胞在微流控芯片中的运动速度，使细胞在转运平台中的运动路径和运动趋势可控。
49.如图2所示为转运平台结构示意图，其中，显微镜为电动倒置光学显微镜，控制器为双通道可调压力控制器并配置流量传感器，转运平台采用自行设计的微流控芯片，本实例以倒置显微镜配备40倍物镜，流量传感器量程为ul/min级别。
50.细胞的初始状态为静止状态，且位于转运平台的入口。
51.待压力控制器和微量注射泵开始初始压力输出之后，开始液滴检测：基于ccd反馈
的图像信息，检测细胞的位置信息d
t
和液滴的曲面位置信息dm，检测算法为模板匹配算法；通过流量传感器反馈的流量信息计算细胞的速度信息u：其中，q为流量传感器反馈的流量，d为管道的直径。
52.计算因表面张力改变，t时刻液滴的压力信息其中，p0为大气压力，γ为液体的表面张力系数；
53.计算因管道摩擦阻力和连接件引入的压力误差信息其中，μ为液体的粘性系数，l为管道的长度；
54.基于误差信息δp，计算微量注射泵的输出压力p
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：其中，ρ为液体的密度；改变微量注射泵的压力输出，控制液滴大小和相对位置不变。
55.根据微量注射泵的输出压力p
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，改变压力控制器的输出压力p
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：：其中，uc是期望的液滴速度，实现细胞运动速度的控制。
56.在悬浮细胞流水线转运过程中，重复执行液滴检测，液滴控制过程，直至细胞运动速度与期望的细胞速度一致，实现悬浮细胞流水线转运。
57.如图3所示，液滴的液面因为表面张力的作用，液滴表面内外的压强差与液滴的曲率半径和液体的表面张力系数有关，因此根据检测到的液滴曲面位置信息可以准确表征液滴内部的压力变化。
58.如图4所示，所述微流控芯片微通道由横向微通道和纵向微通道构成；所述横向微通道位于微流控芯片内部，用于细胞的转运；所述横向微通道的两端与两个贯通所述微流控芯片的通孔相连，所述横向微通道的一端与储液池的出口相连，另一端与微量注射泵相连；所述纵向微通道为首尾相通的通道，所述纵向微通道的顶部贯通微流控芯片，其余部分位于微流控芯片内部，所述纵向微通道可吸纳多余的液体，防止液体渗漏影响环境和器材；所述横向微通道与纵向微通道十字交叉部分相通，用于辅助定位注射微针的显微操作区域。
59.由图5可知，液体从左端流入，在十字交叉处发散之后又重新汇聚，从右端流出。图中的颜色深浅表示了微通道内液体的体积分数，颜色越蓝，表示液体的体积分数越高，反之，颜色越红，表示液体的体积分数越低。从图中可以看出，在横向微通道内，液体占据了绝大部分，在十字交叉处，液体形成了液滴的形式。本发明设计的通道结构可保证液体即使无法形成液滴也不会大面积的向纵向微通道的两端渗漏，保证了显微操作时液体不会干扰执行机构。
60.以上参照附图描述了本发明的具体实施方式。但是，本领域中的普通技术人员能够理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，还可以对本发明的具体实施方式作各种变更和替换。这些变更和替换都落在本发明权利要求书所限定的范围内。

技术特征：
1.一种用于显微操作的流水线悬浮细胞转运方法，其特征在于，首先，制备悬浮细胞悬液并吸取部分液体至微流控芯片，将所述微流控芯片放置于光学显微镜载物台上，并利用压力控制器对微流控芯片实施灌流操作使液体保持流动状态；所述转运方法具体包括以下步骤：步骤1、液滴检测：利用数码相机获取运动液滴在光学显微镜下的成像，通过机器视觉获取液滴在二维平面内的位置信息；通过流量传感器获取液滴在微流控芯片内的移动参数；通过压力控制器获取灌流的压力信息；步骤2、液滴控制：基于液滴在二维平面内的位置信息，获得液滴在微流控芯片中的压力信息；结合液滴在微流控芯片中的压力信息、液滴在微流控芯片内的移动参数以及灌流的压力信息，改变压力控制器和微量注射泵的压力输出，控制液滴大小不变同时使液滴在微流控芯片中的运动速度趋近于期望的细胞运动速度；步骤3、重复执行液滴检测和液滴控制，使细胞在转运平台中的移动速度与期望的细胞运动速度一致，使细胞在转运平台中的运动路径和运动趋势可控，实现流水线细胞转运。2.根据权利要求1所述的一种用于显微操作的流水线悬浮细胞转运方法，其特征在于，所述二维平面内的位置信息包含两部分，一部分为细胞在转运平台中的绝对位置信息，另一部分为液滴相对于微流控芯片微通道的曲面位置信息。3.根据权利要求1所述的一种用于显微操作的流水线悬浮细胞转运方法，其特征在于，所述通过流量传感器获取液滴在微流控芯片内的移动参数具体方法为，通过流量传感器的液体流量信息，获取悬浮细胞的运动方向、速度和距离。4.根据权利要求1所述的一种用于显微操作的流水线悬浮细胞转运方法，其特征在于，所述液滴相对于微流控芯片微通道的曲面位置信息具体包括：液滴的大小信息、曲率半径信息和压力信息。5.根据权利要求1所述的一种用于显微操作的流水线悬浮细胞转运方法，其特征在于，步骤2中，所述液滴在微流控芯片中的压力信息，计算公式具体为：
b
为t时刻液滴的压力，d
m
为t时刻微流控芯片中液滴的曲面位置，p0为大气压力，γ为液体的表面张力系数。6.根据权利要求5所述的一种用于显微操作的流水线悬浮细胞转运方法，其特征在于，所述结合液滴在微流控芯片中的压力信息、液滴在微流控芯片内的移动参数以及灌流的压力信息，改变压力控制器和微量注射泵的压力输出，控制细胞在微流控芯片中的运动速度，具体为：首先，根据流量传感器反馈的流量信息，计算细胞的速度信息u：其中，q为流量传感器反馈的流量，d为管道的直径；然后，计算因管道摩擦阻力和连接件引入的压力误差信息δp：其中，μ为液体的粘性系数，l为管道的长度；接着，基于误差信息δp，计算微量注射泵的输出压力p
cnew
：其中，ρ为液体的密度；改变微量注射泵的压力输出，控制液滴大小和相对位置不变；最后，根据微量注射泵的输出压力p
cnew
，改变压力控制器的输出压力p
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：
其中，u
c
是期望的液滴速度，实现细胞运动速度的控制。7.一种用于显微操作的流水线悬浮细胞转运平台，其特征在于，包括液滴检测系统以及液滴控制系统；所述液滴检测系统通过显微镜采集成像信息，通过机器视觉获取液滴在二维平面内的位置信息，通过流量传感器获取液滴在微流控芯片内的移动参数，通过压力控制器获取灌流的压力信息；所述液滴控制系统，基于液滴在二维平面内的位置信息，获得液滴在微流控芯片中的压力信息；结合液滴在微流控芯片中的压力信息、液滴在微流控芯片内的移动参数以及灌流的压力信息，改变压力控制器和微量注射泵的压力输出，控制细胞在微流控芯片中的运动速度，使细胞在转运平台中的运动路径和运动趋势可控。8.根据权利要求7所述的一种用于显微操作的流水线悬浮细胞转运平台，其特征在于，更进一步地，所述的微流控芯片微通道由横向微通道和纵向微通道构成；所述横向微通道位于微流控芯片内部，用于细胞的转运；所述纵向微通道为首尾相通的通道，所述纵向微通道的顶部贯通微流控芯片，其余部分位于微流控芯片内部；所述横向微通道与纵向微通道十字交叉部分相通，用于辅助定位注射微针的显微操作区域。

技术总结
本发明公开了一种用于显微操作的流水线悬浮细胞转运方法及平台。所述转运方法由压力控制器获取并输出实时压力，通过机器视觉获取液滴位置；转运平台装有流量传感器，用于检测规定时间内通过流水线悬浮细胞转运平台的液体流量；结合图像反馈与流量传感器的反馈信息，计算转运平台中液体的实时流速，基于该平台内的流速和压力信息，改变压力控制器的输出压力，补偿器件摩擦损耗，同时改变微量注射泵的压力输出，达到控制转运平台内部液体流动速度和趋势的目的。本发明可应用于基于光学显微镜搭建的显微操作平台，在细胞微操、显微注射以及其他相关生命科学领域，具备广泛的应用前景。景。景。


技术研发人员：王慧泉 史振兴 张永兴 李江涛
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/10/5