父源性认知和情感障碍性疾病动物模型的构建方法及其应用

1.本发明涉及动物模型构建技术领域，具体涉及一种父源性认知和情感障碍性疾病动物模型的构建方法及其应用。


背景技术：

2.随着社会经济发展，社会压力同步增加，认知和情感障碍性疾病的发病率逐年升高。国家卫健委2019年统计数据显示，我国抑郁症患病率达到2.1％，焦虑障碍的患病率是4.98％，两者共患病的发病率超7％。认知障碍问题也越发严重，在我国认知障碍的患病率约为5％-7.2％。而儿童及青少年的认知、情感等神经行为更为值得社会关注，以中国五省74000余名儿童青少年作为样本的调研结果显示[1]：在6～16岁在校学生中，中国儿童青少年的认知和精神障碍总患病率为17.5％。其中，流行程度最高的主要包括智力指数低下、语言表达能力受损、长期和短期记忆相关的执行功能改变、注意缺陷多动障碍(adhd)以及焦虑抑郁等，且通常作为共病存在。认知和情感障碍性疾病，已成为严重危害人类健康的重大疾病，也是迫切需要解决的公共卫生问题。
[0003]“健康与疾病的发育起源(developmental origins of health and disease,dohad)学说”受到广泛关注，但更多是强调母本孕期宫内不良环境对胎儿发育的影响，有关父本不良环境暴露对子代发育的影响尚未受到足够重视。相关证据表明，父体环境应激、营养不良、外源物暴露、感染等多方面因素，均可对子代发育造成不良影响，涉及子代多组织器官的生长发育及生理功能。如父本双酚a暴露可引起子代焦虑和社交行为异常[2]；父本饮食限制会导致子代代谢表型和抑郁样神经行为等[3]。
[0004]
目前已有相关的母本孕期不良环境暴露动物模型，用来研究母体妊娠期不良环境对胎儿宫内及出生后生长发育的影响，但至今尚无明确成型的父本不良环境暴露致子代神经发育异常的动物模型。父源性疾病模型与母源性疾病模型具有本质不同，母源性模型的外源干预例如慢性应激、病毒感染、毒物摄入等大都可通过胎盘屏障直接影响胎儿发育，其模拟的是孕期胎儿不良环境暴露；而父源性模型的外源干预只能通过精子间接影响胎儿，其更显示出“备孕”、孕前的外源干预对胎儿生长发育的影响。
[0005]
生殖细胞的表观遗传调控改变及其传递被认为是亲代不良环境编程子代多器官发育异常的重要机制[4]。相比于母本不良环境暴露可直接通过胎盘影响胎儿的生长发育，父本不良环境所致精子的表观遗传调控改变如何逃逸发育中的重编程，进而导致子代发育异常及远期疾病易感，这些重要的科学问题至今尚未阐明，致使临床早期预警和干预困难。虽然部分动物模型可模拟认知及情感行为异常，但没有实验模型可以完全复制认知及情感功能障碍，且大部分动物模型建立的过程中具有明显的药物副作用或者基因缺陷，无法模拟普遍性的认知和情感障碍，例如用不同的应激环境造模的焦虑、抑郁动物模型，用手术、药物等造模的认知和情感障碍动物模型都有一定的局限性，更不能反应孕前父体的环境状态对子代的影响。目前尚无明确的父源性疾病动物模型，给研究父本起源的认知和情感功能障碍造成诸多困难。因此，迫切需要建立一种稳定的父源性认知和情感功能障碍动物模
型，并通过此模型进一步探究父源性疾病的发病机制、早期预警与防治策略。
[0006]
咖啡因(caffeine)是现代生活中常见的慢性应激源，具有提神醒脑、减轻疲劳之功效，常见于咖啡、茶、巧克力及复方药物。我国咖啡消费量每年增幅达15％～20％，约为世界平均水平的10倍。根据美国国家健康和营养调查数据，育龄男性咖啡因平均摄入量(240mg/d)约为女性的1.5倍；18岁以上男性摄入咖啡、茶等富含咖啡因的饮料量远高于女性。已有研究表明，咖啡因作为一种中枢神经兴奋剂，男性长期暴露可表现出明显的慢性应激状态[5]。提示，育龄男性摄入咖啡因的现状严重，是一常见的慢性应激源。目前大部分国家已对孕妇咖啡因的摄入量提出了相关安全剂量，例如美国、加拿大等过规定孕妇每日咖啡因摄入量不得超过200mg，相当于每天一杯300ml的咖啡，但对备孕男性并没有明确规定。虽然适量的咖啡因对自身神经系统无明显毒副作用，但研究显示咖啡因摄入会导致生殖功能受损。咖啡因作为日常饮品中常见的发育毒物，用来构建父源性疾病动物模型十分具有代表性，用来指导男性备孕期间的注意事项更贴近生活，因此利用父本孕前咖啡因暴露(paternal pre-pregnant caffeine exposure，ppce)来建立一种父本生殖细胞表遗传改变导致的子代认知和情感功能障碍疾病表型可行性较佳，且更模拟日常和贴近临床。
[0007]
参考文献
[0008]
1.li,f.,cui,y.,li,y.,guo,l.,ke,x.,liu,j.,...&leckman,j.f.(2022).prevalence of mental disorders in school children and adolescents in china:diagnostic data from detailed clinical assessments of 17,524individuals.journal of child psychology and psychiatry,63(1),34-46.
[0009]
2.fan,y.,tian,c.,liu,q.,zhen,x.,zhang,h.,zhou,l.,...&zhu,m.(2018).preconception paternal bisphenol a exposure induces sex-specific anxiety and depression behaviors in adult rats.plos one,13(2),e0192434.
[0010]
3.dimofski,p.,meyre,d.,dreumont,n.,&leininger-muller,b.(2021).consequences of paternal nutrition on offspring health and disease.nutrients,13(8),2818.
[0011]
4.yeshurun,s.,&hannan,a.j.(2019).transgenerational epigenetic influences of paternal environmental exposures on brain function and predisposition to psychiatric disorders.molecular psychiatry,24(4),536-548.
[0012]
5.lovallo,w.r.,farag,n.h.,vincent,a.s.,thomas,t.l.,&wilson,m.f.(2006).cortisol responses to mental stress,exercise,and meals following caffeine intake in men and women.pharmacology biochemistry and behavior,83(3),441-447.


技术实现要素：

[0013]
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种成功率高、有效可靠、可重复性强、简便易行的父源性认知和情感障碍性疾病动物模型的构建方法。
[0014]
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
[0015]
第一方面，本发明提供一种父源性认知和情感障碍性疾病动物模型的构建方法，其特征在于：包括下列步骤：
[0016]
s1：选取健康性成熟的雄性大鼠，每日给予60mg/kg咖啡因胃內灌注，持续8周；
[0017]
s2：将上述咖啡因处理动物与健康的雌鼠交配，孕鼠自然生产，获得f1代；
[0018]
s3：子代出生后4周断奶并雄、雌分笼，继续正常饮食饲养至出生后12周，检测行为学相关指征来综合判定认知和情感行为异常；
[0019]
s4：部分子代饲养至出生后28周，检测行为学相关指征来综合判定认知和情感行为改变；最终得到父源性认知和情感障碍性疾病动物模型。
[0020]
作为优选方案，所述步骤s1中，雄鼠非局限于雄性大鼠，spf级啮齿类动物如sd大鼠、昆明小鼠、c57小鼠或豚鼠、地鼠等均包含在内。
[0021]
进一步地，所述步骤s2中，以生产日作为出生后0天，出生后1天时选取窝仔数为12～14只的窝仔，调整每窝雄、雌性子代各6只进行哺乳喂养。
[0022]
进一步地，所述步骤s3中，正常饮食配方与《中华人民共和国国家标准gb14924.1-2001》规定的实验动物配方饲料相同。
[0023]
更进一步地，所述步骤s3、s4中，行为学检测包括：新事物识别实验、旷场实验、高架十字迷宫。
[0024]
第二方面，本发明提供一种父源性认知和情感障碍性疾病动物模型在筛选父体孕前环境干扰物或药物暴露所致子代神经发育毒性药物中的应用，其特征在于：所述父源性认知和情感障碍性疾病动物模型由上述任一构建方法得到。
[0025]
第三方面，本发明提供一种父源性认知和情感障碍性疾病动物模型在筛选父源性认知和情感障碍性疾病的预警靶标并制备干预靶标药物中的应用，其特征在于：所述父源性认知和情感障碍性疾病动物模型由上述任一构建方法得到。
[0026]
本发明的技术原理及研究过程如下：
[0027]
本发明对父体孕前咖啡因暴露(paternal pre-pregnant caffeine exposure，ppce)子代动物进行检测认知行为和情感行为相关指标，确定ppce子代具有认知和情感行为异常，进而建立父源性认知和情感障碍性疾病模型。该模型模拟了父源性认知和情感障碍性疾病发生发展的疾病表型，对阐明父源性认知和情感障碍性疾病的发生发展机制，探寻早期预警及防治靶标具有重要意义。
[0028]
本发明首先对雄鼠进行了为期8周的咖啡因暴露，其暴露时长覆盖一个完整的生精周期，而咖啡因暴露的剂量为60mg/kg.d，相当于人群576mg/d的暴露量，属于日常可及的咖啡因暴露剂量。咖啡因暴露的雄鼠随后与正常适龄的雌鼠交配，以发现阴道分泌物中精子为gestational day 0。此后部分孕鼠于gestational day 20处死作为宫内胎鼠标本。而另一部分孕鼠自然生产，子代常规饲养至12周和28周作为出生后标本。12周和28周的鼠还会进行神经行为学实验如高架十字迷宫实验、旷场实验、新事物识别实验等来鉴定这些父本咖啡因暴露子代的认知和情感状态，以确定模型是否构建成功。
[0029]
本发明的优点及有益效果如下：
[0030]
1、本发明的技术构思较为新颖，咖啡因这种外源物更具有日常暴露的特性，用咖啡因建立孕前父体暴露的动物模型更贴和日常，更具备广泛适用性。
[0031]
2、本发明的造模方法简单可靠，父本性成熟后连续8周给予咖啡因建立ppce模型，对其成年子代进行新事物识别实验、旷场实验、高架十字迷宫等行为学检测，能够模拟认知和情感障碍患者的认知能力、环境探索能力、焦虑抑郁等情感状态。本模型指标稳定性好，
可重复性强，为父源性认知和情感障碍性疾病的构建提供了一种可靠的方法。
[0032]
3、本发明为父源性孕前不良环境暴露动物模型，与母体孕期不良环境暴露动物模型具有显著的区别。本模型为ppce模型，尚无相关动物模型的构建方法及神经发育毒性方面的应用。ppce具有对子代间接性作用的特性，对研究孕前生殖发育毒性具有特殊的意义。
[0033]
4、基于本发明构建的父源性认知和情感障碍性疾病模型，可用于指导男性合理备孕和临床合理用药、探讨父源性认知和情感障碍性疾病的发生发展机制、早期预警及干预靶标中的应用。
附图说明
[0034]
图1为本发明行为学实验模式示意图及相关结果
[0035]
图1中：a：旷场实验；b：高架十字迷宫实验；c：新事物认知实验。*p《0.05,**p《0.01
[0036]
图2不同剂量ppce子代旷场行为学代表性轨迹图及统计结果
[0037]
图2中：旷场实验的轨迹图以及各组大鼠总移动距离和在中心区域(红框内)的运动时间占整个旷场运动时间的比例统计图。*p《0.05,**p《0.01
[0038]
图3不同剂量ppce子代高架十字迷宫行为学代表性轨迹图及统计结果
[0039]
图3中：高架十字迷宫实验的轨迹图以及各组大鼠在开放臂中的停留时间占比和进入次数统计图。*p《0.05,**p《0.01
[0040]
图4不同剂量ppce子代新事物识别行为学代表性轨迹图及统计结果
[0041]
图4中：新事物识别实验24h测试代表性轨迹图以及对各组大鼠新旧事物探索时间及认知系数进行统计分析。*p《0.05,**p《0.01
[0042]
图5ppce子代神经发生相关标记物表达抑制
[0043]
图5中：a：ppce子代大鼠和control组相比，胎鼠和成年鼠神经干细胞标记物nestin、神经元标记物tuj1及新生神经元标记物dcx的mrna表达情况(a)；b：nestin和tuj1的蛋白表达水平检测。*p《0.05,**p《0.01
[0044]
图6ppce子代神经干细胞增殖分化异常
[0045]
图6中：a：子代大鼠海马nestin/ki67免疫荧光双染表示神经干细胞的增殖状态；b：子代大鼠海马mcm2/dcx免疫荧光双染提示神经干细胞分化/神经发生的异常。*p《0.05,**p《0.01
具体实施方式
[0046]
以下结合具体实施例和附图，对本发明的技术内容作进一步的详细阐述。
[0047]
实施例1：父源性认知和情感障碍性疾病动物模型的构建
[0048]
1、实验动物：
[0049]
spf级健康wistar大鼠，购自北京斯贝福生物技术有限公司，动物许可证号：scxk(京)2019-0010。本研究获武汉大学医学部伦理委员会批准，并严格按照国际实验动物保护认证评估机构相关处理准则执行。
[0050]
实验动物饲养于屏障环境内，温度22～25℃，湿度50％，12h昼夜交替。
[0051]
2、实验方法：
[0052]
对6周龄的雄性大鼠给予为期8周(以覆盖一个完整的生精周期)的咖啡因暴露
(60mg/kg.d，相当于人群576mg/d的暴露量)建立ppce大鼠模型。之后与正常适龄雌性大鼠交配，每晚6时雌：雄＝2:1合笼，次晨孕检，发现阴道分泌物中精子则为(gestational day 0,gd0)gd0。
[0053]
部分孕鼠于gd20麻醉处死取胎鼠、称重并收集海马组织待测。另一部分孕鼠自然生产，子代常规饲养至出生后12周和28周，对子代进行高架十字迷宫实验、旷场实验、新事物识别实验等系列行为学测试观察子代认知和情感行为改变。
[0054]
饲料购自武汉市万千佳兴生物科技有限公司，饲料配方与《中华人民共和国国家标准gb14924.3-2001》规定的小鼠大鼠配方饲料相同。
[0055]
3、检测指标及方法：
[0056]
在行为学检测开始之前，将大鼠放在实验室中至少30min适应环境。先进行压力较小的行为测试，然后再进行压力较大的行为测试。测试顺序为：旷场实验、新事物识别实验、高架十字迷宫实验。
[0057]
3.1旷场实验
[0058]
实验装置长宽高分别为100
×
100
×
50cm3的无盖木箱方盒，四周和底面全部涂黑。用酒精将方盒擦拭干净后，将大鼠置于木箱中心方格内。使用smart v 3.0智能视频跟踪系统，自动将地面划分为25个方格，记录大鼠5min内的探索轨迹和行为学参数。观察指标：
①
中央运动时间(中央9个格子的运动时间)；
②
运动总距离(全部25个格子的运动距离)。
[0059]
3.2新事物识别实验
[0060]
大鼠对新旧物体的探索的次数、时间和距离，即小鼠在新旧物体周围活动的次数、时间和距离，检测小鼠的认知情况：若大鼠认知能力差，则在新旧物体的探索无差异；若大鼠认知能力正常，则对新事物的探索较旧事物长。认知指数(recognition index,ri)计算公式为：ri(％)＝新物体/(新物体+旧物体)
×
100。每只大鼠实验开始前，用酒精将迷宫的三个臂擦拭干净，并用干净的纸巾擦拭干净。实验装置长宽高分别为100
×
100
×
50cm3的无盖木箱方盒，四周和底面全部涂黑。所识别的物体直径在5～8cm左右，需要a，b，c三种物体，物体无味，不会被大鼠随意移动，其中a，b两物体外观完全一样，c物体与a、b物体不同。
[0061]
开始训练，首先如图1所示，将a，b两个物体放在方盒中部的左右两端，大鼠背朝两物体放入场地内，并且大鼠鼻尖距离两物的长度要一致。大鼠放入10min，放入后立即开启录像设备，实验者立即离开测试房间，记录大鼠与这两个物体接触的情况，包括鼻子或嘴巴触及物体的次数和距离物体2-3cm范围内探究的时间。10min结束后，立即将大鼠放回原来饲养的鼠盒内，待大鼠休息24h后再进行测试(此期间大鼠仍呆在测试房间内)。待大鼠休息24h后开始测试，这时将场地内的b物体换作c物体，仍将大鼠背向两物体，鼻尖距两物体距离相同，大鼠放入10min，放入后立即开启录像设备，实验者立即离开测试房间，记录大鼠与这两个物体接触的情况，包括鼻子或嘴巴触及物体的次数和距离物体2-3cm范围内探究的时间。
[0062]
3.3高架十字迷宫
[0063]
该装置包含两个开放臂和两个封闭臂，由中央平台区连接。在实验开始前，先以75％乙醇将装置擦拭干净，避免气味及大鼠分泌物对测试结果的影响。实验开始时，将大鼠放置于中央平台区，使其自由活动5min。smart v 3.0智能视频跟踪系统自动记录5min内大鼠在开放臂和封闭臂的行动轨迹以及时间比例。
[0064]
4、实验结果
[0065]
ppce可引起子代大鼠认知和情感行为改变，具体表现为：高架十字迷宫实验显示，与control组相比，ppce子代进入开放臂的时间显著降低；旷场实验显示，与control组相比，ppce子代进入中心区域的次数和时间均显著减少，提示子代存在焦虑样行为并伴有探索欲望的降低。新事物识别实验显示，与control组相比，ppce子代识别新旧事物能力降低，提示认知能力的下降。
[0066]
4.1子代焦虑样行为
[0067]
子代焦虑样行为改变结果如表1所示。与control组相比，12周龄的雄性和雌性子代进入开放臂次数比例要显著降低(p《0.01，表1)；另外，与control组相比，12周龄的雄性和雌性子代在开放臂的停留时间要显著低于control组(p《0.01，表1)；提示ppce雄性和雌性子代在12周龄具有焦虑特征。而12周龄的雄性和雌性子代进入开放臂和封闭臂总次数与control组相比并没有明显差别，提示ppce雄性和雌性子代在12周龄与control组比并无无明显的活动力差距。28周龄子代表现与12周龄一致的变化，但28周龄雄性子代进入开放臂和封闭臂总次数要显著低于control组(p《0.01，表1)，提示ppce雄性和雌性子代在28周龄与control组相比，其行动力有所降低。
[0068]
表1：高架十字迷宫实验12周龄子代(mean
±
sd，n＝12)
[0069][0070]
28周龄子代(mean
±
sem，n＝12)
[0071][0072]
4.2子代自由探索能力变化
[0073]
子代大鼠自由探索能力改变结果如表2所示。与control组相比，12周龄ppce雄性和雌性子代，中心停留时间占比要显著降低(p《0.01，表2)。另外，雌性子代总移动距离要低于control组(p《0.01，表2)，雄性子代无明显变化。实验结果提示，12周龄ppce子代具有焦虑行为，其自由探索能力降低。且12周龄雌性的行动能力要比control组低。28周龄子代整体与12周龄子代表现出一致性的变化，此外28周龄的雄性和雌性子代与control组相比，总移动距离要显著降低(p《0.01，表2)。结果提示，ppce子代自由探索能力降低，出现焦虑情绪。
[0074]
表2：旷场实验12周龄子代(mean
±
sem，n＝12)
[0075][0076]
28周龄子代(mean
±
sem，n＝12)
[0077][0078]
4.3子代认知能力变化
[0079]
子代大鼠认知能力改变结果如表3所示。与control组相比，12周龄ppce雄性子代，认知系数显著降低(p《0.01，表3)。而12周龄雌性子代认知系数没有显著改变。28周龄ppce雄性子代和雌性子代均有认知系数下降的现象(p《0.01，表3)，提示与control组相比，ppce子代出现认知障碍。
[0080]
表3：新事物识别实验12周龄子代(mean
±
sem，n＝12)
[0081][0082]
28周龄子代(mean
±
sem，n＝12)
[0083][0084]
本发明方法通过每日给予雄鼠60mg/kg，持续8周的咖啡因胃內灌注，构建ppce模型，并与适龄雌性交配获得子代，发现其具有认知和情感行为改变，说明成功建立了父源性认知和情感障碍性疾病的动物模型。本发明的造模方法简单，模型中焦虑行为、自由探索能力、认知能力等指标稳定性好，说明本发明造模方法稳定有效可靠，可重复性强。
[0085]
实施例2：应用本发明模型发现父源性认知和情感障碍性疾病的发生机制
[0086]
1、实验动物
[0087]
spf级健康wistar大鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：scxk(京)2021-0011。本研究获武汉大学医学部伦理委员会批准，并严格按照国际实验动物保护认证评估机构相关处理准则执行。实验动物饲养于屏障环境内，温度22～25℃，湿度50％，12h昼夜交替。
[0088]
2、实验方法
[0089]
对6周龄的雄性大鼠给予为期8周(以覆盖一个完整的生精周期)的咖啡因暴露(15，30，60mg/kg.d，相当于人群144，288和576mg/d的暴露量)建立ppce大鼠模型。之后与正常适龄雌性大鼠交配，每晚6时雌：雄＝2:1合笼，次晨孕检，发现阴道分泌物中精子则为gd0。饲料购自武汉市万千佳兴生物科技有限公司，饲料配方与《中华人民共和国国家标准gb14924.3-2001》规定的小鼠大鼠配方饲料相同。
[0090]
部分孕鼠于gd20麻醉处死取胎鼠、称重并收集海马组织待测。另一部分孕鼠自然生产，子代以生产日作为出生后0天，出生后1天时每组选取窝仔数为12-14只的窝仔，调整每窝雄、雌性子代各为6只进行哺乳喂养，以保证子代均衡营养。子代4周龄断奶并雄、雌分笼，子代常规饲养至出生后28周。对上述28周龄雄性子代进行旷场实验、高架十字迷宫实验、新事物识别实验等系列行为学测试观察子代认知和情感行为改变，并检测海马组织神经干细胞标记物nestin、神经元标记物tuj1、新生神经元标记物dcx的mrna和蛋白的表达，以及观察海马神经发生，探索父源性认知和情感障碍的海马发育损伤的发生机制。
[0091]
3、检测指标及方法：
[0092]
3.1按照实施例1方法检测雄性子代大鼠旷场实验、高架十字迷宫实验、新事物识别实验。
[0093]
3.2检测父源性认知和情感障碍动物模型的海马发育损伤状态及相关机制
[0094]
检测不同剂量的ppce雄性子代其行为学变化，进一步确证父源性咖啡因暴露与子代认知和情感障碍的相关性及剂量效应。收集gd20、28周龄雄性子代海马组织，通过rt-qpcr和western blot检测神经干细胞标记物nestin、神经元标记物tuj1、新生神经元标记物dcx的表达变化。通过免疫荧光双染nestin/ki67以及mcm2/dcx，观察海马神经发生的改变。探讨父源性认知和情感障碍动物模型中海马发育不良的潜在机制。
[0095]
4、实验结果
[0096]
ppce可引起28周龄雄性子代大鼠认知和情感障碍，其潜在机制与海马神经干细胞分化抑制有关，具体表现为：与control组相比，咖啡因组雄性子代出现焦虑样行为及自由探索能力减弱，并伴随认知功能降低。海马神经干细胞分化障碍，神经发生抑制。
[0097]
4.1ppce雄性子代具有认知和情感功能障碍
[0098]
分别利用低剂量(15mg/kg.d)，中剂量(30mg/kg.d)，高剂量(60mg/kg.d)咖啡因进行父源性咖啡因暴露处理。发现雄性子代的行为学发生了改变(结果如图2-4)，在旷场实验中，与control组相比，低剂量父体孕前咖啡因暴露(paternal pre-pregnant caffeine exposure with low dose，ppce_l)组(p《0.05，图2)、中剂量父体孕前咖啡因暴露(paternal pre-pregnant caffeine exposure with mid dose，ppce_m)组(p《0.01，图2)和高剂量父体孕前咖啡因暴露(paternal pre-pregnant caffeine exposure with high dose，ppce_h)组(p《0.01，图2)的雄性子代在旷场中心区域的停留时间要显著减少，且ppce_m组和ppce_h组的动物总移动距离要显著降低(p《0.05，图2)。在高架十字迷宫实验中，与control组相比，ppce_m组(p《0.01，图3)和ppce_h组(p《0.01，图3)的雄性子代在开放臂的停留时间减少，而ppce_l组在开放臂停留时间与control组并无明显差异；经过对动物穿越开放臂次数的统计，可以看到ppce_h组的雄性大鼠其进入开放臂的次数要显著降低(p《0.01，图3)，而ppce_l组和ppce_m组在进入开放臂次数上与control组并无明显差别。如图4所示，此外新事物认知实验发现，与control组相比，ppce_m组(p《0.01，图4)和ppce_h组(p
《0.01，图4)的雄性子代的认知能力略有下降，ppce_l子代认知并未有明显变化，在事物上的探索时间统计可以看出control组和ppce_l组的雄性大鼠认知能力正常，在新事物上花费的探索时间要显著多于老事物上(p《0.01，图4)。综上所述，ppce可致使雄性子代出现焦虑样行为及认知功能障碍，尤其是高剂量父体孕前咖啡因暴露。
[0099]
4.2ppce致雄性子代海马神经干细胞分化障碍
[0100]
神经行为的异常与神经元的状态密切相关，对本发明对神经元的标记物(tuj1)进行定量测量，qpcr结果显示，与control组相比，ppce_h组胎鼠海马(p《0.01，图5中a)及成年鼠海马(p《0.01，图5中a)的tuj1表达显著减少；对神经干细胞的标记物nestin进行了测量，qpcr结果显示，无论是胎鼠还是成年鼠，ppce_h组雄性子代的nestin表达都要显著低于control组(p《0.01，图5中a)；对新生神经元的标记物(dcx)进行定量测量，结果显示ppce_h组雄性子代胎鼠(p《0.01，图5中a)及成年鼠(p《0.01，图5中a)dcx的mrna表达要比control组低；wb实验进行验证，胎鼠时期ppce_h组雄性子代海马nestin蛋白和tuj1蛋白的表达量都要显著低于control组(p《0.01，图5中b)，成年鼠时期ppce_h组雄性子代海马nestin蛋白和tuj1蛋白的表达量也都要显著低于control组(p《0.05，图5中b)。提示可能是神经干细胞的受损造成了神经元数量的不足。
[0101]
通过nestin和ki67共标记海马神经干细胞，以观察神经干细胞的增殖状况，结果显示，28周龄ppce_h组雄性子代海马的nestin/ki67共定位增殖性神经干细胞显著低于control组(p《0.01，图6)。进一步通过mcm2/dcx荧光共定位观察神经干细胞分化成神经元的步骤受损情况，结果显示，28周龄ppce_h组雄性子代海马mcm2/dcx共定位细胞减少(p《0.01，图5)，提示神经干细胞分化障碍，神经发生抑制。
[0102]
综上所述，ppce可导致海马神经干细胞增殖分化抑制，神经发生减少，从而引起子代大鼠认知和情感功能障碍。说明本方法是建立父源性认知和情感障碍动物模型的有效方法，可用于研究父源性认知和情感障碍动物模型机制，基于此进一步指导筛选父体孕前环境干扰物或药物所致神经发育毒性中的应用发现父源性认知和情感障碍性疾病早期预警及干预靶标中的应用。

技术特征：
1.一种父源性认知和情感障碍性疾病动物模型的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：s1：选取健康性成熟的雄鼠日给予60mg/kg咖啡因胃內灌注，持续8周；s2：将上述咖啡因处理动物与健康的雌性交配，孕鼠自然生产，获得f1代；s3：子代出生后4周断奶并雄、雌分笼，继续正常饮食饲养至出生后12周，检测行为学相关指征来综合判定认知和情感行为异常；s4：部分子代饲养至出生后28周，检测行为学相关指征来综合判定认知和情感行为异常；最终得到父源性认知和情感障碍性疾病动物模型。2.根据权利要求1所述父源性认知和情感障碍性疾病动物模型的构建方法，其特征在于：所述步骤s1中，所述雄鼠为spf级包括sd大鼠、昆明小鼠、c57小鼠或豚鼠、地鼠。3.根据权利要求1或2所述父源性认知和情感障碍性疾病动物模型的构建方法，其特征在于：所述步骤s2中，以生产日作为出生后0天，出生后1天时选取窝仔数为12～14只的窝仔，调整每窝雄、雌性子代各6只进行哺乳喂养。4.根据权利要求3所述父源性认知和情感障碍性疾病动物模型的构建方法，其特征在于：所述步骤s3中，正常饮食是配方与《中华人民共和国国家标准gb14924.1-2001》规定的实验动物配方饲料相同。5.根据权利要求4所述父源性认知和情感障碍性疾病动物模型的构建方法，其特征在于：所述步骤s3、步骤s4中，行为学检测包括：新事物识别实验、旷场实验、高架十字迷宫。6.一种父源性认知和情感障碍性疾病动物模型在筛选父体孕前环境干扰物或药物暴露所致子代神经发育毒性药物中的应用，其特征在于：所述父源性认知和情感障碍性疾病动物模型由权利要求1至5中任一构建方法得到。7.一种父源性认知和情感障碍性疾病动物模型在筛选父源性认知和情感障碍性疾病的预警靶标并制备干预靶标药物中的应用，其特征在于：所述父源性认知和情感障碍性疾病动物模型由权利要求1至5中任一构建方法得到。

技术总结
本发明公开了一种父源性认知和情感障碍性疾病动物模型的构建方法及其应用。所述父源性认知和情感障碍性疾病动物模型，为雄性大鼠于6周龄开始每日给予咖啡因(60mg/kg.d)胃內灌注，持续给药8周，以覆盖一个完整的生精周期，构建父体孕前咖啡因暴露模型。子代出生后4周断奶分笼，雄性及雌性子代于12周及28周均出现性典型的认知和情感行为异常，基于此父源性认知和情感障碍性疾病动物模型，发现PPCE可引起子代海马神经干细胞分化抑制。本发明所建立的动物模型新颖、可靠、简便，对阐明父源性认知和情感障碍性疾病的发生机制，探寻早期预警及干预靶标具有重要意义。干预靶标具有重要意义。干预靶标具有重要意义。


技术研发人员：徐丹 汪晖 张帅 鲁梦溪 王婷婷
受保护的技术使用者：武汉大学
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/10/5