一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器及其应用

1.本发明涉及一种准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器用于mirna-222检测，属于生物传感技术领域，该生物传感器基于双阳极ecl信号强度的变化，通过信号比值，从而实现对血清中mirna的超高灵敏度检测分析。


背景技术：

2.微小核糖核酸（micro-ribonucleic acid，mirna）是一种长度通常为18 ~ 23个核苷酸的非编码内源性核糖核酸，在不同的基因间区内发挥着重要的调控作用。目前，mirna常作为生物标志物用于癌症的诊断，研究其体内表达水平可作为判断癌症发生发展情况的依据。其中mirna-222表达水平的升高是诸多癌症发生的危险因素，包括甲状腺癌、乳腺癌、前列腺癌等。同时，mirna-222能够调节靶蛋白，增强肿瘤的耐药性，主要是由外泌体中mirna参与调控药物靶蛋白的表达，促使癌细胞产生耐药性，导致血浆中药物浓度升高，影响临床治疗效果。因此，准确分析mirna-222的表达水平，不仅有助于癌症的早期诊断和预后评估，还能对癌症治疗与预后过程中的临床用药提供可靠的指导意见，进而提高临床用药的治疗效果，保障患者的用药安全。然而，外泌体中的mirna丰度低，难以检测，因此迫切亟需开发具有超高灵敏度的mirna检测手段。
3.电化学发光（electrochemiluminescence，ecl）技术具有低成本、操作简便、不需要昂贵的仪器设备等优势，可用于构建即时检测装置。同时，采用比率型ecl策略，可通过两个ecl信号之间的自校准，有效避免来自外界环境的干扰，进而提升结果的准确性。闭合式双极电极（bipolar electrode，bpe）能够在空间上有效隔绝两个电解池溶液间交换，避免复杂的分析环境；同时，基于电中性原理，整个闭合式bpe遵循电子守恒定律，两电解池发生的氧化还原反应是相互关联。因此，基于双极电极结合比率型电化学发光技术构建的生物传感器（比率型bpe-ecl生物传感器）在生物分析领域具有独特的优势。
4.目前，开发的多数基于bpe-ecl生物传感器，通常是需要将核酸识别探针固相修饰在芯片表面，固相修饰步骤会改变识别探针的构象，同时整个生物识别过程都是在异相界面上进行，存在空间位阻效应，降低目标物与核酸识别探针之间的杂交效率，在一定程度上限制了传感器对mirna检测灵敏度。一些核酸分子免固定的均相ecl方法受到广泛关注，其中以fe3o4磁性纳米颗粒（ferroferric oxide magnetic nanoparticles，fe3o4nps）为代表的磁性纳米材料，因其独特的磁分离特性，能够高效、无残留地从均相或准均相反应体系中分离目标物，在生物分析和疾病诊断领域展现出广阔的应用前景。因此，将bpe-ecl生物传感器与磁性纳米材料相结合，有望进一步提升传感器灵敏度，并且得益于磁性材料可磁分离的特点，构建的bpe芯片能够重复使用，降低成本，减小实验误差，提高结果重现性。
5.在对复杂生物样本中低丰度的mirna检测中，对传感器性能提出更高要求，通常采用信号放大策略来进一步提升传感器的灵敏度。近年来，规律间隔成簇短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，crispr）和crispr相
关蛋白cas构成的crispr/cas体系作为一种新技术在生命科学领域备受关注。同时，核酸扩增技术在临床检测领域的应用越来越广泛，其中包括环介导等温扩增、滚环扩增以及聚合酶链式反应等。然而，这些核酸扩增方法是基于聚合反应，容易产生非特异性扩增，在实际操作中存在检测结果假阳性的风险。而连接酶链式反应（ligase chain reaction，lcr）基于两组dna探针（四根dna探针）对目标物进行识别，具有特异性好、背景低、灵敏度高等特点。基于lcr的扩增原理，两种探针与目标mirna先通过碱基互补配对结合，当完全互补时连接酶特异性连接dna探针，在这个过程中将mirna间接逆转录为长链dna模板。此后，基于dna模板与探针互补进行热循环扩增，其中只有完全互补的结构才能被连接酶连接。因此，lcr技术能够识别单碱基差异并实现指数级扩增核酸。
6.本发明公开一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器用于mirna-222检测。采用选用ru(bpy)
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/tpra体系和hncqds/h2o2体系为双阳极ecl信号源，引入lcr与crispr/cas12a技术作为核酸扩增技术与信号放大策略，结合fe3o4nps作为信号探针反应界面，构建一种mirna-222的比率型bpe-ecl检测新方法。在fe3o4nps表面原位还原生成金纳米粒得到au@fe3o4nps，将标记二茂铁（ferrocene，fc）的信号探针dna-fc，通过au-s键富集于au@fe3o4nps表面作为信号单元。与第一章相同，ru(bpy)
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/tpra体系在驱动电极阳极发光（ecl
ru
），hncqds/h2o2体系在bpe阳极发光（ecl
hncqds
）。将dna-fc/au@fe3o4nps通过磁吸附富集在驱动电极阳极，修饰的fc对ecl
ru
信号产生猝灭作用。然后，通过磁性吸引，让dna-fc/au@fe3o4nps转移至bpe阴极区，fc作为一种电化学活性物质，同时还具有优良的导电性能，能够加速bpe芯片的电子传递速率，增强ecl
hncqds
。设计lcr反应对目标mirna-222进行扩增，扩增产物能够被crrna识别，激活crispr/cas12a系统的非特异性切割活性，裂解dna-fc信号探针，fc数量减少，猝灭作用减弱，ecl
ru
信号恢复。同时，bpe芯片的电子传递速率降低，导致ecl
hncqds
信号削弱。基于两个ecl体系的信号比值变化，实现对mirna-222的检测分析。其中lcr扩增与crispr/cas12a体系都是在均相溶液中发生，能够高效识别目标分子。构建的比率型bpe-ecl传感器表现出超高的灵敏度、良好的稳定性与重现性。用于人血清样品中mirna-222的检测具有良好的表现，在体外分析与临床医疗领域中有着巨大的应用潜力。


技术实现要素：

7.1. 本发明的目的是提供一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器及其用于mirna-222的超高灵敏度检测。
8.2. 本发明所述的一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器及其应用，采用选用ru(bpy)
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/tpra体系和hncqds/h2o2体系为双阳极ecl信号源，连接酶链式反应与crispr/cas技术联用，结合金纳米粒修饰fe3o4磁性纳米颗粒富集二茂铁核酸信号探针（dna-fc/au@fe3o4nps）为一种多功能的反应界面，有效调控两个ecl反应体系的信号变化，通过两种信号的比值，实现对mirna-222的超高灵敏度检测。
9.3. 本发明的一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器及其应用，其制备方法依序包括如下步骤：（1）hncqds的合成将2.1 g柠檬酸溶于15 ml的dmf中，然后将1.25 ml水合肼逐滴加入形成胶状的混
合前体。将胶状前体置于微波反应装置（800 w）中，反应300 s。得大块多孔固体，加入15 ml水溶解反应产物，离心（10,000 rpm，10 min），除去大块黑色沉淀物。静置沉淀，取上清液，经0.45 μm和0.22 μm过滤，并用截留分子量（molecular weight cut-off，mwco）为100-500 dalton的透析袋，在去离子水中透析24 h后，60 ℃干燥，得hncqds固体，避光密封保存。
10.（2）dna-fc/au@fe3o4nps的制备au@fe3o4nps的制备：在微沸的haucl4溶液（0.04%，5 ml），加入500 μl fe3o4nps（5 mg/ml），溶液再次沸腾后，加入100 μl 5%柠檬酸钠溶液，原位还原生成金纳米粒，当溶液的颜色从棕色变成紫色，最后变成红色说明生成金纳米粒，继续加热15分钟后，经磁分离，用超纯水清洗三次，重分散于500 μl超纯水，得au@fe3o4nps。
11.dna-fc/au@fe3o4nps的制备：将200 μl的dna-fc与200 μl的au@fe3o4nps混合，dna-fc通过au-s键与au@fe3o4nps连接，ph 7.4下，振摇过夜。而后，加入200 μl 2% bsa溶液，振摇1 h，封闭非特异性位点，通过磁洗，分离剩余的dna-fc，清洗三次后，重新分散于200 μl超纯水中，即得dna-fc/au@fe3o4nps。
12.（3）连接酶链式反应连接酶链式反应中的阶段a：首先，以mirna-222为模板，通过probe x1与probe y1识别目标，在splintr ligase作用下发生连接反应，生成单链dna。反应体系为：总体积100 μl的1x ligation buffer（ph 7.5，包括50 mm tris-hcl，10 mm mgcl2，10 mm dithiothreitol，1 mm atp），其中含有200 u的重组核糖核苷酸酶抑制剂，50 u splintr ligase，100 nm probe x1，100 nm probe x2以及不同浓度的mirna-222。将反应体系置于恒温混匀仪中，第一阶段程序设定：反应温度为25 ℃，反应时间为20 min；第二阶段程序设定：反应温度为80 ℃，反应时间为20 min，获得产物在4 ℃存放。
13.连接酶链式反应中的阶段b：依次加入40 μl的连接探针（包括probe x1、probe y1、probe x2、probe y2，浓度为50 ~ 300 nm）、5 μl的hifi taq dna ligase reaction buffer，1 μl hifi taq dna ligase加入depc water定容至50 μl，配制成lcr stage b体系，分装为9 μl为一管，再加入1 μl不同浓度mirna-222的阶段a产物。将反应体系置于pcr仪中，第一阶段程序设定：反应温度为95 ℃，反应时间为3 min；第二阶段程序设定：反应温度为55 ~ 65 ℃，反应时间为1 min；第三阶段程序设定：反应温度为95 ℃，反应时间为1 min；阶段二至阶段三为一个热循环，共35 ~ 50个循环，得lcr产物4 ℃保存。
14.（4）连接酶链式反应联用crispr/cas12a依次加入48 μl的depc water、10 μl的10x nebuffer 2.1 reaction buffer、10 μl的crrna（2 μm）、10 μl的dna-fc/au@fe3o
4 nps、2 μl的engen lba cas12a （1 μm）反应条件：恒温混匀仪中，温度为37 ℃，反应时间30 ~ 120 min，振动频率600 bpm。
15.（5）基于准均相反应的比率型bpe-ecl生物传感器的信号检测阳极池中加入hncqds/h2o2体系；阴极池中加入ru(bpy)
32+
/tpra体系。再将20 μl不同浓度mirna-222扩增的lcr产物加入配制好的80 μl crispr/cas12a反应体系（含dna-fc/au@fe3o4nps），在37
ꢀ°
c下反应2 h后，通过磁分离作用，提取出反应后的dna-fc/au@fe3o4nps，滴加在bpe阴极池中。通过磁吸将dna-fc/au@fe3o4nps聚集于驱动电极阳极区域，采用循环伏安法，施加0 ~ 4 v的扫描电压，扫速0.2 v/s，pmt = 800 v，检测ecl
ru
的强度。通过磁吸将dna-fc/au@fe3o4nps聚集于bpe阴极区域，采用相同的电化学方法和参数设置，
检测ecl
hncqds
的强度。
16.具体地说，本发明所述的一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器，其特征在于，所述的生物传感器包括信号探针修饰的磁性纳米材料（dna-fc/au@fe3o4 nps）、连接酶链式反应与crispr/cas技术联用中所需的酶与试剂、双阳极ecl发光探针以及共反应剂、基于ito和pdms构建的双极电极芯片、阴极池中所包含的核酸探针和试剂，所述的生物传感器能用于mirna-222的超高灵敏度检测。
17.进一步地，所述的双阳极ecl发光探针以及共反应剂为hncqds/h2o2体系和ru(bpy)32+/tpra体系。
18.进一步地，本发明所述的信号探针修饰的磁性纳米材料（dna-fc/au@fe3o4 nps）浓度为2.5 ~ 10 mg/ml，其制备方法包括如下步骤：（1）au@fe3o4 nps的制备：在微沸的5 ml浓度为0.04 wt%的haucl4溶液，加入500 μl fe3o4 nps，溶液再次沸腾后，加入100 μl 浓度为5 wt %柠檬酸钠溶液，原位还原生成金纳米粒，当溶液的颜色从棕色变成紫色，最后变成红色说明生成金纳米粒，继续加热15分钟后，经磁分离，用超纯水清洗三次，重分散于500 μl超纯水，得au@fe3o4 nps；（2）dna-fc/au@fe3o4 nps的制备：将200 μl的10 μm dna-fc与200 μl步骤（1）制得的au@fe3o4 nps混合，dna-fc通过au-s键与au@fe3o4 nps连接，ph 7.4下，振摇过夜；而后，加入200 μl 2 wt% bsa溶液，振摇1 h，封闭非特异性位点，通过磁洗，分离剩余的dna-fc，清洗三次后，重新分散于200 μl超纯水中，即得dna-fc/au@fe3o4 nps。
19.进一步地，所述的双极电极驱动电压为0 ~ 4 v。
20.进一步地，上述的连接酶链式反应与crispr/cas技术联用中，用于检测mirna-222的核酸探针包括：（1）probe x1，序列：5'
‑ꢀ
caagcatctttcgagacccagtag
ꢀ‑
3'；（2）probe y1，序列：5'
‑ꢀ
p
‑ꢀ
ccagatgtagctctcaac
ꢀ‑
3'；（3）probe x2，序列：5'
‑ꢀ
p-ctactgggtctcgaaagatgcttg
ꢀ‑
3'；（4）probe y2，序列：5'
‑ꢀ
p
‑ꢀ
gttgagagctacatctgg
ꢀ‑
3'；（5）crrna，序列：5'
‑ꢀ
uaauuucuacuaaguguagaugagacccaguagccagaug
ꢀ‑
3'。
21.进一步地，在连接酶链式反应中所用的probe x1、probe y1、probe x2、probe y2的探针浓度为50 ~ 300 nm；热循环次数为35 ~ 50次；热循环扩增阶段温度为55 ~ 65 ℃。
22.进一步地，上述阳极池中加入hncqds/h2o2体系；阴极池中加入ru(bpy)32+/tpra体系；将20 μl不同浓度mirna-222扩增的lcr产物加入含dna-fc/au@fe3o4 nps的 crispr/cas12a反应体系中，在37
ꢀ°
c下反应2 h后，通过磁分离作用，提取出反应后的dna-fc/au@fe3o4 nps，滴加在bpe阴极池中；通过磁吸将dna-fc/au@fe3o4 nps聚集于驱动电极阳极区域，采用循环伏安法，施加0 ~ 4 v的扫描电压，扫速0.2 v/s，pmt = 800 v，检测ru(bpy)32+/tpra体系的信号（eclru）强度；通过磁吸将dna-fc/au@fe3o4 nps聚集于bpe阴极区域，采用相同的电化学方法和参数设置，检测hncqds/h2o2体系的信号（eclhncqds）强度。
23.本发明上述的一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器，其特征在于，用于mirna-222的超高灵敏度检测。
24.本发明优点：本发明公开了一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光（bpe-ecl）生物
传感器及其用于mirna-222的检测分析。通过采用hncqds/h2o2体系和ru(bpy)
32+
/tpra体系为双阳极信号源，构建新型比率型bpe-ecl生物传感器用于mirna检测分析。通过连接酶链式反应与crispr/cas技术联用，结合金纳米粒修饰fe3o4磁性纳米颗粒富集二茂铁核酸信号探针（dna-fc/au@fe3o4nps）为一种多功能的反应界面，有效调控两个ecl反应体系的信号变化，通过两种信号的比值，实现对mirna-222的超高灵敏度检测。基于准均相反应体系，其无需繁复的修饰步骤，且具有高的生物识别效率，本章构建的比率型bpe-ecl生物传感器能够有效识别超痕量目标物检测。所构建的传感器在对mirna-222检测中表现出超强的检测性能，该传感器有望成为一种超高灵敏度的检测工具用于极低丰度生物样品分析、临床早期诊断以及单细胞分析领域。
附图说明
25.图1为本发明一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器用于mirna-222检测的工作原理图。
26.图2为本发明一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器中：a为au@ fe3o4nps的hrtem图，b为au@ fe3o4nps的eds图。
27.图3为本发明一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器组装过程，ecl
ru
（a）与ecl
hncqds
（b）的信号强度-电压关系曲线：图中：（a）ito，（b）au@fe3o4 nps/ito，（c）dna-fc/au@fe3o4 nps/ito和（d）cleaved dna-fc/au@fe3o4 nps/ito。
28.图4为本发明一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器对不同mirna-222浓度的ecl信号-时间曲线图（图中：a和b），不同浓度mirna-222与和ecl
ru
强度/ecl
hncqds
强度之间关系曲线（图中：c）以及不同浓度mirna-222与lg(ecl
ru
强度/ecl
hncqds
强度)的线性关系图（图中：d）。图中的a和b中的a）0 am、（b）0.1 am、（c）0.5 am、（d）1 am、（e）5 am、（f）10 am、（g）102am、（h）103am、（i）104am、（j）105am、（k）106am。
具体实施方式
29.为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及效果更加清晰，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。
30.如图1所示，为本发明一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器用于mirna-222超高灵敏度检测的工作原理图：采用选用ru(bpy)
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/tpra体系和hncqds/h2o2体系为双阳极ecl信号源，引入lcr与crispr/cas12a技术作为核酸扩增技术与信号放大策略，结合fe3o4nps作为信号探针反应界面，构建一种mirna-222的比率型bpe-ecl检测新方法。在fe3o4nps表面原位还原生成金纳米粒得到au@fe3o4nps，将标记二茂铁（ferrocene，fc）的信号探针dna-fc，通过au-s键富集于au@fe3o4nps表面作为信号单元。与第一章相同，ru(bpy)
32+
/tpra体系在驱动电极阳极发光（ecl
ru
），hncqds/h2o2体系在bpe阳极发光（ecl
hncqds
）。将dna-fc/au@fe3o4nps通过磁吸附富集在驱动电极阳极，修饰的fc对ecl
ru
信号产生猝灭作用。然后，通过磁性吸引，让dna-fc/au@fe3o4nps转移至bpe阴极区，fc作为一种电化学活性物质，同时还具有优良的导电性能，能够加速bpe芯片的电子传递速率，增强ecl
hncqds
。设计lcr反应对目标mirna-222进行扩增，扩增产物能够被crrna识别，激活crispr/cas12a系统的非特异性切割活性，裂解dna-fc信号探针，fc数量减少，猝灭作用
减弱，ecl
ru
信号恢复。同时，bpe芯片的电子传递速率降低，导致ecl
hncqds
信号削弱。基于两个ecl体系的信号比值变化，实现对mirna-222的检测分析。
实施例1
31.一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器及其应用中bpe芯片的制备如下：基于设计的ito玻璃上电路的尺寸，通过软件adobe illustrator 2021设计对应的丝网印刷模板尺寸。通过丝网印刷技术，用刮板通过丝印模具，将保护涂层油墨（型号：中益gk-501，中国中益油墨涂料有限公司）转印至ito玻璃上，120 ℃干燥12 h。当油墨在ito层上形成具有特殊图案的致密光滑保护涂层后，采用蚀刻溶液（含0.5 m fecl3，1 m hcl以及1 m hno3）进行湿化学蚀刻。蚀刻后，用丙酮清洗，用含2 m koh的异丙醇溶液沸煮20 min，以清洗ito电极上的油墨。将所得的ito玻璃切割成相应的尺寸，即初步构建出bpe芯片基底。聚二甲基硅氧烷（pdms）膜的制备是将pdms与固化剂（sylgard 184 including pdms and curing agent，dow corning公司）混合（10:1，w/w）后，抽真空10 min，除去汽泡，倒模，在40 ℃下，交联6 h。在室温下冷却后脱模，切割出相应的储液池，将其与ito玻璃制备的bpe芯片基底嵌合一并组成bpe芯片。
实施例2
32.一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器及其应用中dna-fc/au@ fe3o4nps制备及其表征如下：（1）hncqds的合成将2.1 g柠檬酸溶于15 ml的dmf中，然后将1.25 ml水合肼逐滴加入形成胶状的混合前体。将胶状前体置于微波反应装置（800 w）中，反应300 s。得大块多孔固体，加入15 ml水溶解反应产物，离心（10,000 rpm，10 min），除去大块黑色沉淀物。静置沉淀，取上清液，经0.45 μm和0.22 μm滤膜过滤，并用截留分子量（molecular weight cut-off，mwco）为100-500 dalton的透析袋，在去离子水中透析24 h后，60 ℃干燥，得hncqds固体，避光密封保存。
33.（2）dna-fc/au@fe3o4nps的制备：在微沸的haucl4溶液（0.04 wt %，5 ml），加入500 μl fe3o4nps（5 mg/ml，购自天津倍思乐色谱技术开发中心），溶液再次沸腾后，加入100 μl 5 wt %柠檬酸钠溶液，原位还原生成金纳米粒，当溶液的颜色从棕色变成紫色，最后变成红色说明生成金纳米粒，继续加热15分钟后，经磁分离，用超纯水清洗三次，重分散于500 μl超纯水，得au@fe3o4nps。将200 μl的dna-fc（10 μm，5'-fc-ttatt-(ch2)
6-sh-3'，生工生物工程上海股份有限公司）与200 μl的au@fe3o4nps混合，dna-fc通过au-s键与au@fe3o4nps连接，ph 7.4下，振摇过夜。而后，加入200 μl 2 wt% bsa溶液，振摇1 h，封闭非特异性位点，通过磁洗，分离剩余的dna-fc，清洗三次后，重新分散于200 μl超纯水中，即得dna-fc/au@fe3o4nps。在透射电子显微镜下观察形貌结构，结果如图2中的a所示，au@fe3o4nps的tem图像显示球状大颗粒表面均匀分布粒径均一的小颗粒。同时，eds能谱表征结果表明，其含有au与fe元素（图2中的b）。
b体系分装为9 μl为一管，再加入1 μl不同浓度mirna-222的连接酶链式反应中的阶段a产物，形成反应体系，将此反应体系置于pcr仪中，第一阶段程序设定：反应温度为95 ℃，反应时间为3 min；第二阶段程序设定：反应温度为55 ~ 65 ℃，反应时间为1 min；第三阶段程序设定：反应温度为95 ℃，反应时间为1 min；阶段二至阶段三为一个热循环，共35 ~ 50个循环，得连接酶链式反应中的阶段b 产物（lcr产物）4 ℃保存。
38.（2）连接酶链式反应联用crispr/cas12a
39.依次加入48 μl的depc water、10 μl的反应缓冲溶液（10x nebuffer 2.1 reaction buffer，new england biolabs公司）、10 μl的crrna（2 μm，5'
‑ꢀ
uaauuucuacuaaguguagaugagacccaguagccagaug
ꢀ‑
3'，生工生物工程上海股份有限公司）、10 μl实施例2制得的dna-fc/au@fe
40.（3）基于准均相反应的比率型bpe-ecl生物传感器的信号检测实施例1制得的bpe芯片的阳极池中加入hncqds/h2o2体系（50 μl 0.1 m pbs缓冲液含0.05 ~ 0.5 m h2o2与10 ~ 75 μg/ml hncqds）；实施例1制得的bpe芯片的阴极池中加入ru(bpy)
32+
/三丙胺（tpra）体系（50 μl的0.1 m pbs缓冲液含50 ~ 100 μm ru(bpy)
32+
和25 ~ 75 mm tpra）。再将20 μl不同浓度mirna-222扩增实施例4步骤（1）制得的lcr产物加入配制好的80 μl 实施例4步骤（2）获得的crispr/cas12a反应体系（含dna-fc/au@fe3o4nps），在37
ꢀ°
c下反应2 h后，通过磁分离作用，提取出反应后的dna-fc/au@fe3o4nps，滴加在bpe阴极池中。通过磁吸将dna-fc/au@fe3o4nps聚集于驱动电极阳极区域，采用循环伏安法，施加0 ~ 4 v的扫描电压，扫速0.2 v/s，光电倍增管电压为800 v，检测ecl
ru
的强度。通过磁吸将dna-fc/au@fe3o4nps聚集于bpe阴极区域，采用相同的电化学方法和参数设置，检测ecl
hncqds
的强度。
41.在最优实验条件下，基于构建的比率型bpe-ecl生物传感器对不同浓度的mirna-222进行检测。不同浓度的mirna-222（5'-agcuacaucuggcuacugggucuc-3'，生工生物工程（上海）股份有限公司）对应的ecl
ru
强度-时间曲线如图4中的a所示，ecl
ru
强度随着mirna-222浓度的增加而增大，由于lcr产物增多，激活大量cas12a切割dna-fc，fc数量减少，猝灭作用减弱，信号恢复。同时，靶标浓度增加，fc数量减少，bpe芯片的电子传递速率降低，ecl
hncqds
信号逐渐减小（图4中的b）。此外，ecl
ru
/ecl
hncqds
值的大小与mirna-222浓度之间呈现指数增长的趋势（图4中的c）。对ecl
ru
/ecl
hncqds
值取对数，在mirna-222浓度为0.1 am
−
106am范围内，lg(ecl
ru
/ecl
hncqds
)与lgc
mirna-222
之间具有良好的线性关系（如图4中的d），相关系数（r2）为：0.997，线性方程为lg(ecl
ru
/ecl
hncqds
) = 0.1380lgc
mirna-222
−ꢀ
0.1178，检测限低至0.051 am。以上结果表明，基于lcr和crispr/cas12a的比率型bpe-ecl生物传感器对于检测mirna-222具有较高灵敏度和较为良好的应用前景。
42.序列表说明：序列号1：probe x1，序列：5'
‑ꢀ
caagcatctttcgagacccagtag
ꢀ‑
3'；序列号2：probe y1，序列：5'
‑ꢀ
p
‑ꢀ
ccagatgtagctctcaac
ꢀ‑
3'；序列号3：probe x2，序列：5'
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p-ctactgggtctcgaaagatgcttg
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3'；序列号4：probe y2，序列：5'
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3'；序列号5：crrna，序列：5'
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uaauuucuacuaaguguagaugagacccaguagccagaug
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3'；序列号6：mirna-222 序列：5'-agcuacaucuggcuacugggucuc-3'。
43.本发明提供的序列表中的dna、rna序列为已知的，其残基中若有“u”，则省略了“u”以及首
“‑”
及其前面的字母和数字、尾
“‑”
及其后面的字母和数字。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器，其特征在于，所述的生物传感器包括信号探针修饰的磁性纳米材料（dna-fc/au@fe3o
4 nps）、连接酶链式反应与crispr/cas技术联用中所需的酶与试剂、双阳极ecl发光探针以及共反应剂、基于ito和pdms构建的双极电极芯片、阴极池中所包含的核酸探针和试剂，所述的生物传感器能用于mirna-222的超高灵敏度检测。2.根据权利要求1所述的一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器，其特征在于，所述的双阳极ecl发光探针以及共反应剂为hncqds/h2o2体系和ru(bpy)
32+
/tpra体系。3.根据权利要求1所述的一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器，其特征在于，所述的信号探针修饰的磁性纳米材料（dna-fc/au@fe3o
4 nps）浓度为2.5 ~ 10 mg/ml，其制备方法包括如下步骤：（1）au@fe3o
4 nps的制备：在微沸的5 ml浓度为0.04 wt%的haucl4溶液，加入500 μl fe3o
4 nps，溶液再次沸腾后，加入100 μl 浓度为5 wt %柠檬酸钠溶液，原位还原生成金纳米粒，当溶液的颜色从棕色变成紫色，最后变成红色说明生成金纳米粒，继续加热15分钟后，经磁分离，用超纯水清洗三次，重分散于500 μl超纯水，得au@fe3o
4 nps；（2）dna-fc/au@fe3o
4 nps的制备：将200 μl的10 μm dna-fc与200 μl步骤（1）制得的au@fe3o
4 nps混合，dna-fc通过au-s键与au@fe3o
4 nps连接，ph 7.4下，振摇过夜；而后，加入200 μl 2 wt% bsa溶液，振摇1 h，封闭非特异性位点，通过磁洗，分离剩余的dna-fc，清洗三次后，重新分散于200 μl超纯水中，即得dna-fc/au@fe3o
4 nps。4.根据权利要求1所述的一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器，其特征在于，所述的双极电极驱动电压为0 ~ 4 v。5.根据权利要求1所述的一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器，其特征在于，连接酶链式反应与crispr/cas技术联用中，用于检测mirna-222的核酸探针包括：（1）probe x1，序列：5'
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caagcatctttcgagacccagtag
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3'；（2）probe y1，序列：5'
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p
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ccagatgtagctctcaac
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3'；（3）probe x2，序列：5'
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p-ctactgggtctcgaaagatgcttg
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3'；（4）probe y2，序列：5'
‑ꢀ
p
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gttgagagctacatctgg
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3'；（5）crrna，序列：5'
‑ꢀ
uaauuucuacuaaguguagaugagacccaguagccagaug
ꢀ‑
3'。6.根据权利要求5所述的一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器，其特征在于，在连接酶链式反应中所用的probe x1、probe y1、probe x2、probe y2的探针浓度为50 ~ 300 nm；热循环次数为35 ~ 50次；热循环扩增阶段温度为55 ~ 65 ℃。7.根据权利要求1-6任一所述的一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器，其特征在于，阳极池中加入hncqds/h2o2体系；阴极池中加入ru(bpy)
32+
/tpra体系；将20 μl不同浓度mirna-222扩增的lcr产物加入含dna-fc/au@fe3o
4 nps的 crispr/cas12a反应体系中，在37
ꢀ°
c下反应2 h后，通过磁分离作用，提取出反应后的dna-fc/au@fe3o
4 nps，滴加在bpe阴极池中；通过磁吸将dna-fc/au@fe3o
4 nps聚集于驱动电极阳极区域，采用循环伏安法，施加0 ~ 4 v的扫描电压，扫速0.2 v/s，pmt = 800 v，检测ru(bpy)
32+
/tpra体系的信号（ecl
ru
）强度；通过磁吸将dna-fc/au@fe3o
4 nps聚集于bpe阴极区
域，采用相同的电化学方法和参数设置，检测hncqds/h2o2体系的信号（ecl
hncqds
）强度。8.权利要求1-7任一所述的一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器，其特征在于，用于mirna-222的超高灵敏度检测。

技术总结
本发明公开一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器及其应用。通过采用HNCQDs/H2O2体系和Ru(bpy)


技术研发人员：雷云 刘爱林 张子阳 张宇 程章健 韩舒桦
受保护的技术使用者：福建医科大学
技术研发日：2023.06.29
技术公布日：2023/10/5