产小肽类物质的枯草芽孢杆菌菌株及用途

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及产小肽类物质的枯草芽孢杆菌菌株及用途。


背景技术：

2.小肽类物质(small peptides)基于氨基酸组成数量，肽类可以分为多肽(》10个氨基酸)和寡肽(2-9个氨基酸)。作为寡肽类，小肽类物质一般包括2-4个氨基酸残基，已经受到了很大的关注，特别是白酒中的小肽类物质。
3.环二肽，也称为2,5-二酮哌嗪(2,5-diketopiperazines)或2,5-二氧哌嗪(2,5-dioxopiperazine)，由环二肽合酶(cyclodipeptide synthases,cdps)催化的一类相对简单的化合物，是两个氨基酸分子通过脱水缩合而成的最小环肽，属于二酮哌嗪(diketopiperazines,dkps)衍生家族中的一类。环二肽化合物多数具有生理活性，通过对环二肽的分析研究，对白酒的健康因子的研究起到很好的提升作用；对白酒中风味物质的剖析有质的变迁，原因在于以前对白酒风味物质的研究主要倾向于低沸点物质，而环二肽属于高沸点物质，其熔点多数高于200℃，也为酿酒废弃物的综合利用提供更广阔的前景。另外，肽类化合物，尤其是环肽类化合物有各种各样的生理活性，它们可以是抗生素、毒素、免疫抑制剂、离子转移调节器、蛋白黏合抑制剂、酶抑制剂等。由此可见，环二肽的生物活性是非常强大而且具有很强的开发潜力。
4.目前，环二肽的合成机制已经有了较为深入的研究，其作为有益的健康功能因子，能够应用于发酵产业及其发酵食品行业、临床抗菌药物等方面。同时，作为新型农药、果蔬杀菌剂而取代广泛使用的农业强毒性药品等方面具有较大的前景。经过天然微生物固态发酵的中国白酒，其酿造微生物中含有大量芽孢杆菌类和酵母菌类等微生物类群，能够合成小肽类物质及其中间产物或类似物，赋予了白酒潜在的抗菌功能，能够帮助机体清除体内自由基，可以延缓衰老、抑制癌细胞产生及生长，对某些病原菌具有明显的生物防治功能。
5.白酒是传统固态发酵的产物，自然接种使大曲和酒糟中存在各种各样的微生物，其中不乏真菌和细菌，尤其是发酵后期以细菌为主，加上传统白酒独特的蒸馏工艺，高沸点的小肽类被带入酒中，成为酒体的一部分。白酒中的环二肽种类很多，文献报道已检出20多种，但通常含量很低，大部分在μg/l级甚至更低，少数在mg/l级。
6.因此，开发产小肽类物质，尤其是环二肽物质的微生物，使其应用于白酒中，获得更高含量的环二肽，对于白酒领域的进一步发展具有重大意义。


技术实现要素：

7.针对现有产小肽类物质的微生物研究较少，且小肽类物质产量较低的问题，本发明提供一株产小肽类物质的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)新菌株，保藏编号为cgmcc no.27148。保藏时间为2023年04月18日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮
编：100101。
8.其中，上述枯草芽孢杆菌的16s rdna的核苷酸序列如seq id no：1所示。
9.枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)seq id no:1
10.agagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtcccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttaggagccagccgccgaagagtgggacagatgattggggtgaagtcgtaacaaggtaacc
11.本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌菌株发酵产小肽类物质的方法，包括以下步骤：
12.(1)种子培养：将枯草芽孢杆菌接种至种子培养基中进行种子培养得到发酵菌种；
13.其中，步骤(1)中，所述种子培养基配方为：10g/l蛋白胨，5g/l酵母浸出粉，10g/l氯化钠，ph 7.0。
14.其中，步骤(1)中，所述种子培养条件为：培养温度37℃，摇床转速180r/min，培养时间为10h。
15.其中，步骤(1)中，所述接种量为2-3％(v/v)。
16.(2)发酵培养：将发酵菌种接至发酵培养基中进行发酵培养；
17.其中，步骤(2)中，所述发酵培养基配方为：葡萄糖8-55g/l、硫酸铵1-13g/l、柠檬酸钠1-20g/l、三水合磷酸氢二钾0.1-2.5g/l、二水合氯化钙0.2-1.2g/l、六水合氯化铁0.02-0.4g/l、七水合硫酸镁0.2-2.5g/l、一水合硫酸锰0.002-0.6g/l、酵母粉0.1-2.2g/l、吐温80 0.1-1.2g/l、ph6.5-8.0。
18.优选地，所述发酵培养基配方为：葡萄糖40g/l、硫酸铵8.6g/l、柠檬酸钠12g/l、三水合磷酸氢二钾0.5g/l、二水合氯化钙0.2g/l、六水合氯化铁0.04g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、一水合硫酸锰0.015g/l、酵母粉1g/l，吐温80 0.5g/l，ph7.0。
19.其中，发酵培养条件为培养温度25-42℃，摇床转速160-220r/min，发酵时间16-48h。
20.优选地，发酵培养条件为培养温度40℃，摇床转速180r/min，发酵时间36h。
21.其中，所述发酵菌种接种量为1-7％(v/v)。优选地，所述发酵菌种接种量为2％(v/v)。
22.其中，所述发酵培养基中添加0.5-3.0％大曲粉。优选地，添加2.5％大曲曲粉。
23.(3)将步骤(2)中发酵液过滤、离心后，提取和纯化目标菌株代谢产物，即可。
24.本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌在制备含小肽类物质的发酵食品、抗菌药物或白酒酿造上的应用。
25.其中，所述小肽类物质为二肽或环二肽。优选地，所述环二肽为环缩二亮氨酸cyclo(l-leu-l-leu)。
26.有益效果：本发明通过对酒厂的大曲、糟醅与窖泥采样，样品预处理，菌株富集培养，菌株初筛，菌株分离纯化和菌株鉴定，最终从大曲中分离筛选出一株能够高产小肽类物质的枯草芽孢杆菌菌株，其保藏编号为：cgmcc no.27148，保藏时间2023年4月18日。通过对发酵培养基的成分及培养条件进行优化，实现该菌株产小肽类物质的显著增产，本发明的产小肽类物质枯草芽孢杆菌菌株易培养，生产安全性高，该菌株发酵培养产小肽类物质量超过1800mg/l，遗传稳定性好，环保、经济，具有较好应用前景。
27.本发明产小肽类物质的枯草芽孢杆菌新菌株于2023年04月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.27148。保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。分类命名为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。
附图说明
28.图1为实施例1产小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)枯草芽孢杆菌平板初筛平板图；
29.图2为实施例1产小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)枯草芽孢杆菌划线平板图；
30.图3为实施例2小肽类物质(cyclo(l-leu-l-leu)吸光度图；
31.图4为实施例3不同葡萄糖浓度对小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量的影响；
32.图5为实施例3不同浓度的(nh4)2so4对小肽类cyclo(l-leu-l-leu)物质的产量影响；
33.图6为实施例3不同ph值对小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量的影响；
34.图7为实施例5不同菌株接种量对小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量的影响；
35.图8为实施例5不同发酵温度对小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量的影响；
36.图9为实施例5大曲粉、窖泥浸出物和糟醅浸出物添加量对小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量的影响；
37.图10为实施例5枯草芽孢杆菌发酵正交实验组合对应的小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量；
38.图11为实施例5无机盐浓度对小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量的影响；
39.图12为实施例5吐温80添加量对小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量的影响；
40.图13为实施例5培养时间对小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量的影响。
具体实施方式
41.本发明先通过lb培养基从五粮液酒厂的大曲、糟醅和窖泥中筛选分离出大量的目标菌株；再以目标菌株进行后续的筛选，获得少量能够产一定量小肽类物质的菌株。复筛获得的菌株经过后续鉴定为芽孢杆菌属的微生物类群。然后，将以上芽孢杆菌属类群进行培养，经种子培养、发酵培养等各个参数优化，实现小肽类物质高产量。以上菌株来自大曲、糟醅和窖泥，所以后续的培养中添加了相应的糟醅、窖泥浸出物和大曲粉。目前，获得小肽类产量最高的一株是来自大曲的枯草芽孢杆菌y1，其保藏编号为cgmcc no.27148。
42.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
43.实施例1菌株的筛选及鉴定
44.1、大曲、糟醅与窖泥取样
45.取宜宾五粮液股份有限公司的浓香型白酒生产车间窖泥、糟醅、大曲各5g分别加入到100ml灭菌后的0.85％生理盐水中，放入摇床中振荡混匀，参数为37℃，180rpm/min，30min。
46.2、样品预处理
47.将振荡后的菌液置于80℃烘箱30min后取出。梯度依次稀释成10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
七个梯度。
48.3、菌株富集培养
49.取上述处理后的溶液中10-5
、10-6
、10-7
三个梯度的溶液50μl加到配置好的20ml lb液体培养基中，置于37℃摇床中，转速180rpm，振荡培养12h。所述lb液体培养基为：10g/l蛋白胨，5g/l酵母浸出粉，10g/l氯化钠，ph 7.0。
50.4、菌株初筛
51.取出培养好的菌液，用移液枪分别吸取0.1ml加到lb液体培养基，涂布在lb固体培养基，放入37℃培养箱中恒温培养12-36h，若未长出菌落或者菌落不明显，可以多培养几个小时。所述lb液体培养基为：10g/l蛋白胨，5g/l酵母浸出粉，10g/l氯化钠，ph 7.0；对应的lb固体培养基需要加入15g/l琼脂粉。
52.接种到lb固体培养基中的菌体发酵后，经过过滤、离心处理后，将发酵液进行旋转蒸发浓缩，用无水乙醇沉淀后，取上清液，膜过滤，滤液经制备色谱分离，分段收集，收集液作为待测样品，具体的处理及色谱分离条件参照廖勤俭等(廖勤俭，安明哲，李杨华，等.酒糟黄水中二肽和环二肽的研究[j].酿酒科技,2018(10)：17-23.)。
[0053]
待测发酵液进行高效液相色谱仪(hplc)检测和质谱检测器(q-tof)，结合相应的采集软件、定性定量分析软件进行数据收集和处理，详细方法参照(邓霞玲,练顺才,谢正敏,等.白酒中环二肽成分的分析研究[j].酿酒科技,2017(9)：27-32.)文献报道。
[0054]
5、菌株的分离纯化
[0055]
从培养好的lb固体培养基平板中选取轮廓清晰、明显的菌落，在lb固体培养基上进行多次划线培养(图1)；连续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化。挑取平板上单个菌落待用(图2)。所述培养条件：置于37℃恒温培养箱中培养24-48h，直至
长出单个菌落。
[0056]
6、菌株的鉴定
[0057]
6.1生理生化：将得到目标菌株使用革兰氏染色法制片在显微镜下观察。相关步骤如下所述：
[0058]
(1)涂菌：取干净载玻片一块，在载玻片上加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片；
[0059]
(2)干燥：让涂片自然晾干或在酒精灯火焰上方文火烘干；
[0060]
(3)固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2～3次固定(以不烫手为宜)；
[0061]
(4)初染：滴加结晶紫染色(以刚好覆盖菌膜为宜)1～2min，水洗；
[0062]
(5)媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗；
[0063]
(6)脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95％的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗；
[0064]
(7)复染：用番红液复染约2min，水洗；
[0065]
(8)镜检：干燥后，用油镜观察。结果为该菌为革兰氏阳性菌，菌体单一，皆为长杆状。
[0066]
将得到的目标菌株接入到50ml lb液体培养基中培养(37℃，180rpm，12-48h)。
[0067]
6.2将培养所得的菌株使用月桂酸钠提取法提取dna，相关步骤如下所述：
[0068]
(1)将培养的菌液用2ml离心管在8000rpm离心2min，晾干；
[0069]
(2)在离心管中加入160μl 20mg溶菌酶，37℃水浴30min；
[0070]
(3)加20μl蛋白酶k处理15s，70℃水浴10min；
[0071]
(4)加入0.9ml月桂酸钠提取液，将离心管放入摇床缓慢摇匀(200rpm，15～20min)；
[0072]
(5)向ep管中加入等体积(0.9ml)酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，缓慢摇匀；
[0073]
(6)12000rpm，4℃离心20min；
[0074]
(7)将白色沉淀析出至2ml ep管中；
[0075]
(8)加入1.8ml，70％乙醇反复振荡洗涤，4℃，12000rpm，15min；
[0076]
(9)弃上清液，12000rpm离心30s；
[0077]
(10)实验室自然干燥或置于50℃烘箱1min，挥发干燥剩余乙醇；
[0078]
(11)向ep管中加入25～50μl灭菌后的ddh2o，轻微弹匀溶解dna；
[0079]
(12)加入1/100体积浓度为10mg/ml的rnase置于37℃水浴30min，消化rna，取出3μl，以1％琼脂糖检测是否有rna残留。
[0080]
6.3pcr扩增
[0081]
(1)试剂及用量：2
×
mix酶25μl，
[0082]
1492r引物seq id no.2:(5'-ggttaccttgttacgactt-3')0.5μl，
[0083]
27f引物seq id no.3：(5'-agagtttgatcctggctcag-3')0.5μl，
[0084]
dna提取液1μl，
[0085]
ddh2o 23μl；
[0086]
(2)pcr体系：预变性94℃3min；变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃45s，循环25-35次；终延伸72℃10min。
[0087]
6.4电泳
[0088]
将pcr扩增后的产物用1％琼脂凝胶电泳。
[0089]
测序：将pcr产物送生物测序公司进行生物信息学处理，完成数据整理和分析。用27f\1492r通用引物对得到的基因组进行pcr扩增。扩增的片段送到上海生工技术有限公司进行测序。得到对应菌株的16s rdna序列，通过序列拼接和校对后，使用ncbi数据库进行比对，通过mega 7.0构建系统发育进化树，确定菌株的系统地位，其小肽类产量最高的一株鉴定其为枯草芽孢杆菌新菌株，来自大曲，命名为bacillus subtilis y1，将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.27148。
[0090]
实施例2小肽类物质发酵工艺及其优化
[0091]
1、种子培养：将枯草芽孢杆菌y1(bacillus subtilis y1)接至种子培养基中，接种量2-3％，培养得到发酵菌种；
[0092]
2、发酵培养：将发酵菌种接至发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养基配方为：葡萄糖8-55g/l、硫酸铵1-13g/l、柠檬酸钠1-20g/l、三水合磷酸氢二钾0.1-2.5g/l、二水合氯化钙0.2-1.2g/l、六水合氯化铁0.02-0.4g/l、七水合硫酸镁0.2-2.5g/l、一水合硫酸锰0.002-0.6g/l、酵母粉0.1-2.2g/l、吐温80 0.1-1.2％、ph6.5-8.0；
[0093]
发酵培养条件：培养温度25-42℃，摇床转速160-220r/min，发酵时间16-48h，发酵接种量2-3％。
[0094]
将发酵液经过旋转蒸发浓缩后根据实施例1中的第4部分的菌株初筛中方法进行收集，收集液备用。
[0095]
3、样品小肽类化合物的质谱定性检测
[0096]
根据实施例1中所述廖勤俭等报道，利用高效液相色谱质谱lc-qtof，分析检测各制备分离收集的样品，先对各样品进行全扫描，找出具有二肽和环二肽特征的目标离子，再针对目标离子进行target-ms方式进行二级质谱图检测，以确定其结构式。
[0097]
4、通过对发酵液中样品的浓缩、萃取、制备色谱分离等前处理方式，利用高分辨高效液相色谱质谱lc-qtof分析检测，可以分离检测出小肽类物质(包括二肽和环二肽等；图3)。
[0098]
实施例3发酵培养基单因素的优化
[0099]
碳水化合物的存在是诱导小肽类物质合成的必要条件，合适的氮源能有效提高小肽类物质合成所需底物氨基酸的合成效率；高含量的小肽类物质对菌株自身生长有抑制作用，而添加生长因子(酵母粉)能够有效提高细胞浓度，对小肽类物质合成起到积极作用；同时，合适的无机盐成分配比保证了细胞的生长和胞内生化反应的正常运行。所以，有关小肽类物质发酵单因素的优化根据枯草芽孢杆菌的生长特点和小肽类物质合成的特殊需求，有针对性的优化培养基各个关键组分，并通过正交实验取得了最佳的成分配比，形成了完整的发酵优化条件，以上发酵培养基成分简单，使得后续的产物分离、纯化更加简单。
[0100]
以下所述内容以小肽类环缩二亮氨酸cyclo(l-leu-l-leu)的发酵培养基单因素优化条件，发酵后的发酵液的处理、小肽类产量的检测和确定方法参照实施例2。
[0101]
(1)种子培养：将枯草芽孢杆菌y1(bacillus subtilis y1)接至种子培养基中，接种量2％，培养得到发酵菌种；其中，初始培养基(即种子培养基)组成：10g/l蛋白胨；5g/l酵母浸出粉；10g/l氯化钠；ph 7.0；固体培养基加琼脂15g/l；所述种子培养条件为：培养温度
37℃，摇床转速180r/min，培养时间为10h。
[0102]
(2)将2％发酵菌种接至发酵培养基中进行发酵培养；小肽类环缩二亮氨酸cyclo(l-leu-l-leu)的发酵培养基以初始发酵培养基为基础进行发酵培养基成分浓度优化。
[0103]
其中，初始发酵培养基成分为：葡萄糖40g/l，硫酸铵7g/l，柠檬酸钠12g/l，三水合磷酸氢二钾0.5g/l，二水合氯化钙0.15g/l，六水合氯化铁0.04g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，一水合硫酸锰0.10g/l，酵母粉1g/l，吐温80 1g/l，ph7.0。
[0104]
1、葡萄糖浓度地筛选
[0105]
保持除碳源以外的其他成分浓度不变，选择不同浓度的葡萄糖(10g/l，20g/l，30g/l，40g/l，50g/l)进行摇瓶发酵实验，发酵结束后，测定小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)的产量。培养条件：37℃，180rpm，发酵36h。
[0106]
不同浓度的葡萄糖所对应的小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量如图4所示。最佳葡萄糖浓度为40g/l，小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量为876.65mg/l。
[0107]
2、培养基的氮源浓度筛选
[0108]
除硫酸铵(nh4)2so4以外，其他成分浓度不变，培养基的氮源选择3.8g/l，6.2g/l，8.6g/l，10.2g/l的(nh4)2so4进行摇瓶发酵，发酵实验结束后测定小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)的产量。培养条件：37℃，180rpm，发酵36h。
[0109]
不同浓度的硫酸铵(nh4)2so4所对应的小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量如图5所示。最佳(nh4)2so4浓度为8.6g/l，小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量为887.45mg/l(图5)。
[0110]
3、ph值的筛选
[0111]
不同ph值条件下的小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量对比，以葡萄糖浓度为40g/l作为最优培养基为基础，保持初始发酵培养基中其他所有成分浓度不变，选择ph值为6.5，7.0，7.5，8.0进行摇瓶发酵培养，发酵实验结束后测定发酵产物中小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)的产量。培养条件：37℃，180rpm，发酵36h。
[0112]
不同的ph值所对应的小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量如图6所示。从图中可以看出：ph值为7.0时小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量为943.53mg/l(图6)。
[0113]
实施例4培养基优化正交实验
[0114]
通过实施例3的单因素试验，结合所筛选枯草芽孢杆菌的发酵特性，选择显著影响小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量的三个因素：硫酸铵、葡萄糖和ph，并以误差作为一个影响因素设计三因素三水平的正交试验，进一步优化发酵培养基，最终确定培养基的配比和浓度。正交试验因素水平(表1)，具体试验设计、小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量(表2)，以及极差分析结果如表3所示。正交结果实验组5的小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量最高，达到1230.32mg/l。
[0115]
表1.枯草芽孢杆菌发酵正交试验因素水平
leu-l-leu)的产量明显下降(图9)。
[0136]
根据以上大曲曲粉、窖泥浸出物和糟醅浸出物对小肽类物质产量的影响，选择2.50％大曲粉作为添加物与正交实验获得的最优发酵培养基进行后续的发酵实验。根据枯草芽孢杆菌发酵正交实验和大曲粉添加量，完成摇瓶发酵后，各组正交实验所得小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量。最终获得枯草芽孢杆菌发酵产生小肽类物cyclo(l-leu-l-leu)质量超过1800mg/l(表4，图10)。其中图10中1-9分别表示表4中正交组合序号。
[0137]
表4.枯草芽孢杆菌发酵正交试验对应小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量
[0138][0139][0140]
4、发酵培养基中无机盐的筛选
[0141]
根据cyclo(l-leu-l-leu)的初始发酵培养基，对无机盐成分进行添加浓度优化实验。最终发现柠檬酸钠和fecl3·
6h2o对产量存在一定的影响；无机盐中k2hpo4·
3h2o、cacl2·
2h2o、mgso4·
7h2o和mnso4·
h2o对cyclo(l-leu-l-leu)产量无显著影响。经过多轮次优化后，确定产cyclo(l-leu-l-leu)的各个无机盐最优浓度分别为柠檬酸钠为12g/l、k2hpo4·
3h2o为0.5g/l、cacl2·
2h2o为0.2g/l、fecl3·
6h2o为0.04g/l、mgso4·
7h2o为0.5g/l和mnso4·
h2o为0.015g/l(图11)。
[0142]
5、发酵培养基中吐温80的浓度筛选
[0143]
优化后发酵培养基为初始培养基，其发酵培养基成分为：葡萄糖40g/l、硫酸铵8.6g/l、柠檬酸钠12g/l、三水合磷酸氢二钾0.5g/l、二水合氯化钙0.2g/l、六水合氯化铁0.04g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、一水合硫酸锰0.015g/l，酵母粉1g/l。吐温80作为常用的表面活性剂，可提高细胞膜的通透性，可以增强小分子产物分泌到胞外，在发酵培养基中添加一定浓度吐温80可以有效提高发酵产物的产量。本发明内容的发酵液中添加浓度为0.5g/l的吐温80(图12)对产量影响不显著。
[0144]
6、发酵时间的筛选
[0145]
优化后发酵培养基为初始培养基，其发酵培养基成分为：葡萄糖40g/l、硫酸铵
8.6g/l、柠檬酸钠12g/l、三水合磷酸氢二钾0.5g/l、二水合氯化钙0.2g/l、六水合氯化铁0.04g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、一水合硫酸锰0.015g/l，酵母粉1g/l，吐温80 0.5g/l。发酵时间产生的产量呈现出先上升再下降的趋势，小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量在发酵时间为36-60h(图13)，对产量的影响程度不显著。
[0146]
根据以上发酵培养基成分、浓度、发酵工艺参数的筛选，本发明最终确定筛选的枯草芽孢杆菌产小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量最优的方案为：
[0147]
小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)发酵培养基成分为：葡萄糖40g/l，硫酸铵8.6g/l，柠檬酸钠12g/l，三水合磷酸氢二钾0.5g/l，二水合氯化钙0.2g/l，六水合氯化铁0.04g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，一水合硫酸锰0.015g/l，酵母粉1g/l，吐温80 0.5g/l，ph7.0。
[0148]
种子培养后的发酵接种量为2％，发酵温度为40℃，发酵时间为36h，摇床转速180rpm/min。
[0149]
其中，发酵培养基成分中添加大曲曲粉2.5％更利于提高枯草芽孢杆菌产小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)产量。
[0150]
综上所述，小肽类物质cyclo(l-leu-l-leu)获得发酵培养基各成分如下：葡萄糖40g/l，硫酸铵8.6g/l，柠檬酸钠12g/l，三水合磷酸氢二钾0.5g/l，二水合氯化钙0.2g/l，六水合氯化铁0.04g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，一水合硫酸锰0.015g/l，酵母粉1g/l，吐温80 0.5g/l，ph7.0。相关发酵条件为：发酵接种量为2％，发酵温度为40℃，发酵时间为36h，摇床转速180rpm/min。

技术特征：
1.产小肽类物质的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，其特征在于：保藏编号为cgmcc no.27148。2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌菌株发酵产小肽类物质的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)种子培养：将枯草芽孢杆菌接种至种子培养基中进行种子培养得到发酵菌种；(2)发酵培养：将发酵菌种接至发酵培养基中进行发酵培养；(3)将步骤(2)中发酵液过滤、离心后，提取和纯化目标菌株代谢产物，即可。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于：步骤(1)中，满足以下至少一项：所述种子培养基配方为：10g/l蛋白胨，5g/l酵母浸出粉，10g/l氯化钠，ph 7.0；所述种子培养条件为：培养温度37℃，摇床转速180r/min，培养时间为10h；所述接种量为2-3v/v％。4.根据权利要求3所述方法，其特征在于：步骤(2)中，所述发酵培养基配方为：葡萄糖8-55g/l、硫酸铵1-13g/l、柠檬酸钠1-20g/l、三水合磷酸氢二钾0.1-2.5g/l、二水合氯化钙0.2-1.2g/l、六水合氯化铁0.02-0.4g/l、七水合硫酸镁0.2-2.5g/l、一水合硫酸锰0.002-0.6g/l、酵母粉0.1-2.2g/l、吐温80 0.1-1.2g/l、ph6.5-8.0。5.根据权利要求4所述方法，其特征在于：所述发酵培养基配方为：葡萄糖40g/l、硫酸铵8.6g/l、柠檬酸钠12g/l、三水合磷酸氢二钾0.5g/l、二水合氯化钙0.2g/l、六水合氯化铁0.04g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、一水合硫酸锰0.015g/l、酵母粉1g/l，吐温80 0.5g/l，ph7.0。6.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于：满足以下至少一项：发酵培养温度25-42℃；优选地，培养温度40℃；发酵培养摇床转速160-220r/min；优选地，摇床转速180r/min；发酵培养时间16-48h；优选地，发酵时间36h。7.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于：所述发酵菌种接种量为1-7v/v％；优选地，所述发酵菌种接种量为2v/v％。8.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于：所述发酵培养基中添加0.5-3.0％大曲粉；优选地，添加2.5％大曲粉。9.权利要求1所述枯草芽孢杆菌在制备含小肽类物质的发酵食品、抗菌药物或白酒酿造上的应用。10.根据权利要求9所述应用，其特征在于：采用权利要求2-8任一项所述的方法发酵产小肽类物质。

技术总结
本发明属于微生物技术领域，具体涉及产小肽类物质的枯草芽孢杆菌菌株及用途。针对现有产小肽类物质的微生物研究较少，且小肽类物质产量较低的问题，本发明提供一株产小肽类物质的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)新菌株，保藏编号为CGMCC No.27148。本发明通过对发酵培养基的成分及培养条件进行优化，实现该菌株产小肽类物质的显著增产，且该菌株易培养，生产安全性高，该菌株发酵培养产小肽类物质量超过1800mg/L，遗传稳定性好，环保、经济，具有较好应用前景。好应用前景。好应用前景。


技术研发人员：刘君 郑佳 袁思棋 赵东 雍茜浩 王洪 李玲珊
受保护的技术使用者：四川轻化工大学
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/10/5