一种可体外检测的柔性酶葡萄糖传感器

1.本发明涉及一种可体外检测的柔性酶葡萄糖传感器。


背景技术：

2.现有的血糖检测技术主要依赖于侵入性采血方法，这对频繁的血糖监测提出了重大挑战。例如，青少年i型糖尿病的管理中，儿童每次吃东西时都需要监测他们的血糖水平，无法适用侵入性采血方法。持续葡萄糖监测(cgm)技术，是指通过葡萄糖感应器连续监测皮下组织间液葡萄糖浓度的技术，相较传统血糖仪避免了指尖采血的疼痛和不便，具有高便携性。但高昂的成本限制了它的广泛应用。
3.目前主要依赖于监测血液中的血糖水平来实现糖尿病检测，但其它体液，如尿液，也为糖尿病管理提供了额外的优势。肾并发症是在糖尿病长期过程中最常见的并发症之一，其中葡萄糖通过尿液排出。因此，探索尿液中葡萄糖的可靠检测方法至关重要。虽然商业尿条提供了一种简单的方法来检测尿糖，但灵敏度差和可靠性低限制了它们的使用。


技术实现要素：

4.基于上述现有技术所存在的不足之处，本发明提供一种可体外检测的柔性酶葡萄糖传感器。
5.为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
6.一种可体外检测的柔性酶葡萄糖传感器，其特点在于：所述柔性酶葡萄糖传感器包括柔性基底和配置在柔性基底上的电极系统；所述电极系统包括工作电极、对电极和参比电极；在所述工作电极上修饰有功能层，所述功能层由氨基化石墨烯量子点与空心金纳米球复合而成；在所述功能层上还修饰有壳聚糖固定的葡萄糖氧化酶。
7.进一步地，所述功能层是首先在工作电极表面滴涂氨基化石墨烯量子点(af-gqd)溶液，再滴涂空心金纳米球溶液，从而获得。af-gqd的氨基基团与空心金纳米球相互作用，使空心金纳米球共价固定在电极表面。更进一步地，所述氨基化石墨烯量子点溶液的浓度为1～6mg/ml。
8.进一步地，所述壳聚糖固定的葡萄糖氧化酶是通过在功能层上滴涂葡萄糖氧化酶与壳聚糖的混合溶液而形成。更进一步地，所述葡萄糖氧化酶与壳聚糖的混合溶液是将葡萄糖氧化酶加入到壳聚糖溶液中并超声分散均匀而获得；所述壳聚糖溶液的ph值在4.2～6.3之间、质量浓度为0.1～1.0％，所得混合溶液中葡萄糖氧化酶的浓度为15～30mg/ml。
9.进一步地，所述柔性基底采用聚对苯二甲酸乙二醇酯pet。
10.进一步地：所述对电极和所述工作电极通过在柔性基底上印刷导电碳浆而形成，所述参比电极通过在柔性基底上印刷导电银浆而形成。银浆和碳浆固定化温度在120～150℃之间，固定化时间在10～15min。
11.与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：
12.1、本发明将氨基化石墨烯量子点与空心金纳米球引入工作电极中，利用af-gqd的
氨基基团与空心金纳米球的相互作用，使空心金纳米球共价固定在电极表面，提高了传感过程的电子转移速率和导电性。
13.2、空心金纳米球具有较大的表面积，导电性高、生物相容性好，可有效增加葡萄糖氧化酶的负载，保持葡萄糖氧化酶的生物活性。由于空心金纳米球的中空结构，葡萄糖氧化酶分子可以存在于空心金纳米球的壳内外，可以有效地放大检测葡萄糖的氧化电流强度。
14.3、本发明的传感器在50μm～1.4mm范围之间有良好的线性关系，具有灵敏度高、稳定性好的优势，可用于尿糖的检测。
附图说明
15.图1为实施例1所制备的氨基化石墨烯量子点的透射电镜图。
16.图2为实施例1所制备的氨基化石墨烯量子点的红外光谱图。
17.图3为实施例1所制备的空心金纳米球的透射电镜图。
18.图4为实施例1各步骤中逐步修饰电极的电化学表征。
19.图5为使用3种浓度(2、4、6mg/ml)的氨基化石墨烯量子点溶液所得af-gqd修饰电极传感器的cv对比图。
20.图6为不同ph值下修饰电极检测葡萄糖的cv对比图(如图6(a)所示)以及氧化电流和ph值的线性关系图(如图6(b)所示)。
21.图7为本发明实施例1所制备的葡萄糖传感器的循环伏安图。
22.图8为本发明实施例1所制备的葡萄糖传感器的氧化峰值与葡萄糖浓度在50μm～1.4mm范围内的线性关系。
具体实施方式
23.下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作详细说明，下述实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
24.实施例1
25.本实施例提供一种可体外检测的柔性酶葡萄糖传感器，包括柔性pet基底和配置在柔性基底上的电极系统；电极系统包括工作电极、对电极和参比电极；对电极和工作电极通过在柔性基底上印刷导电碳浆而形成，参比电极通过在柔性基底上印刷导电银浆而形成。
26.在工作电极上修饰有由氨基化石墨烯量子点与空心金纳米球复合而成的功能层，在功能层上还修饰有壳聚糖固定的葡萄糖氧化酶。工作电极的具体修饰方法如下：
27.步骤1、丝网印刷电极活化：用0.05mol/ml硫酸溶液浸泡电极2小时，之后使用硫酸溶液作为电解液通过循环伏安法扫描20圈，cv图峰值基本稳定后拿出用纯水冲洗在室温下晾干，置于4℃保存。
28.步骤2、氨基化石墨烯量子点(af-gqd)的修饰
29.称取2.5g柠檬酸放入锥形瓶中，并将其置于200℃的均相反应器中加热40min，反应结束后，将锥形瓶取出，瓶内有淡黄色油状液体出现，待其冷却后，于通风橱中加入35ml氢氧化铵，液体逐渐变成橘红色，由于温度降低，部分油状液体凝固，需要超声处理至完全
溶解，然后密封置于黑暗中1-2天，至液体变成深黄色，再将其置于300d透析袋中透析，隔一个小时换一次水，直到透析袋内液体ph为7即可。将得到的浅黄色液体在冻干机中冻干得到af-gqd粉末。
30.将af-gqd粉末加入到去离子水中，制备成4mg/ml的溶液并滴涂在电极表面，干燥后得到了af-gqd修饰电极。
31.步骤3、空心金纳米球(hgns)的修饰
32.在250ml三颈圆底烧瓶中，将100ml纯水与100μl0.4m氯化钴溶液及400μl0.1m柠檬酸钠溶液混合，同时，注入100μl平均分子量为58000的1wt％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)溶液。用氩气鼓泡代替磁搅拌，因为钴纳米颗粒具有磁性，使用磁性搅拌器将导致链结构的形成，鼓泡40min，使溶液除去氧气。向该溶液中注入100μl1.0m硼氢化钠溶液，几秒钟后溶液从淡粉色变为偏黑色，表明形成了钴纳米颗粒﹐添加的pvp在整个体系转入有氧环境时，减缓钴纳米颗粒与氧气的反应，保证氯金酸和钴纳米颗粒充分反应。
33.随后，将30ml钴纳米颗粒溶液转移到100ml烧杯中﹐并立即添加10ml纯水和62μl1wt％氯金酸溶液，使钴还原au
3+
，让溶液在有氧环境条件下再搅拌五分钟，使钴的氧化反应和置换反应同时进行，颜色从黑色缓慢变为墨绿色表明hgns的形成已完成，且钴已经反应完全，反应中生成的氧化钴，由于添加了柠檬酸钠，会分解形成钴离子。最后，用离心机以10000rpm的转速下，在室温环境中旋转15min，去除上清液并分散在5ml纯水中，得到纯hgns溶液。
34.在步骤2中的af-gqd修饰电极表面滴涂纯hgns溶液，干燥后得到af-gqd-hgns复合材料修饰电极。
35.步骤4、将葡萄糖氧化酶分散到ph＝5质量浓度为0.2％的壳聚糖溶液中并超声分散均匀，然后将所得混合溶液滴涂在步骤3制备的电极表面，静置12h使葡萄糖氧化酶沉积在电极表面，即得到修饰后的工作电极。其中，混合溶液中葡萄糖氧化酶的浓度为30mg/ml。制备好的电极在4℃下保存。
36.实施例2
37.本实施例提供的柔性酶葡萄糖传感器的结构与实施例1相同，区别在于工作电极的具体修饰方法如下：
38.步骤1、丝网印刷电极活化：用0.05mol/ml硫酸溶液浸泡电极2小时，之后使用硫酸溶液作为电解液通过循环伏安法扫描20圈，cv图峰值基本稳定后拿出用纯水冲洗在室温下晾干，置于4℃保存。
39.步骤2、氨基化石墨烯量子点(af-gqd)的修饰
40.称取5g柠檬酸放入锥形瓶中，并将其置于200℃的均相反应器中加热40min，反应结束后，将锥形瓶取出，瓶内有淡黄色油状液体出现，待其冷却后，于通风橱中加入70ml氢氧化铵，液体逐渐变成橘红色，由于温度降低，部分油状液体凝固，需要超声处理至完全溶解，然后密封置于黑暗中1-2天，至液体变成深黄色，再将其置于300d透析袋中透析，隔一个小时换一次水，直到透析袋内液体ph为7即可。将得到的浅黄色液体在冻干机中冻干得到af-gqd粉末。
41.将af-gqd粉末加入到去离子水中，制备成2mg/ml的溶液并滴涂在电极表面，干燥后得到了af-gqd修饰电极。
42.步骤3、空心金纳米球(hgns)的修饰
43.在250ml三颈圆底烧瓶中，将100ml纯水与100μl0.4m氯化钴溶液及400μl0.1m柠檬酸钠溶液混合，同时，注入100μl平均分子量为58000的1wt％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)溶液。用氩气鼓泡40min，使溶液除去氧气。向该溶液中注入100μl1.0m硼氢化钠溶液，几秒钟后溶液从淡粉色变为偏黑色，表明形成了钴纳米颗粒。
44.随后，将30ml钴纳米颗粒溶液转移到100ml烧杯中﹐并立即添加10ml纯水和62μl1wt％氯金酸溶液，使钴还原au
3+
，让溶液在有氧环境条件下再搅拌五分钟，使钴的氧化反应和置换反应同时进行，颜色从黑色缓慢变为墨绿色表明hgns的形成已完成，且钴已经反应完全，反应中生成的氧化钴，由于添加了柠檬酸钠，会分解形成钴离子。最后，用离心机以10000rpm的转速下，在室温环境中旋转15min，去除上清液并分散在10ml纯水中，得到纯hgns溶液。
45.在步骤2中的af-gqd修饰电极表面滴涂纯hgns溶液，干燥后得到af-gqd-hgns复合材料修饰电极。
46.步骤4、将葡萄糖氧化酶分散到ph＝5质量浓度为0.2％的壳聚糖溶液中并超声分散均匀，然后将所得混合溶液滴涂在步骤3制备的电极表面，静置12h使葡萄糖氧化酶沉积在电极表面，即得到修饰后的工作电极。其中，混合溶液中葡萄糖氧化酶的浓度为30mg/ml。制备好的电极在4℃下保存。
47.实施例3
48.本实施例提供的柔性酶葡萄糖传感器的结构与实施例1相同，区别在于工作电极的具体修饰方法如下：
49.步骤1、丝网印刷电极活化：用0.05mol/ml硫酸溶液浸泡电极2小时，之后使用硫酸溶液作为电解液通过循环伏安法扫描20圈，cv图峰值基本稳定后拿出用纯水冲洗在室温下晾干，置于4℃保存。
50.步骤2、氨基化石墨烯量子点(af-gqd)的修饰
51.称取7.5g柠檬酸放入锥形瓶中，并将其置于200℃的均相反应器中加热40min，反应结束后，将锥形瓶取出，瓶内有淡黄色油状液体出现，待其冷却后，于通风橱中加入105ml氢氧化铵，液体逐渐变成橘红色，由于温度降低，部分油状液体凝固，需要超声处理至完全溶解，然后密封置于黑暗中1-2天，至液体变成深黄色，再将其置于300d透析袋中透析，隔一个小时换一次水，直到透析袋内液体ph为7即可。将得到的浅黄色液体在冻干机中冻干得到af-gqd粉末。
52.将af-gqd粉末加入到去离子水中，制备成6mg/ml的溶液并滴涂在电极表面，干燥后得到了af-gqd修饰电极。
53.步骤3、空心金纳米球(hgns)的修饰
54.在250ml三颈圆底烧瓶中，将100ml纯水与100μl0.4m氯化钴溶液及400μl0.1m柠檬酸钠溶液混合，同时，注入100μl平均分子量为58000的1wt％聚乙烯吡咯烷酮(pvp)溶液。用氩气鼓泡40min，使溶液除去氧气。向该溶液中注入100μl1.0m硼氢化钠溶液，几秒钟后溶液从淡粉色变为偏黑色，表明形成了钴纳米颗粒。
55.随后，将30ml钴纳米颗粒溶液转移到100ml烧杯中﹐并立即添加10ml纯水和62μl1wt％氯金酸溶液，使钴还原au
3+
，让溶液在有氧环境条件下再搅拌五分钟，使钴的氧化反
应和置换反应同时进行，颜色从黑色缓慢变为墨绿色表明hgns的形成已完成，且钴已经反应完全，反应中生成的氧化钴，由于添加了柠檬酸钠，会分解形成钴离子。最后，用离心机以10000rpm的转速下，在室温环境中旋转15min，去除上清液并分散在20ml纯水中，得到纯hgns溶液。
56.在步骤2中的af-gqd修饰电极表面滴涂纯hgns溶液，干燥后得到af-gqd-hgns复合材料修饰电极。
57.步骤4、将葡萄糖氧化酶分散到ph＝5质量浓度为0.2％的壳聚糖溶液中并超声分散均匀，然后将所得混合溶液滴涂在步骤3制备的电极表面，静置12h使葡萄糖氧化酶沉积在电极表面，即得到af-gqd-hgns-cs-god复合材料修饰后的工作电极。其中，混合溶液中葡萄糖氧化酶的浓度为30mg/ml。制备好的电极在4℃下保存。
58.一、af-gqd的形貌和结构表征
59.图1是实施例1所制备的af-gqd的透射电子显微镜图，从图中可以看出af-gqd大小均一，平均粒径约为5nm。通过图2的ftir光谱进一步表征af-gqd的官能团：在3415cm-1
处af-gqd有一个明显的ft-ir吸收峰，这应该是n-h键的伸缩振动；而在1562cm-1
处的吸收峰归因于n-h键的弯曲振动；c-n键和c＝o键的拉伸振动在分别用1400cm-1
和1677cm-1
处的吸收峰来表示，表明af-gqd结构中存在酰胺。这些结果充分证明成功制备了af-gqd。
60.二、空心金纳米球的形貌表征
61.图3是空心金纳米球的透射电子显微镜图，从图中可以看出材料呈中空结构，粒径在25nm左右。
62.三、逐步修饰电极的电化学表征
63.将实施例1步骤2～4修饰好的电极分别在chi660e电化学工作站进行循环伏安法测试，电解液为0.1mkcl和5mm铁氰化钾/亚铁氰化钾的混合液(二者体积比为1：1)，结果如图4所示。af-gqd修饰电极在电解液中转移电子速率比裸电极快，电流响应增加。af-gqd-hgns复合材料修饰电极在电解液中转移电子速率比af-gqd修饰电极快，电流响应进一步增加。af-gqd-hgns-cs-god复合材料修饰电极在电解液中电子转移速率下降，由于壳聚糖膜导致电极表面的电子流阻塞所以电流响应下降。
64.四、石墨烯量子点的浓度优化
65.将实施例1步骤2中的氨基化石墨烯量子点配制成2、4、6mg/ml三个浓度，分别取不同浓度的氨基化石墨烯量子点溶液30μl滴涂在电极表面，得到af-gqd修饰电极。
66.将修饰好的电极在chi660e电化学工作站进行循环伏安法测试，电解液为含有1mm葡萄糖的ph＝8.5pbs溶液。图5为氨基化石墨烯量子点不同浓度条件下，步骤2所得af-gqd修饰的工作电极的电流响应对比图，可以看出氨基化石墨烯量子点浓度为4mg/ml的传感器对葡萄糖检测的电流响应更高。
67.五、所制备的葡萄糖传感器的ph值优化
68.将实施例1中af-gqd-hgns-cs-god复合材料修饰好的电极在chi660e电化学工作站进行循环伏安法测试，电解液为含有1mm葡萄糖的不同ph值下的0.1mpbs溶液。图6为不同ph值下修饰电极检测葡萄糖的cv对比图(如图6(a)所示)并得到氧化电流和ph值的线性关系(如图6(b)所示)，可以看出在ph＝8.5时葡萄糖的氧化电流最高。
69.六、实施例1所得传感器对葡萄糖的响应
70.图7为实施例1所制备的葡萄糖传感器在葡萄糖浓度为50μm-1.4mm范围内的循环伏安曲线图。从下到上依次为0.05、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mm葡萄糖浓度，可以看出氧化电流随着葡萄糖浓度的升高而升高，同时可以得到图8的线性关系。
71.图8为实施例1所制备的葡萄糖传感器在葡萄糖浓度为50μm-1.4mm范围内氧化峰值与葡萄糖浓度的线性关系，根据y＝0.473x+2.385、r2＝0.994可以看出在50μm-1.4mm范围内传感器具有良好的线性关系，此范围同时可以监测尿液中葡萄糖的含量，计算可得灵敏度为19.204μa/mm/cm2。
72.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种可体外检测的柔性酶葡萄糖传感器，其特征在于：所述柔性酶葡萄糖传感器包括柔性基底和配置在柔性基底上的电极系统；所述电极系统包括工作电极、对电极和参比电极；在所述工作电极上修饰有功能层，所述功能层由氨基化石墨烯量子点与空心金纳米球复合而成；在所述功能层上还修饰有壳聚糖固定的葡萄糖氧化酶。2.根据权利要求1所述的可体外检测的柔性酶葡萄糖传感器，其特征在于：所述功能层是首先在工作电极表面滴涂氨基化石墨烯量子点溶液，再滴涂空心金纳米球溶液，从而获得。3.根据权利要求1所述的可体外检测的柔性酶葡萄糖传感器，其特征在于：所述壳聚糖固定的葡萄糖氧化酶是通过在功能层上滴涂葡萄糖氧化酶与壳聚糖的混合溶液而形成。4.根据权利要求1所述的可体外检测的柔性酶葡萄糖传感器，其特征在于：所述柔性基底采用聚对苯二甲酸乙二醇酯pet。5.根据权利要求1所述的可体外检测的柔性酶葡萄糖传感器，其特征在于：所述对电极和所述工作电极通过在柔性基底上印刷导电碳浆而形成，所述参比电极通过在柔性基底上印刷导电银浆而形成。6.根据权利要求2所述的可体外检测的柔性酶葡萄糖传感器，其特征在于：所述氨基化石墨烯量子点溶液的浓度为1～6mg/ml。7.根据权利要求3所述的可体外检测的柔性酶葡萄糖传感器，其特征在于：所述葡萄糖氧化酶与壳聚糖的混合溶液是将葡萄糖氧化酶加入到壳聚糖溶液中并超声分散均匀而获得；所述壳聚糖溶液的ph值在4.2～6.3之间、质量浓度为0.1～1.0％，所得混合溶液中葡萄糖氧化酶的浓度为15～30mg/ml。

技术总结
本发明公开了一种可体外检测的柔性酶葡萄糖传感器，其包括柔性基底和配置在柔性基底上的电极系统，电极系统包括工作电极、对电极和参比电极，在工作电极上修饰有由氨基化石墨烯量子点与空心金纳米球复合而成的功能层，在功能层上还修饰有壳聚糖固定的葡萄糖氧化酶。本发明的传感器在50μM～1.4mM范围有良好的线性关系，具有灵敏度高、稳定性好的优势，可用于尿糖的检测。于尿糖的检测。于尿糖的检测。


技术研发人员：徐颖 潘婷 周永康 陈鹏鹏 曾少华 聂王焰 周艺峰
受保护的技术使用者：安徽大学
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/10/5