一种广谱中和新冠病毒Omicron亚变种的全人源双特异性抗体

一种广谱中和新冠病毒omicron亚变种的全人源双特异性抗体
技术领域
1.本发明公开了一种双特异性抗体，属于多肽技术领域。


背景技术：

2.新型冠状病毒是一种具有囊膜的单链正义rna病毒，其基因组在复制过程中可以通过多种机制发生突变，进化速率极快。从2019年爆发至今，新的变异株不断出现，导致疫情反复，感染人数持续上升。目前在全球大规模传播的omicron变异株具有传染性强、传播速度快、免疫逃逸能力强等特点，且该变异株持续进化，演变出ba.5、bf.7、xbb、xbb.1.5、xbb.1.16等多种亚变种，这些变异株的传播使再感染和突破性感染的风险剧增，给全球的抗疫工作带来了极大挑战。
3.在疫情防控过程中，治疗性抗体药物做出了重要贡献，再生元、礼来、葛兰素史克、阿斯利康等大型药企研发的单抗药物或单抗联用的鸡尾酒疗法，都曾获得美国fda紧急使用授权用于预防和临床治疗。然而，病毒的持续适应性进化已削弱了现有疫苗的功效并逃避几乎所有已开发的中和单抗。因而亟需研制能提供广谱保护效果的新一代中和抗体药物。
4.双特异性抗体是一种新颖的抗体药物模式，将两种特异性抗体整合在一个分子中，表现出不同于单个抗体的独特性质。相对于单一单抗、抗体鸡尾酒等策略，双特异抗体具有以下优势：（1）鸡尾酒疗法需要单独生产两种抗体，而双特异性抗体只需要生产一种，生产成本低，临床前及临床开发更加便利；（2）igg-(scfv)2形式的双抗具有四价抗原结合能力，对病毒的中和活性有所提高，特别是集成具有协同效应的两株中和抗体，其中和活性具有“1+1》2”的协同效应；（3）集合两株单抗的不同结合表位，能够耐受更多的病毒抗原位点突变，并能够降低治疗过程中病毒逃逸突变出现的概率，这对于临床治疗具有重要意义。因而开发一种经济且高效的双特异性抗体药物迫在眉睫。
5.双特异性抗体是在自然状态下不存在，只能通过人工制备。经过多年的研究及技术发展，双特异性抗体在结构上出现了许多不同的设计策略。按照其是否含有fc功能区，主要分为2类:含有fc区的全长双抗和不含fc区的片段双抗。全长双抗的特点是保留了fc区，fc区可以提供体内更长时间的半衰期和稳定性，而且有fc区的抗体更便于纯化。另外，fc区可以介导一些免疫相关功能，比如抗体依赖性细胞毒性（adcc）、抗体依赖性细胞吞噬作用（adcp）或补体依赖性细胞毒性（cdc）。含有fc区的全长双特异性抗体有knobs-into
ꢀ‑
holes，crossmab，dvd-ig，igg-(scfv)2等形式。与传统抗体相比，片段双抗由于缺乏fc，尺寸比较小，一般只有50 kda，组织的渗透性会更优，在实体瘤治疗方面有一定优势。目前，此类双特异性抗体主要有bi-nanobody， bite，dart，tandabs等。
6.本发明的目的是构建一种新的抗新型冠状病毒变异株的双特异性抗体以应对持续的病毒免疫逃逸，为抵御目前流行的具有强逃逸能力的以及未来可能出现的新冠变异株提供候选药物。


技术实现要素：

7.基于上述目的，本发明拟在抗新型冠状病毒单克隆抗体的基础上，将筛选到的对新冠病毒野生型及delta、ba.2、ba.2.75、ba.2.76等变异株具有强效中和作用的单抗h4d12(中国专利申请cn202211732654.4)，以及对alpha、beta、gamma、delta、ba.1等变异株具有强效中和作用的单抗zw2g10(中国专利申请cn202210023619.9)作为亲本单抗，利用h4d12和zw2g10抗体不同表位的特性，构建一种抗新型冠状病毒变异株的全人源双特异性抗体。
8.本发明首先提供了一种抗新型冠状病毒变异株的全人源双特异性抗体，所述双特异性抗体由两条多肽链和两条单克隆抗体轻链组成，其中，所述“多肽链”被定义为由一个单克隆抗体重链和一个单链抗体串联而成，所述单克隆抗体重链和所述单克隆抗体轻链来自于同一个母本单克隆抗体，在本发明的双特异性抗体中，来自于同一个母本单克隆抗体的单克隆抗体重链和单克隆抗体轻链构成第一抗原识别区。本发明中所述的单链抗体是指由抗体重链可变区和轻链可变区串联而成的单价抗体形式；在本发明的双特异性抗体中，单链抗体重链可变区和单链抗体轻链可变区构成第二抗原识别区；在本发明的一个完整双特异性抗体共包括两个第一抗原识别区和两个第二抗原识别区。
9.根据本发明提供的技术方案，所述单克隆抗体重链的可变区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.1的第26-33、51-58 和97-114位氨基酸序列所示，所述单克隆抗体轻链的可变区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.3的第27-32、50-52 和89-96位氨基酸序列所示，所述单链抗体的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.1的第495-502、520-527和566-586位氨基酸序列所示，所述单链抗体轻链的可变区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.1的第637-645、663-665 和702-712位氨基酸序列所示。
10.在本发明的设计方案中，所述单克隆抗体重链和单克隆抗体轻链来自于亲本单抗h4d12，构成本发明双特异性抗体的第一抗原识别区，因此，在本发明中，所述“单克隆抗体重链”均是指亲本单抗h4d12的重链，所述“单克隆抗体轻链”均是指亲本单抗h4d12的轻链。所述单链抗体重链可变区和单链抗体轻链可变区来自于亲本单抗zw2g10，构成本发明双特异性抗体的第二抗原识别区，因此，在本发明中，所述“单链抗体重链”均是指亲本单抗zw2g10的重链，所述“单链抗体轻链”均是指亲本单抗zw2g10的轻链。前期的抗体竞争实验结果显示，h4d12和zw2g10识别新冠病毒rbd区域的不同表位。如本领域技术常识所教导，抗体重链和轻链的可变区负责和抗原的结合，其中可变区的高变区（又称为抗体分子的互补决定区，cdr）构成了抗体分子的抗原结合点，在本发明的技术方案中，所述双特异抗体以上述4套cdr区，即，来自于h4d12的单克隆抗体重链可变区cdr1、cdr2、cdr3和单克隆抗体轻链可变区cdr1、cdr2、cdr3构成识别新冠病毒rbd区域的两个第一抗原识别区；来自于zw2g10的单链抗体重链可变区cdr1、cdr2、cdr3和单链抗体轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3构成识别新冠病毒rbd区域的两个第二抗原识别区。
11.在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体重链的可变区的氨基酸序列如seq id no.1的第1-125位氨基酸序列所示，所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.3的第1-107位氨基酸序列所示，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.1的第470-597位氨基酸序列所示，所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.1的612-722位氨基酸序列所示。
h-2g10对omicron不同亚变种假病毒具有更加广谱高效的中和活性，使其发展成一种抵御当前和未来流行新冠变异株的强效抗体药物成为可能。
附图说明
22.图1 本发明双特异性抗体结构示意图；图2双特异性抗体纯化的sds-page图谱； 图3 elisa检测4d12-h-2g10的交叉结合活性； 图4 抗体对ba.1假病毒的中和活性； 图5 抗体对ba.2假病毒的中和活性； 图6 抗体对ba.2.75假病毒的中和活性； 图7 抗体对ba.2.76假病毒的中和活性； 图8 抗体对ba.3假病毒的中和活性； 图9 抗体对ba.4假病毒的中和活性； 图10 抗体对ba.4.6假病毒的中和活性； 图11 抗体对bf.7假病毒的中和活性； 图12 抗体对xbb.1.5假病毒的中和活性； 图13 抗体对xbb.1.16假病毒的中和活性。
实施方式
23.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
24.实施例1. 双特异性抗体的构建 前期我们通过流式分选-单细胞pcr技术从重组新型冠状病毒疫苗接种者的记忆b细胞中获得具有优异广谱中和活性的全人源单抗h4d12和zw2g10，分别以sars-cov-2的s蛋白rbd结构域的不同表位为靶点，其中h4d12对新冠病毒野生型及其delta、ba.2、ba.2.75、ba.2.76等变异株具有强效中和作用，ic
50
均低于10 ng/ml (见中国专利申请cn202211732654.4), zw2g10对alpha、beta、gamma、delta、ba.1等变异株具有强效中和作用, ic
50
均低于100 ng/ml (中国专利zl202210023619.9)。
25.根据文献采用ggggsggggsgggg linker将zw2g10的vh和vl连接构建zw2g10的scfv，之后用同样的linker将zw2g10的scfv连接至h4d12 重链的c端，构建关键图谱如下： xbai 酶切位点-gccgccacc-信号肽
‑ꢀ
h4d12 vh+ch
‑ꢀ
linker
‑ꢀ
zw2g10 vh
‑ꢀ
linker
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zw2g10 vl-终止密码子-bamh i 酶切位点，合成目的序列并通过xbai 和bamh i 连入pcdna3.4表达载体，基因合成及4d12-h-2g10重链重组表达质粒的构建由通用生物（安徽）公司完成，之后将该质粒与h4d12的轻链表达质粒共同转染至expi293f细胞，表达4d12-h-2g10双特异性抗体。图1给出了本发明双特异性抗体结构示意图，其是一种igg-(scfv)2形式的双特异性抗体，即，将来源于亲本单抗zw2g10的单链抗体(scfv)连接在来源于正常结构的亲本单抗igg抗体分子h4d12的fc功能区的c末端，通过分子两端的cdr区与靶分子结合实现双特异性识别。
26.实施例2. 双特异性抗体的瞬时表达和亲和层析纯化 使用expi293 表达系统，取50 μg重链和50 μg轻链混合后转染100 ml expi 293f细胞，按说明书（thermofisher scientific，a14635）操作，5-6天后收获培养液，离心后上清约30 ml，使用体积为5 ml的预装protein g亲和层析柱，上样前用20 mm pbs平衡，待电导到基线后进样，上样结束后，使用20 mm pbs洗涤色谱柱至基线平稳，使用0.1 m ph 2.7的甘氨酸缓冲液洗脱目的蛋白，待od
280
近基线后，停止收集。
27.结果：sds-page检测亲和层析纯化的双特异性抗体，具体见图2，泳道1、2、3分别为4d12-h-2g10的柱前、柱后以及洗脱液的条带，蛋白样品可被巯基乙醇还原为75 kda、25 kda大小的两个片段，分别对应抗体重链和轻链的理论分子量，符合预期。泳道m为分子量标记。
28.实施例3. 双特异性抗体的交叉结合活性鉴定 1. 包被：实验前一天96孔酶联板，取omicron亚变种ba.1 s-ecd抗原(acro，spn-c522a)、ba.2 s-ecd抗原(acro，spn-c522b)、ba.2.75 s-ecd抗原(acro，spn-c522f)、ba.2.76 s-ecd抗原(acro，spn-c522i)、ba.3 s-ecd抗原(acro，spn-c522c)、ba.4 s-ecd抗原(acro，spn-c5229)、ba.4.6 s-ecd抗原(acro，spn-c522m)、bf.7 s-ecd抗原(acro，spn-c522q)、xbb s-ecd抗原(acro，spn-c5248)和xbb.1.5抗原(acro，spn-c524i)用包被液稀释至2 μg/ml，包被酶标板，每孔100 μl，4℃包被过夜。
29.2. 封闭：用洗板机（bio-tek，405_ls）洗3次，每孔加入100
ꢀµ
l封闭液，37℃ 孵育1 h。
30.3. 样品孵育：洗板3次，除首孔外，每孔加入100 μl稀释液，将抗体稀释至首孔1 μg/ml，4倍梯度稀释，100 μl/孔，每个抗体设置三个复孔，在37℃孵育1 h。
31.4. 二抗孵育：洗板3次，将hpr标记的羊抗人igg二抗（abcam，ab97225）用稀释液以1:10000进行稀释，每孔100
ꢀµ
l加入到elisa板对应孔中，37℃ 孵育1 h。
32.5. 显色：洗板3次，每孔加入100
ꢀµ
l的tmb单组份显色液，显色6 min，室温避光，之后每孔加入50
ꢀµ
l终止液终止反应。
33.6. 用酶标仪上检测450-630 nm处的od值，使用logistic四参数拟合绘制曲线，并计算抗体的ec
50
值。
34.结果：双特异性抗体与omicron亚变种s蛋白的结合活性见图3， 4d12-h-2g10与ba.1、ba.2、ba.2.75、ba.2.76、ba.3、ba.4、ba.4.6、bf.7、xbb、xbb.1.5的s-ecd蛋白均能强效结合，ec
50
分别为23 ng/ml、15 ng/ml、17 ng/ml、17 ng/ml、13 ng/ml、22 ng/ml、25 ng/ml、48 ng/ml、37 ng/ml、21 ng/ ml,而两株亲本单抗则不能实现与上述omicron亚变种s蛋白的全部结合。相比于亲本单抗，双特异性抗体4d12-h-2g10具有更加广谱的结合活性。
35.实施例4. 双特异性抗体的假病毒中和活性鉴定 1. 将纯化的双特异性抗体用培养基 dmem+10% fbs 自初始浓度3倍系列稀释，加入96孔培养板，设置3个复孔，体积50 μl/孔；随即每孔加入50 μl新冠病毒变异株的假病毒悬液（用dmem+10% fbs稀释病毒至合适滴度），充分混匀，另设置存活对照（不加病毒和抗体）和死亡对照（只加病毒），置37℃ 5% co2细胞培养箱孵育 1 h。
36.2. 将hek293t细胞用0.25%的胰酶消化后，用培养基（dmem+10% fbs）稀释至2.5
×
105cells/ml 浓度，接种到 96 孔细胞培养板中，接种体积 100 μl/孔，置 37℃ 5% co
2 细
胞培养箱培养过夜。
37.3. 48 h后弃100 μl细胞培养上清，加入100 μl显色底物，避光孵育2 min。吸取150 μl转移到96孔白色微孔板，利用tecan spark多功能微孔板检测仪读取luciferase信号值。
38.4. 用[1
‑ꢀ
(样本-存活对照组信号) / (死亡对照组信号-存活对照组信号)]
ꢀ×ꢀ
100%计算抗体中和率，用 graphpad prism 8 拟合曲线，计算抗体ic
50 值。
[0039]
结果：图4-13分别是4d12-h-2g10与ba.1、ba.2、ba.2.75、ba.2.76、ba.3、ba.4、ba.4.6、bf.7、xbb.1.5和xbb.1.16的假病毒中和活性随浓度变化的曲线图，双特异性抗体4d12-h-2g10中和ba.1假病毒的ic
50
是1 ng/ml，中和ba.2假病毒的ic
50
是14 ng/ml，中和ba.2.75假病毒的ic
50
是2 ng/ml，中和ba.2.76假病毒的ic
50
是1 ng/ml，中和ba.3假病毒的ic
50
是54 ng/ml，中和ba.4假病毒的ic
50
是5 ng/ml，中和ba.4.6假病毒的ic
50
是11 ng/ml，中和bf.7假病毒的ic
50
是5 ng/ml，中和xbb.1.5假病毒的ic
50
是2 ng/ml，中和xbb.1.16假病毒的ic
50
是2 ng/ml。结果显示相较于亲本单抗，双特异性抗体4d12-h-2g10对omicron不同亚变种假病毒具有更加广谱高效的中和活性。

技术特征：
1. 一种抗新型冠状病毒变异株的全人源双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体由两条多肽链和两条单克隆抗体轻链组成，其中，每条多肽链由一个单克隆抗体重链和一个单链抗体串联而成，所述单克隆抗体重链和所述单克隆抗体轻链来自于同一个母本单克隆抗体，所述单克隆抗体重链的可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.1的第26-33、51-58 和97-114位氨基酸序列所示，所述单克隆抗体轻链的可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.3的第27-32、50-52 和89-96位氨基酸序列所示，所述单链抗体的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.1的第495-502、520-527和566-586位氨基酸序列所示，所述单链抗体轻链的可变区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.1的第637-645、663-665 和702-712位氨基酸序列所示。2. 根据权利要求1所述的特异性抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链的可变区的氨基酸序列如seq id no.1的第1-125位氨基酸序列所示，所述单克隆抗体轻链的可变区的氨基酸序列如seq id no.3的第1-107位氨基酸序列所示，所述单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no.1的第470-597位氨基酸序列所示，所述单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.1的612-722位氨基酸序列所示。3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链的恒定区氨基酸序列如seq id no.1的第126-455位氨基酸序列所示，所述单克隆抗体轻链的恒定区氨基酸序列如seq id no.3的第108-213位氨基酸序列所示。4.根据权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链和所述单链抗体之间，和/或，所述单链抗体重链的可变区和所述单链抗体轻链的可变区之间以柔性连接肽连接。5.根据权利要求5所述的双特异性抗体，其特征在于，所述柔性连接肽的氨基酸序列如456-469位氨基酸序列所示。6. 根据权利要求5所述的双特异性抗体，其特征在于，所述多肽链的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述单克隆抗体轻链的氨基酸序列如seq id no.3所示。7. 一种编码权利要求6所述双特异性抗体的多核苷酸，其特征在于，所述多肽链的多核苷酸的序列如seq id no.2所示，所述单克隆抗体轻链的多核苷酸的序列如seq id no.4所示。8.一种含有权利要求7所述多核苷酸的表达载体。9.一种含有权利要求8所述表达载体的宿主细胞。10.权利要求1-6任一所述的双特异性抗体在制备新型冠状病毒治疗药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种可以抗新冠病毒的全人源双特异性中和抗体，其由两株新冠病毒全人源中和性抗体改构而成。所述抗体能够有效中和目前流行的具有强逃逸能力的Omicron亚变种BF.7、BA.4、XBB.1.5和XBB.1.16。相较于亲本单抗，本发明公开的双特异性抗体具有更强的抗病毒活性和抑制逃逸突变的能力，是治疗和预防重症新冠的一种可行而有效的策略，有潜力成为干预新冠的候选药物。预新冠的候选药物。预新冠的候选药物。


技术研发人员：陈薇 于长明 迟象阳 孙韩聪 张冠英 李建民 范鹏飞 房婷 黄平 侯利华 陈郑珊 陈旖
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/10/5