一种治疗增生性瘢痕的工程化改造外泌体及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于基因工程和生物治疗药物技术领域，具体涉及一种治疗增生性瘢痕的工程化改造外泌体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.外泌体是通过细胞旁分泌来介导细胞之间相互通讯的一种载体。它是具有双层膜结构的纳米级的细胞外囊泡，其内包裹有蛋白质、dna、mrna和非编码rna等多种活性成分，可通过被其他细胞摄入进而影响该细胞的生物学功能。因此在基于外泌体的治疗领域，外泌体可作为一种药物或治疗分子的载体，将其内容物运送至靶细胞内，调控靶细胞的生物学功能从而达到治疗目的。但目前缺乏一种可用于治疗增生性瘢痕的外泌体。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种治疗增生性瘢痕的工程化改造外泌体及其制备方法和应用。本发明所述外泌体能够显著抑制增生性瘢痕形成。
4.本发明提供了一种治疗增生性瘢痕的工程化改造外泌体，所述工程化改造外泌体为过表达mir-141-3p的间充质干细胞外泌体。
5.本发明还提供了上述技术方案所述治疗增生性瘢痕的工程化改造外泌体的制备方法，包括以下步骤：
6.将mir-141-3p过表达慢病毒感染间充质干细胞，筛选获得稳转细胞系；对所述稳转细胞系进行扩增培养，提取外泌体，获得治疗增生性瘢痕的工程化改造外泌体。
7.优选的是，所述mir-141-3p过表达慢病毒由lv3载体包装而成。
8.优选的是，所述感染的时间为20～24h。
9.优选的是，所述筛选的方法包括使用嘌呤霉素筛选转染成功的干细胞。
10.优选的是，所述扩增培养用培养基包括干细胞专用无血清培养基。
11.优选的是，所述提取外泌体包括以下步骤：
12.收集细胞上清，低速离心取上清，进行超滤膜过滤，滤液进行超速离心，取沉淀，得到外泌体。
13.优选的是，所述低速离心的转速为2000g，所述低速离心的时间为10min；所述超滤膜的孔径为0.22μm。
14.优选的是，所述超速离心的转速为100000g，所述超速离心的时间为75min。
15.本发明还提供了所述治疗增生性瘢痕的工程化改造外泌体或上述技术方案所述工程化改造外泌体在制备治疗增生性瘢痕的药物中的应用。
16.本发明提供了一种治疗增生性瘢痕的工程化改造外泌体。本发明所述工程化改造外泌体能够过表达mir-141-3p，显著抑制增生性瘢痕形成。本发明通过使用外泌体装载更多的mir-141-3p运输至瘢痕组织，作用于创面组织内的细胞，能够更好地发挥特异性调控
作用，抑制增生性瘢痕，且本发明外泌体质量稳定，无组织排斥性，无毒性，适合大规模提取，具有强大的临床潜在应用价值，这为将来治疗创伤后增生性瘢痕患者提供了一种新的策略。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1为本发明实施例2中提供的工程化干细胞外泌体的纳米粒子分析图；
19.图2为本发明实施例2中提供的工程化干细胞外泌体的透射电镜图；
20.图3为本发明实施例2中提供的工程化干细胞外泌体的表面特异标记蛋白表达情况结果图；
21.图4为本发明实施例2中提供的干细胞、转染了过表达mir-141-3p慢病毒载体的干细胞、以及对应的外泌体内mir-141-3p的表达水平结果图；
22.图5为本发明实施例3中提供的兔耳增生性瘢痕图；
23.图6为本发明实施例3中提供的各组创面组织h&e染色图。
具体实施方式
24.本发明提供了一种治疗增生性瘢痕的工程化改造外泌体，所述工程化改造外泌体为过表达mir-141-3p的间充质干细胞外泌体。本发明所述工程化改造外泌体作用于创面组织内的细胞，能够高效地发挥特异性调控作用，抑制增生性瘢痕，且本发明外泌体质量稳定，无组织排斥性，无毒性，适合大规模提取，具有强大的临床潜在应用价值。
25.本发明还提供了上述技术方案所述治疗增生性瘢痕的工程化改造外泌体的制备方法，包括以下步骤：
26.将mir-141-3p过表达慢病毒感染间充质干细胞，筛选获得稳转细胞系；对所述稳转细胞系进行扩增培养，提取外泌体，获得治疗增生性瘢痕的工程化改造外泌体。
27.本发明将mir-141-3p过表达慢病毒感染间充质干细胞，筛选获得稳转细胞系。在本发明中，所述mir-141-3p过表达慢病毒优选由lv3载体包装而成。在本发明中，所述lv3载体优选为lv3(h1/gfp&puro,吉玛基因)载体。在本发明中，所述感染的时间优选为20～24h。在本发明中，所述间充质干细胞优选为人脂肪间充质干细胞。本发明通过基因工程编辑，使外泌体过表达mir-141-3p后，治疗增生性瘢痕的效果更好。在本发明中，所述筛选的方法包括使用嘌呤霉素筛选转染成功的干细胞。具体的，本发明所述筛选的方法优选包括使用含有嘌呤霉素的培养基进行药物筛选。本发明优选筛选2周后得到稳定表达mir-141-3p的细胞系。
28.得到稳转细胞系后，本发明对所述稳转细胞系进行扩增培养。在本发明中，所述扩增培养用培养基优选为干细胞专用无血清培养基。
29.进行扩增培养后，本发明提取外泌体，获得治疗增生性瘢痕的工程化改造外泌体。在本发明中，所述提取外泌体优选包括以下步骤：收集细胞上清，低速离心取上清，进行超
滤膜过滤，滤液进行超速离心，取沉淀，得到外泌体。
30.在本发明中，所述低速离心的转速优选为2000g，所述低速离心的时间优选为10min。在本发明中，所述低速离心的目的为去除大分子物质。在本发明中，所述超滤膜的孔径优选为0.22μm，因为该孔径的过滤膜可以去掉细胞上清中各种杂质、悬浮颗粒、沉淀物、微生物(细菌、病毒等)，为后续外泌体的获取提供可靠的过滤和除菌。在本发明中，所述超速离心的转速优选为100000g，所述超速离心的时间优选为75min。本发明中，取沉淀后，优选对沉淀进行洗涤。在本发明中，所述洗涤优选包括重悬，离心。具体的，本发明所述重悬优选使用无菌pbs缓冲液重悬。所述离心优选包括100000g离心75min。离心后，所得沉淀即为洗涤后的外泌体。
31.本发明所述制备方法不同于电转染等方式，能够更好的保持外泌体的完整性，同时上调其内的效用分子。本发明用过表达mir-141-3p的慢病毒转染间充质干细胞，使提取的外泌体负载更多的效用分子(mir-141-3p)，提高外泌体中有效成分的含量，相同剂量的外泌体发挥更强的治疗作用，进而特异性的抑制增生性瘢痕的形成。另一方面本发明提取外泌体的方法简便，适合大规模生产，并且获得的外泌体具有良好生物相容性。因此本发明具有广阔的临床应用前景，为治疗增生性瘢痕提供了一种新颖的策略。
32.本发明还提供了所述治疗增生性瘢痕的工程化改造外泌体或上述技术方案所述工程化改造外泌体在制备治疗增生性瘢痕的药物中的应用。
33.本发明在进行所述应用前，优选对工程化改造外泌体进行鉴定。在本发明中，所述鉴定优选包括以下步骤：
34.(1)纳米粒子分析系统检测外泌体的浓度和粒径；
35.(2)透射电镜观察外泌体的形态，拍照和记录；
36.(3)提取外泌体总蛋白后，使用westernblot实验检测外泌体的表面特异性标志物：cd63、cd9、tsg101和calnexin；
37.(4)提取外泌体总rna，使用qrt-pcr检测mir-141-3p在工程化外泌体内的表达水平变化。
38.本发明优选选取粒径均值和峰值都集中分布在50～150nm区间，透射电镜下呈双层膜样结构，整体外貌呈球形或杯状，且表达cd63、cd9、tsg101而不表达calnexin的外泌体进行后续应用。
39.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种治疗增生性瘢痕的工程化改造外泌体及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
40.实施例1
41.一种过表达mir-141-3p的工程化改造外泌体，所述外泌体能够用于治疗增生性瘢痕。
42.使用lv3(h1/gfp&puro,吉玛基因)载体委托吉玛基因公司包装构建mir-141-3p(序列：5
’‑
taacactgtctggtaaagatgg-3’，seq id no.1)过表达慢病毒。
43.将慢病毒加入干细胞专用无血清培养基(友康，中国)中转染人脂肪间充质干细胞(中国科学院细胞库)，48h后更换成含有嘌呤霉素的干细胞专用无血清培养基培养基进行药物筛选培养，2周后获取稳定表达mir-141-3p的细胞系。
44.使用干细胞专用无血清培养基扩增培养稳转细胞系，待细胞生长至80％左右融合度，收集细胞培养上清，2000g低速离心10min，去除大分子物质如细胞碎片和死细胞等，继续收集上清。
45.使用厚度为0.22μm的超滤膜对上清进行过滤，收集滤液，然后100000g超速离心75min，弃上清。使用无菌pbs重悬外泌体，再次超速离心，转速为100000g，时间为75min。最后沉淀用无菌pbs重悬，即外泌体制剂。可现用或者冻存以备后期使用。
46.实施例2
47.对实施例1获得的外泌体制剂进行鉴定：
48.(1)纳米粒子分析系统检测外泌体的浓度和粒径，其中对照组外泌体命名为mir-141-3p
nc-exos(该外泌体制备过程使用mir-141-3p对照的慢病毒lv3-nc(序列5
’‑
ttctccgaacgtgtcacgt-3’)实施转染步骤，其余操作与实施例1相同)，过表达mir-141-3p的外泌体命名为mir-141-3p
oe-exos。见图1(工程化干细胞外泌体的纳米粒子分析图，其中，左图为mir-141-3p
nc-exos组nta检测结果图，右图为mir-141-3p
oe-exos组nta检测结果图)；由图1可知，两组工程化外泌体的粒径均值和峰值都集中分布在50～150nm区间，组间无明显差异，符合外泌体的粒径分布特征。
49.(2)透射电镜观察外泌体的形态，拍照和记录，见图2(工程化干细胞外泌体的透射电镜图，其中，左图为mir-141-3p
oe-exos组透射电镜视图，右图为mir-141-3p
nc-exos组透射电镜视图)，由图2可知，两组外泌体均具有外泌体的经典双层膜样结构，整体外貌呈球形或杯状，两组间的直径亦未见明显差异。
50.(3)提取人脂肪间充质干细胞(hadscs)、mir-141-3p
nc-exos和mir-141-3p
oe-exos的总蛋白后，使用bca试剂盒检测蛋白浓度，使用western blot实验，配制10％浓度胶，上样后进行蛋白电泳、转膜、封闭和一二抗孵育，最后使用化学发光成像分析法进行曝光拍照，检测外泌体的表面特异性标志蛋白如cd63、cd9、tsg101和细胞标志蛋白calnexin在人脂肪充质干细胞的细胞裂解蛋白(celllysis组)和工程化外泌体中的表达水平，见图3(工程化干细胞外泌体的表面特异标记蛋白表达情况结果图)，根据图3可知，mir-141-3p
nc-exos和mir-141-3p
oe-exos均有表达外泌体的标志蛋白cd63、cd9、tsg101，calnexin则在hadscs组表达说明实验操作正确，表明所提取的mir-141-3p
nc-exos和mir-141-3p
oe-exos属于外泌体；
51.(4)提取工程化外泌体的总rna后，使用qrt-pcr检测工程化外泌体内mir-141-3p的表达水平。结果见图4(干细胞、转染了过表达mir-141-3p慢病毒载体的干细胞、以及相应的外泌体内mir-141-3p的表达水平结果图)，由图4可知，mir-141-3p
oe-exos与对照组中的mir-141-3p
nc-exos相比，mir-141-3p在mir-141-3p
oe-exos中高表达，差异有统计学意义(p《0.001)。提示mir-141-3p可被装载进入外泌体中。
52.实施例3
53.本实施例基于实施例1所述操作方法，在完成实施例2并通过鉴定合格(粒径均值和峰值都集中分布在50～150nm区间，透射电镜下呈双层膜样结构，整体外貌呈球形或杯状，且表达cd63、cd9、tsg101而不表达calnexin)后，进行工程化外泌体制剂对兔耳增生性疤痕治疗对照试验，具体步骤如下：
54.在兔耳增生性瘢痕模型建立上，选取性别相同，2～2.5kg，体重相近的健康新西兰
大白兔(购自北京科宇动物养殖中心)12只，随机分成四组，每组3只，每只兔子有8个瘢痕病损，故每组有24个瘢痕病损，即本发明每组进行了24次重复性实验(4个观察时间点，每个时间点是6次重复)。用鹿眠灵肌肉注射麻醉兔子，使用电推剪对其耳部进行脱毛处理。随后消毒铺巾，在无菌环境下，在每个兔耳腹侧面皮肤制造直径约10mm的4个圆形创面。
55.造模21天后在原创面愈合部位形成表面隆起、暗红色、质地坚硬、增厚的瘢痕组织表明瘢痕模型构建成功，工程化外泌体治疗组每周在创面四周皮下分4个点(0点、3点、6点和9点方向)进行工程化外泌体mir-141-3p
oe-exos注射，共100μl，每处25μl，共3周。对照组采用相同注射方法，外泌体则用替mir-141-3p
nc-exos。
56.治疗后每天观察瘢痕情况，每次治疗一周后安乐死兔子并取下瘢痕组织，在多聚甲醛中固定后制作成石蜡组织切片，进行组织染色来评估增生性瘢痕情况。
57.使用工程化干细胞外泌体治疗兔耳增生性瘢痕模型的效果评估分析结果如图5、图6所示，图5为兔耳增生性瘢痕图，图6为各组创面组织h&e染色图。由图5可知，术后第21天，所有伤口完全上皮化，并成功构建凸起和深红色外观的兔耳增生性瘢痕。与mir-141-3p
nc-exos组相比，mir-141-3p
oe-exos治疗组在三次给药后疤痕组织的表面更平坦，颜色更浅。
58.h&e染色如图6所示，瘢痕形成后mir-141-3p
oe-exos组比mir-141-3p
nc-exos组表现出更平坦的真皮和更对齐的成纤维细胞。结合图5、图6的结果，mir-141-3p
oe-exos组比mir-141-3p
nc-exos组具有更优越的抑制增生性瘢痕的功能。
59.尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种治疗增生性瘢痕的工程化改造外泌体，其特征在于，所述工程化改造外泌体为过表达mir-141-3p的间充质干细胞外泌体。2.权利要求1所述治疗增生性瘢痕的工程化改造外泌体的制备方法，包括以下步骤：将mir-141-3p过表达慢病毒感染间充质干细胞，筛选获得稳转细胞系；对所述稳转细胞系进行扩增培养，提取外泌体，获得治疗增生性瘢痕的工程化改造外泌体。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述mir-141-3p过表达慢病毒由lv3载体包装而成。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述感染的时间为20～24h。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述筛选的方法包括使用嘌呤霉素筛选转染成功的干细胞。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述扩增培养用培养基包括干细胞专用无血清培养基。7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述提取外泌体包括以下步骤：收集细胞上清，低速离心取上清，进行超滤膜过滤，滤液进行超速离心，取沉淀，得到外泌体。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述低速离心的转速为2000g，所述低速离心的时间为10min；所述超滤膜的孔径为0.22μm。9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述超速离心的转速为100000g，所述超速离心的时间为75min。10.权利要求1所述治疗增生性瘢痕的工程化改造外泌体或权利要求2～9任一项所述工程化改造外泌体在制备治疗增生性瘢痕的药物中的应用。

技术总结
本发明属于基因工程和生物治疗药物，涉及一种治疗增生性瘢痕的工程化改造外泌体及其制备方法和应用。本发明所述治疗增生性瘢痕的工程化改造外泌体为过表达miR-141-3p的间充质干细胞外泌体。本发明所述外泌体能够显著减少增生性瘢痕的形成。少增生性瘢痕的形成。少增生性瘢痕的形成。


技术研发人员：张翠萍 孟升 马奎 刘熹 付小兵
受保护的技术使用者：中国人民解放军总医院
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/10/5